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Artigo de método

Modificação química do resíduo de triptofano em um recombinante Ca2+-ATPase N-domínio para estudar triptofano-ANS FRET

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DOI:

10.3791/62770

⸱

9 de outubro de 2021

 , 
1Instituto de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí

Neste artigo

Resumo

O ANS se liga ao domínio N recombinante Ca2+-ATPase. Os espectros de fluorescência exibem um padrão semelhante ao FRET após a excitação em um comprimento de onda de 295 nm. A modificação química mediada pelo NBS de Trp sacia a fluorescência do domínio N, o que leva à ausência de transferência de energia (FRET) entre o resíduo Trp e o ANS.

Resumo

O reticulum sarco/endoplasmático Ca2+-ATPase (SERCA) é um ATPase do tipo P que foi cristalizado em várias conformações. Informações funcionais detalhadas podem, no entanto, ser obtidas a partir de domínios recombinantes isolados. O domínio recombinante de ligação de nucleotídeo (domínio N) recombinante (Trp552Leu e Tyr587Trp) exibe fluorescência saciada na ligação de ligantes. Um fluoróforo extrínseco, ou seja, 8-anilino-1-naftalina sulfonato (ANS), liga-se ao local de ligação de nucleotídeos através de interações eletrostáticas e hidrofóbicas com resíduos de Arg, His, Ala, Leu e Phe. A vinculação ans é evidenciada pelo aumento da intensidade da fluorescência quando excitada em um comprimento de onda (λ) de 370 nm. No entanto, quando animado em λ de 295 nm, o aumento da intensidade de fluorescência parece estar acoplado à extinção da fluorescência intrínseca do domínio N. Os espectros de fluorescência exibem um padrão de transferência de energia de ressonância Föster (FRET) sugerindo assim a presença de um par Trp-ANS FRET, que parece ser suportado pela curta distância (~20 Å) entre Tyr587Trp e ANS. Este estudo descreve uma análise do par Trp-ANS FRET por modificação química Trp (e saciamento de fluorescência) que é mediada por N-bromosuccinimide (NBS). No domínio N quimicamente modificado, a fluorescência ANS aumentou quando excitada em um λ de 295 nm, semelhante a quando excitada em um λ de 370 nm. Assim, a modificação química mediada pelo NBS do resíduo Trp pode ser usada para sondar a ausência de FRET entre Trp e ANS. Na ausência de fluorescência trp, não se deve observar um aumento da fluorescência da ANS. A modificação química dos resíduos de Trp em proteínas pela NBS pode ser útil para examinar os resíduos de FRET que estão próximos ao ANS vinculado. Este ensaio provavelmente também será útil ao usar outros fluoroforos.

Introdução

A transferência de energia de ressonância föster (FRET) tornou-se uma técnica padrão para determinar a distância entre estruturas moleculares após a ligação ou interação em estudos de estrutura proteica e função1,2,3,4. Em ATPases tipo P, o FRET tem sido utilizado para investigar a estrutura e a função do ânticulum sarco-endoplasmático Ca2+-ATPase (SERCA)2,5,6,7,8, por exemplo, flutuações estruturais durante o ciclo catalítico foram analisadas em toda a proteína pelo FRET7.

Os doadores de FRET são diversos, e variam de pequenas moléculas fluorescentes (extrínsecas) a proteínas fluorescentes9,10. Os resíduos de triptofano (Trp) (devido à sua fluorescência) são úteis para identificar alterações estruturais nas sequências de aminoácidos proteicos11,12. A intensidade de fluorescência do Trp depende substancialmente da polaridade de seu ambiente circundante13,14. A ligação de ligante geralmente gera rearranjos estruturais em proteínas/enzimas15,16. Se o Trp estiver presente ou localizado próximo ao local de ligação proteica, as flutuações estruturais frequentemente afetam o grau de exposição de Trp à mídia aquosa13,14; assim, a mudança na polaridade resulta na saciedade da intensidade de fluorescência trp13,14. Assim, a propriedade fluorescente do Trp é útil para a realização de estudos de ligação de ligantes para enzimas. Outros fenômenos físicos também podem levar à fluorescência trp saciando17,18,19,20, por exemplo, FRET e mudanças na polaridade média. A transferência de energia do estado animado de Trp para um fluoróforo também tem aplicações potenciais, por exemplo, determinação de afinidade de pequenos ligantes em proteínas21. De fato, o Trp tem sido usado principalmente como doador de fluorescência em estudos de FRET em proteínas22,23,24, por exemplo, em estudos de terbium (Tb3+)FRET, um resíduo de Trp é usado frequentemente como antena para transferência de energia para Tb3+25,26,27. A Trp apresenta várias vantagens sobre outros doadores de FRET devido ao seu caráter constitutivo inerente à estrutura proteica, o que elimina a necessidade de processos preparatórios que possam afetar a função/estrutura da proteína estudada24. Assim, a identificação de decaimentos radiativos (transferência de energia e mudanças na polaridade média que são induzidas por rearranjos estruturais proteicos) é importante para tirar conclusões precisas sobre ligaduras em estudos estruturais proteicos13,14,19,28.

Em estudos estruturais proteicos, um fluoróforo extrínseco, ou seja, 8-anilino-1-naftalina sulfonato (ANS), tem sido usado principalmente em experimentos relacionados a dobra/desdobramento de proteínas28,29. A ANS se liga a proteínas/enzimas no estado nativo, geralmente nos locais de ligação dos substratos31,32,33; um aumento no rendimento quântico da fluorescência ans (ΦF) (ou seja, um aumento na intensidade da fluorescência) é induzido por excitar a proteína em λ=370 nm quando interações adequadas de ANS com Arg e Seus resíduos em bolsões hidrofóbicos ocorrem34,35,36,37. Em diversos estudos, foi relatada a ocorrência de FRET (quando excitante no λ dentro de 280-295 nm) entre resíduos de Trp (doadores) e ANS (aceitador), que se baseia no seguinte: 1) sobreposição do espectro de emissão de fluorescência de Trp e espectro de excitação da ANS, 2) identificação de uma distância adequada entre um ou mais resíduos Trp(s) e ANS para transferência de energia, 3) alto rendimento quântico ans quando ligado em bolsões de proteína, e 4) padrão de FRET característico no espectro de fluorescência da proteína na presença de ANS3,17,27,37,38.

Recentemente, a vinculação de ligantes ao domínio de ligação nucleotídea (n-domínio) em SERCA e outros ATPases do tipo P foram investigadas utilizando n-domínios recombinantes projetados40,41,42,43,44,45,46. A engenharia molecular do domínio N da SERCA tem sido usada para mover o único resíduo de Trp (Trp552Leu) para uma estrutura mais dinâmica (Tyr587Trp) que esteja próxima ao local de ligação de nucleotídeos, onde variações de fluorescência (saciamento) podem ser usadas para monitorar alterações estruturais na ligação34. Os resultados experimentais demonstraram que a ANS se liga (como ATP) ao local de ligação nucleotídea no recombinante purificado SERCA N-domínio34. Curiosamente, a fluorescência ANS aumenta ao vincular-se ao domínio N após a excitação a um λ de 295 nm, enquanto a fluorescência intrínseca do domínio N diminui34, produzindo assim um padrão FRET que sugere a formação de um par Trp-ANS FRET.

O uso de NBS foi proposto para determinar o conteúdo de resíduos de Trp em proteínas47 por ensaio de absorvância de proteínas modificadas. NBS modifica o grupo indol altamente absorvente de Trp para o oxindole menos absorvente47,48. Isso resulta na perda (saciamento) da propriedade fluorescente Trp40. Assim, a modificação química mediada pelo NBS de resíduos de Trp pode ser usada como ensaio para definir o papel do Trp (como doador) quando o FRET é hipótese.

Este protocolo descreve a modificação química do único resíduo de Trp por NBS no recombinante N-domínio da SERCA como modelo proteico. Os resultados experimentais demonstram que a intensidade da fluorescência ans ainda aumenta no n-domínio34 quimicamentemodificado por NBS, que carece de fluorescência intrínseca. Portanto, o ensaio é útil para demonstrar a ausência de TRAS entre o resíduo Trp e o ANS quando vinculado ao n-domínio34,40,49. Assim, este ensaio (modificação química NBS de Trp) é útil para provar a presença do par Trp-ANS FRET em proteínas.

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Protocolo

1. Determinação (em silico)da interação de domínio N da ANS e SERCA

  1. Gerar uma estrutura tridimensional (3D) da proteína (domínio N SERCA) por modelagem molecular utilizando o software de modelagem proteica preferencial50.
  2. Identificar os resíduos de aminoácidos que formam o local de ligação nucleotídeo utilizando o software de estrutura molecular preferencial51, e determinar a presença dos resíduos de Arg e Lys35; estes são necessários para a vinculação ans e para aumentar a intensidade de fluorescência (rendimento quântico).
  3. Realizar acoplamento molecular (utilizando o software de acoplamento preferido)52,53,54 para determinar as interações de ATP, isothiocianato fluoresceína (FITC) (que forma uma ligação covalente com Lys515 rotulando o local de ligação nucleotídea) e ANS com resíduos de aminoácidos no local de ligação nucleotídea(Figura 1).
  4. Calcule a distância molecular (Å) entre o resíduo Trp e o ANS vinculado utilizando a ferramenta de medição no software preferido.
  5. Realize a simulação de dinâmica molecular do complexo de domínio ANS-N para determinar a estabilidade da interação52,54. Em seguida, realize os experimentos in vitro quando a estabilidade do complexo for confirmada.

2. Expressão e purificação do recombinante domínio N

  1. Sintetizar a codificação genética para n-domínio40.
  2. Projete e construa o plasmídeo que contém o gene sintético que codifica para o domínio N40.
  3. Expresso e purificado por cromatografia de afinidade (Ni-NTA), o recombinante de domínio N projetado. Realize uma SDS-PAGE da proteína purificada para determinar a pureza (Figura 2)40.
  4. Determine a concentração proteica estudando a absorvância a λ de 280 nm com o coeficiente de extinção do domínio N (ε= 11.960 M-1·cm-1)40.

3. Monitore a formação do complexo de domínio ANS-N com base nas alterações de intensidade de fluorescência de domínio ANS e N.

  1. Prepare uma solução de estoque ANS em N,N-dimetilformamida.
    1. Pesar uma pequena quantidade (1-5 mg) de ANS, e dissolvê-la em 1 mL do volume final de N,N-dimetilformamida, por exemplo, 3,2 mgs (concentração final de 10,69 mM).
    2. Prepare uma solução de estoque aquosa de 100 μM ANS utilizando a solução ANS em N,N-dimethylformamida, por exemplo, adicione 9,4 μL da solução ANS de 10,69 mM para 990,6 μL de tampão fosfato de 50 mM com pH 8,0 para obter um volume final de 1 mL.
    3. Misture as soluções com vórtice 3 a 5 vezes por 15 s.
      NOTA: No experimento a seguir, utilize apenas a solução de estoque aquoso ANS. Prepare-se recentemente a solução de estoque aquoso da ANS antes de iniciar os experimentos.
  2. Prepare a solução de estoque NBS em N,N-dimetilformamida.
    1. Pesar uma pequena quantidade (1-5 mg) de NBS, e dissolvê-la em 1 mL de N,N-dimetilformamida, por exemplo, 5,3 mgs em 1 mL (concentração final de 29,78 mM).
    2. Prepare uma solução de estoque aquoso de 1 mM NBS utilizando a solução NBS em N,N-dimethylformamida, por exemplo, adicione 3,36 μL da solução NBS de 29,78 mM a 96,64 μL de 50 mM tampão fosfato com pH 8,0 para obter um volume final de 0,1 mL.
    3. Misture as soluções com vórtice 3 a 5 vezes por 15 s.
      NOTA: Prepare recentemente a solução de estoque aquoso NBS antes de iniciar os experimentos.
  3. Titule o domínio N com ANS e registe o espectro de fluorescência por excitação em λ=295 nm a 25 °C.
    1. Obtenha a linha de base do espectro de fluorescência.
      1. Coloque 1 mL de tampão fosfato de 50 mM com pH 8.0 em um cuvette de quartzo de fluorescência de 1 mL.
      2. Posicione a célula na câmara celular termo-indicada (25 °C) do espectrofluorômetro e ajuste a excitação λ para 295 nm.
      3. Regisso espectro de fluorescência (305 - 550 nm).
        NOTA: O espectro de fluorescência do tampão fosfato de 50 mM com pH 8.0, que serve como amostra em branco, é subtraído de todos os espectros de fluorescência obtidos.
    2. Obtenha o espectro de fluorescência intrínseca do domínio N.
      1. Coloque 900 μL de tampão de fosfato de 50 mM com pH 8.0 em um cuvette de quartzo de fluorescência.
      2. Adicione 100 μL de suspensão de domínio N (10 μM) para obter uma concentração final de domínio N de 1 μM em um volume final de 1 mL.
      3. Homogeneize suavemente usando uma micropipette 20 vezes para garantir a homogeneidade da solução.
        NOTA: A proteína deve ser recém-purificada para obter espectros de fluorescência intrínseca de alta qualidade, por exemplo, o domínio N recombinante purificado só pode ser usado por uma semana após a purificação.
      4. Posicione a célula na câmara celular termo-indicada (25 °C) do espectrofluorômetro e ajuste a excitação λ para 295 nm.
      5. Regisso espectro de fluorescência intrínseca de domínio N (305-550 nm).
    3. Adicione ANS e obtenha o espectro de fluorescência por excitação em λ=295 nm.
      1. Adicione uma alíquota de 2 μL de 100 μM ANS solução de estoque aquoso ao domínio N suspenso (1 μM) para obter uma concentração final ans de 0,2 μM.
      2. Homogeneize suavemente usando uma micropipette 20 vezes para garantir a homogeneidade da solução.
      3. Posicione a célula na câmara celular termoestabilidade (25 °C) do espectrofluorômetro e ajuste a excitação de λ para 295 nm.
      4. Regisso espectro de fluorescência (305-550 nm).
      5. Repita as adições ans e a gravação de espectros de fluorescência acima de 1:1 relação molar ANS:N-domínio.
      6. Subtraia o espectro em branco de cada espectro usando um software adequado.
      7. Plote todos os espectros em um único gráfico.
      8. Determine se os espectros formam um padrão semelhante ao FRET. Os espectros de fluorescência de domínio ANS-N formam um padrão semelhante ao FRET(Figura 3A).

4. Titulação de fluorescência intrínseca de domínio N por modificação química Trp com NBS.

  1. Repetir as etapas 3.3.1 e 3.3.2.
  2. Adicione uma alíquota de 1 μL de 1 mM NBS solução de estoque aquoso ao domínio N suspenso (1 μM) para obter uma concentração final de 1 μM NBS.
  3. Homogeneize suavemente usando uma micropipette 20 vezes para garantir a homogeneidade da solução.
  4. Posicione a célula na câmara celular termoestabilidade (25 °C) do espectrofluorômetro e ajuste a excitação de λ para 295 nm.
  5. Regisso espectro de fluorescência (305-550 nm) (Figura 3B).
  6. Repita a gravação do espectro de adição de NBS e fluorescência até que seja observada a saciação mínima de fluorescência intrínseca do domínio N40. No domínio N, isso geralmente ocorre em uma razão molar de 5-6 NBS/N-domínio40.
    NOTA: NBS sacia rapidamente (<5 s) a fluorescência intrínseca do domínio N; observa-se uma diminuição na intensidade da fluorescência. Prossiga imediatamente para o próximo passo, pois a NBS também pode reagir com outros resíduos de aminoácidos47.
  7. Subtraia o espectro em branco de cada espectro usando um software adequado.
  8. Plote todos os espectros em um único gráfico(Figura 3B).

5. Titular o domínio N modificado pelo NBS com ANS registrando espectros de fluorescência a 25 °C.

  1. Execute a etapa 3.3.3 usando o domínio N modificado NBS que foi gerado na Etapa 4.
  2. Subtraia o espectro em branco de cada espectro usando um software adequado.
  3. Plote todos os espectros em um único gráfico(Figura 3C).
  4. O espectro de fluorescência gerado(Figura 3C) suporta ou refuta a ocorrência de FRET, ou seja, quando o TRAS ocorre, a fluorescência ans não aumenta e vice-versa.

6. Evidência de ANS vinculando-se ao domínio N quimicamente modificado por excitação em λ=370 nm.

  1. Execute o Passo 3.3.3 usando o n-domínio N modificado NBS que foi gerado na Etapa 4, mas alterando a excitação λ para 370 nm.
  2. Subtraia o espectro em branco de cada espectro usando um software adequado.
  3. Plote todos os espectros em um único gráfico(Figura 3D).
  4. Confirme a vinculação ans ao domínio N observando o aumento da intensidade de fluorescência ans. A vinculação ans ao domínio N mostra um aumento de fluorescência quando excitada em λ=370 nm(Figura 3D). Como controle, o espectro de fluorescência de ANS (sozinho) em tampão fosfato de 50 mM com pH 8.0 foi obtido emocionante em λ de 295 e 370 nm(Figura 4, não mostrado em vídeo).
    NOTA: A relação estequiométrica de NBS:Trp necessária para modificação química depende do grau de enterramento do resíduo de Trp na proteína em estudo46,47,55,56. Portanto, recomenda-se determinar a relação molar NBS:protein/(Trp), de antemão.

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Resultados

O acoplamento molecular mostra a vinculação da ANS ao local de ligação nucleotídea do domínio N via interações eletrostáticas, bem como hidrofóbicas(Figura 1). A distância molecular (20 Å) entre o resíduo Trp e o ANS (vinculado ao local de ligação nucleotídeo) suporta a ocorrência de FRET(Figura 1). O recombinante N-domínio projetado (projetado) foi obtido com alta pureza por cromatografia de afinidade(Figura 2) e foi adequado para ...

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Discussão

Os espectros de fluorescência do complexo de domínio ANS-N exibem um padrão semelhante ao FRET quando excitados em um λ de 295 nm, enquanto a distância molecular (20 Å) entre o resíduo Trp e ANS parece suportar a ocorrência de FRET(Figura 1). A modificação química trp por NBS resulta em um domínio N menos fluorescente (Figura 3B, Spectrum f); portanto, a transferência de energia não é possível. Os espectros de fluorescência ans são semelhantes aos do domínio N n...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi parcialmente financiado pelo número de subvenção da FAI-UASLP C19-FAI-05-89.89 e pelo número de subvenção da CONACYT 316463 (Apoyos a la Ciencia de Frontera: Fortalecimiento y Mantenimiento de Infraestructuras de Investigación de Usoún Común y Capacitación Técnica 2021). Os autores agradecem a assistência técnica de Julian E. Mata-Morales na edição de vídeo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AcrilamidaBio-Rad1610107SDS-PAGE
Persulfato de amônioBio-Rad1610700SDS-PAGE
8-Anilino-1-naftalenossulfônicoSigma-AldrichA1028Fluoróforo
Bis-acrilamidaBio-Rad1610125SDS-PAGE
N-BromosuccinimidaSigma-AldrichB81255Chemical modificação
N,N-dimetilformamidaJ.T. Baker9213-12Preparação da solução de estoque
Isotiocianato de fluoresceínaSigma-AldrichF7250Etiqueta de fluorescência química
Cubeta de fluorescênciaHellmaZ801291Ensaio de fluorescência
Espectrofluorômetro de fluorescênciaShimadzuRF 5301PCEnsaio
Sua armadilha e comércio; FFGE Healtcare11-0004-59Purificação de proteínas
IPTG, sem dioxanoAmerican BionalyticalAB00841-00010Expressão de proteínas
ImidazoleSigma-AldrichI5513-25GPurificação de proteínas
LB mediaFisher Scientific10000713Cultura de células
Pipetman L P10LGilsonFA10002MFluorescência ensaio
Pipetman L P100LGilsonFA10004MEnsaio de fluorescência
Pipetman L P200LGilsonFA10005MEnsaio de fluorescência
Pipetman L P1000LGilsonFA10006MEnsaio de fluorescência
Pipetman L P5000LGilsonFA10007Ensaio de fluorescência
Precision plus stdBio-Rad1610374SDS-PAGE
Dodecil sulfato de sódioBio-Rad1610302SDS-PAGE
Fosfato de sódio dibásicoJ.T. Baker3828-19Preparação de
tampão Fosfato de sódio monobásicoJ.T. Baker3818-01Preparação de tampão
Filtro de seringa 0,2 umMilliporeGVWP04700Filtração de solução
TemedBio-Rad1610801PÁGINA SDS
TrisBio-Rad1610719SDS-PAGE
de fluorescência

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