Aqui, apresentamos um protocolo para rotular vesículas extracelulares derivadas de plaquetas para monitorar sua migração e absorção em explanações de cartilagem usadas como modelo de osteoartrite.
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Artigo de método
Rotulagem de vesículas extracelulares para monitoramento de migração e absorção em Explants de cartilagem
Neste artigo
Resumo
Resumo
Vesículas extracelulares (EVs) são utilizadas em diferentes estudos para comprovar seu potencial como tratamento livre de células devido à sua carga derivada de sua fonte celular, como o lisato plaqueta (PL). Quando usados como tratamento, espera-se que os EVs entrem nas células-alvo e afetuem uma resposta a partir delas. Nesta pesquisa, os EVs derivados do PL têm sido estudados como um tratamento livre de células para osteoartrite (OA). Assim, foi criado um método para rotular EVs e testar sua absorção em explants de cartilagem. Os EVs derivados do PL são rotulados com o corante lipofílico PKH26, lavados duas vezes através de uma coluna e, em seguida, testados em um modelo OA in vitro orientado para inflamação por 5 h após quantificação de partículas por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). De hora em hora, as explantas de cartilagem são fixas, parafinadas, cortadas em seções de 6 μm para montar em lâminas, e observadas sob um microscópio confocal. Isso permite verificar se os EVs entram nas células-alvo (condrócitos) durante esse período e analisam seu efeito direto.
Introdução
A osteoartrite (OA) é uma doença degenerativa articular que implica uma inflamação progressiva e irreversível e destruição da matriz extracelular da cartilagem articular1. Embora várias formas de artrite tenham inúmeros tratamentos2,3,4, estes são restritos por seus efeitos colaterais e eficácia limitada. Técnicas de engenharia de tecidos utilizando implantação de condrocito autólogo são rotineiramente aplicadas para o tratamento regenerativo da cartilagem lesionada nas lesões precoces da cartilagem OA4. As terapias baseadas em ....
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Protocolo
NOTA: As explanagens de cartilagem foram obtidas junto ao IdISBa Biobank (IB 1995/12 BIO) em conformidade com as diretrizes institucionais após aprovação ética do projeto pelo CEI-IB (IB 3656118 PI).
1. Preparação da coluna
- Colunas de equilíbrio seguindo as instruções do fabricante ou a seguir:
- Remova a tampa da coluna e equilibre a coluna. Remova o buffer de armazenamento por eluição.
- Lave a coluna 3 vezes com 2,5 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS). Durante cada lavagem, espere que a coluna absorva todo o volume.
NOTA: Não deixe a coluna secar. - Cubra a coluna com a tampa após a últ....
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Resultados
Uma visão geral esquemática para o monitoramento de rotulagem e absorção de EV é exibida na Figura 1. A concentração de partículas e o tamanho de EV detectados pela NTA na Tabela 1 mostram que a concentração de EV diminui durante o processo devido à etapa de purificação realizada duas vezes após a rotulagem com a coluna. No entanto, a quantidade obtida está na faixa ideal do número de partículas para usar para tratamento. Esta concentração de partículas é usada para calcular.......
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Discussão
A imagem EV ajuda a entender as propriedades de EV, como seus mecanismos de liberação e absorção. Sua imagem permite o monitoramento de sua biodistribução e a caracterização de suas propriedades farmacocinéticas como veículos de drogas. No entanto, a imagem e o rastreamento de EV podem ser difíceis devido aos seus pequenos tamanhos, embora muitos dispositivos de imagem e técnicas de rotulagem tenham sido desenvolvidos para ajudar os pesquisadores a monitorar EVs sob condições in vitro e in vivo
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, co-financiado pelo Fundo Social Europeu da ESF e pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional do ERDF (MS16/00124; CP16/00124); pelo PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), financiado pelo imposto sobre o turismo sustentável das Ilhas Baleares; pelo Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); pelo programa de pós-doutorado FOLIUM (FOLIUM 17/01) dentro do FUTURMed, financiado em 50% pelo imposto sobre o turismo sustentável das Ilhas Baleares e em 50% pela ESF; e p....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| 1,5 mL Tubo de centrífuga | SPL ciências da vida | PLC60015 | |
| 1 mL Seringa BD Plastipak | BD | 303174 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Panreac AppliChem | 1.310.901.211 | Preparado a 20% com água Milli-Q |
| 96 poços placa de cultura | SPL ciências da vida | ||
| Etanol absoluto Pharmpur | Scharlab | ET0006005P | Usado para preparar etanol de 96% e 75% com água Milli-Q |
| Punção de biópsia com êmbolo 3 mm | Scandidact | MTP-33-32 | |
| Soro bovino Albumina (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Preparado a 5% com |
| explantes de cartilagem | IdISBa Biobank | ||
| Tubo de concentração 15 mL Nanosep 100 kD Omega | Pall | MCP100C41 | |
| Tubo de concentração 500 µ L Nanosep 100 kD Omega | Pall | OD003C33 | |
| Vidro de cobertura 24 x 60 mm | Deltalab | D102460 | |
| DMEM-F12 -GlutaMAX meio | Biowest | L0092 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Blocos de tecido de parafina embutidos | IdISBa Biobank | Taxa de serviço | |
| Colunas mini-HD Exo-spin | Sistemas de orientação celular | EX05 | |
| Feather S35 Microtome Blade | Feather | 43037 | |
| Filtropur S 0.2 µ m filtro de seringa | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fluoroshield com DAPI | Sigma-Aldrich | F-6057 | |
| Oncostatina M Human | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | Prepare uma solução estoque para uma concentração final de 0,1 µ g/µ L diluído em PBS-0,1% BSA |
| Paraformaldeído | Sigma-Aldrich | 8.18715.1000 | Preparado a 4% com PBS e armazenado a 4 &graus; C |
| Solução de Penicilina-Estreptomicina 100x | Biowest | L0022 | |
| PKH26 Kit de Ligação de Células Fluorescentes Vermelhas para Rotulagem Geral de Membranas Celulares | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 e Dliuent C incluído |
| Citrato de sódio di-hidratado | Scharlab | SO019911000 | |
| Superfrost Plus Lâminas de microscópio | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| TNF&alfa; | R& D systems | 210-TA-005 | Preparar uma solução estoque para uma concentração final de 0,01 µ g/µ L diluído em PBS-0,1% BSA |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Usado para preparar uma solução de citrato de sódio a 0,1% Triton-0,1% com água Milli-Q |
| Xileno | Scharlab | XI0050005P | |
| Equipment | |||
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| NanoSight NS300 | Dispositivo Malvern | NS300 | com laser embutido em λ= 532 nm e câmera sCMOS |
| Shandon Finesse 325 Manual Microtome | Thermo Scientific™ | ||
| confocal A78100101 TCS-SPE | Leica Microsystems | 5200000271 |
Referências
- Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
- Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T.
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Reimpressões e permissões
