Method Article

Rotulagem de vesículas extracelulares para monitoramento de migração e absorção em Explants de cartilagem

DOI:

10.3791/62780

⸱

October 4th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Therapy and Tissue Engineering Group, Research Institute on Health Sciences (IUNICS), University of the Balearic Islands, 2Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa), 3Cellomics Unit, Institut Universitari d'Investigació en Ciències de la Salut (IUNICS), Universitat de les Illes Balears, 4Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (FBSTIB)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um protocolo para rotular vesículas extracelulares derivadas de plaquetas para monitorar sua migração e absorção em explanações de cartilagem usadas como modelo de osteoartrite.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vesículas extracelulares (EVs) são utilizadas em diferentes estudos para comprovar seu potencial como tratamento livre de células devido à sua carga derivada de sua fonte celular, como o lisato plaqueta (PL). Quando usados como tratamento, espera-se que os EVs entrem nas células-alvo e afetuem uma resposta a partir delas. Nesta pesquisa, os EVs derivados do PL têm sido estudados como um tratamento livre de células para osteoartrite (OA). Assim, foi criado um método para rotular EVs e testar sua absorção em explants de cartilagem. Os EVs derivados do PL são rotulados com o corante lipofílico PKH26, lavados duas vezes através de uma coluna e, em seguida, testados em um modelo OA in vitro orientado para inflamação por 5 h após quantificação de partículas por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). De hora em hora, as explantas de cartilagem são fixas, parafinadas, cortadas em seções de 6 μm para montar em lâminas, e observadas sob um microscópio confocal. Isso permite verificar se os EVs entram nas células-alvo (condrócitos) durante esse período e analisam seu efeito direto.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A osteoartrite (OA) é uma doença degenerativa articular que implica uma inflamação progressiva e irreversível e destruição da matriz extracelular da cartilagem articular1. Embora várias formas de artrite tenham inúmeros tratamentos2,3,4, estes são restritos por seus efeitos colaterais e eficácia limitada. Técnicas de engenharia de tecidos utilizando implantação de condrocito autólogo são rotineiramente aplicadas para o tratamento regenerativo da cartilagem lesionada nas lesões precoces da cartilagem OA4. As terapias baseadas em células são restritas principalmente devido ao número limitado de condrócitos fenotipicamente estáveis ou chondroprogenitors capazes de reparar efetivamente a cartilagem3. Portanto, o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para prevenir a progressão da doença e regenerar grandes lesões de cartilagem é de suma importância.

Vesículos extracelulares (EVs) têm sido sugeridos como um tratamento para OA por diferentes autores5,6. Os EVs são corpos membranous secretados pela maioria dos tipos de células, estão envolvidos na sinalização intercelular, e têm sido mostrados para exercer os efeitos terapêuticos das células-tronco7,8,9, devido ao qual recentemente despertaram interesse em medicina regenerativa10. Os EVs derivados de células estromais mesenquimais (MSCs) são os principais EVs terapêuticos investigados para OA, embora outras células relacionadas à articulação tenham sido usadas como fontes de EV, por exemplo, condroprogenitors ou células imunes11,12.

Concentrados plaquetas, como plaquetas plaquetas (PLs), são usados para melhorar a cicatrização de feridas em diferentes lesões, como úlceras córneas13,14,15 ou na regeneração do tecido tendinoso16,devido à hipótese de que o componente EV dos concentrados plaquetas pode ser responsável por esses efeitos17 . Alguns estudos relacionados a doenças relacionadas à articulação utilizam EVs derivados de plaquetas (PL-EVs) como tratamento para amenizar as condições osteoartríticas. Os PL-EVs melhoram a proliferação de condrocitos e a migração celular ativando a via Wnt/β-catenin18, promovendo a expressão de marcadores condrogênicos em condrócitos osteoartréticos19, ou mostrando níveis mais elevados de proteínas condrogênicas e menos anormalidades tissulares em coelhos osteoartrrápticos tratados com PL-EVs18.

Os EVs contêm proteínas, lipídios e ácidos nucleicos que são liberados para a célula-alvo, estabelecendo a comunicação célula-célula, que é a principal característica relacionada às suas aplicações terapêuticas20. Os efeitos dos EVs dependem de suas células de alcance e posterior liberação de carga. Esse efeito pode ser confirmado indiretamente por alterações causadas nas células, como atividade metabólica ou modificação da expressão genética. No entanto, esses métodos não permitem a visualização de como os EVs chegam às células para exercer sua função. Assim, este artigo apresenta um método para rotular esses EVs derivados de PL para serem utilizados como tratamento para explantas de cartilagem OA orientadas por inflamação. A microscopia confocal foi utilizada para monitorar a absorção e progressão de EV para os condrócitos presentes nas explantas em um lapso de tempo de 5h.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: As explanagens de cartilagem foram obtidas junto ao IdISBa Biobank (IB 1995/12 BIO) em conformidade com as diretrizes institucionais após aprovação ética do projeto pelo CEI-IB (IB 3656118 PI).

1. Preparação da coluna

  1. Colunas de equilíbrio seguindo as instruções do fabricante ou a seguir:
    1. Remova a tampa da coluna e equilibre a coluna. Remova o buffer de armazenamento por eluição.
    2. Lave a coluna 3 vezes com 2,5 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS). Durante cada lavagem, espere que a coluna absorva todo o volume.
      NOTA: Não deixe a coluna secar.
    3. Cubra a coluna com a tampa após a última lavagem e até a preparação da amostra.

2. Rotulagem EV

NOTA: Este protocolo de rotulagem EV utiliza uma amostra PL-EV anteriormente isolada por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) com condições previamente descritas21,22. No entanto, qualquer amostra de EV de qualquer fonte pode ser usada com este protocolo.

  1. Concentre a amostra EV e o controle (PBS) utilizando um tubo de concentração.
    1. Coloque as amostras em um tubo concentrador de 15 mL ou 500 μL, dependendo do volume inicial da inicialção da amostra EV. Centrifugar os tubos de acordo com as instruções do fabricante até que uma amostra quase seca seja obtida.
      NOTA: A amostra de controle é necessária para verificar se há qualquer fundo de corante. Embora este método não exija nenhum volume inicial específico, deve-se considerar que cerca de 10% das partículas serão perdidas durante as etapas de purificação.
  2. Resuspend as amostras concentradas com amostras de EV diluentes com 200 μL e o grupo controle com 100 μL e transfira-as para novos tubos de centrífugas de 1,5 mL.
  3. Separe a amostra de EV em duas alíquotas de 100 μL. Marque um com corante e use-a como tratamento (PKH-PL-EV); deixe o outro não marcado, mas processe-o (NTA-PL-EV) como a amostra EV e use-a para quantificar a concentração de EV pela NTA.
  4. Prepare a solução de corante 2x, resultando em solução PKH26 de 8 μM em C diluído.
  5. Misture 1 μL de 1 mM PKH26 linker por 125 μL de C diluído na amostra. Prepare um volume necessário para adicionar às amostras em uma proporção de 1:1.
  6. Adicione solução de corante 2x ao PKH-PL-EV e controle amostras em uma proporção de 1:1 para alcançar 1x de concentração de corante e 4 μM de concentração PKH26. Adicione o mesmo volume de PBS à amostra NTA-PL-EV. Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
  7. Adicione 5% de solução de gérico bovino albumin-PBS às amostras em uma proporção de 1:1 e certifique-se de que o volume final seja ~400 μL.
    NOTA: Esta etapa permite a remoção de interações de corantes inespecíficos ou corantes não vinculados.
  8. Prossiga para separar os EVs rotulados do corante não vinculado e interações não específicas do corante com a coluna.

3. Isolamento rotulado-EV

  1. Retire a tampa da coluna, adicione 400 μL da amostra (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV ou controle) e descarte todo o líquido elucido.
  2. Aguarde que a amostra entre completamente na coluna antes de prosseguir para o próximo passo. Adicione 600 μL de PBS e descarte todo o líquido elucido.
  3. Aguarde que o PBS entre completamente na coluna antes de prosseguir para a próxima etapa. Adicione 600 μL de PBS e colete uma fração de 600 μL em um 1,5. tubo de centrífugas mL (EVs ou controle).
    NOTA: Estas etapas são necessárias para remover o excesso de corante das amostras. Outra separação por coluna é necessária para obter EVs mais puros. Assim, as etapas a seguir devem ser realizadas em uma nova coluna equilibrada (etapa 4.1.) ou na mesma coluna após uma etapa inicial de lavagem (etapa 4.2).
  4. Prepare a coluna para uma nova etapa de separação do EV para obter EVs mais puros. Se for uma nova coluna, repita os passos 2.1. e 2,2. Se for a mesma coluna, lave a coluna com 2,5 mL de isopropanol de 20% e, em seguida, repita as etapas 2.1 e 2.2.
  5. Adicione 600 μL de EVs previamente elucidos obtidos na etapa 2.5 à coluna e descarte o volume elucido. Aguarde que o líquido entre na coluna completamente antes de prosseguir para o próximo passo.
  6. Adicione 400 μL de PBS e descarte todo o volume elucido. Aguarde que o líquido entre na coluna completamente antes de prosseguir para o próximo passo.
  7. Adicione 600 μL de PBS e colete uma fração de 600 μL em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Use os EVs e as amostras de controle para novas análises ou armazene-as durante a noite a 4 oC.
  8. Armazene as colunas usadas para uso futuro.
    1. Lave a coluna com 25 mL de isopropanol de 20% e descarte o volume elucido. Lave a coluna 3 vezes com 2,5 mL de PBS.
    2. Adicione o buffer de armazenamento removido na etapa 1.1.1 e aguarde que o buffer entre na coluna. Cubra a coluna com a tampa e armazene a 4 oC até o uso subsequente.

4. Quantificação de EV

  1. Prepare 1:1.000 diluições da amostra NTA-PL-EV e da amostra inicial de PL-EV, conforme descrito pelas duas etapas seguintes.
    1. Prepare 1 mL de 1:10 diluído NTA-PL-EV e 1 mL de PL-EV inicial diluído com PBS filtrado através de um filtro de 0,2 μm.
    2. Prepare 1 mL de uma diluição de 1:100 das amostras diluídas anteriores com PBS filtrado através de um filtro de 0,2 μm.
  2. Injete a amostra NTA-PL-EV diluída de 1:100 ou a amostra inicial de PL-EV usando uma seringa estéril na bomba NTA. Siga as instruções e recomendações do fabricante para a concentração de partículas e a determinação da distribuição de tamanho.
    NOTA: Como a concentração de EV depende do volume de inicialização da amostra, pode ser necessário ler diluições intermediárias e fazer ajustes para obter uma determinação correta do NTA.

5. EVs usados como tratamento para OA movidos a inflamação

  1. Lave a cartilagem duas vezes com PBS e extirpar-a usando um soco de biópsia de 3 mm de diâmetro em condições estéreis.
    NOTA: Realize o procedimento das etapas 5.1 a 5.6 em um capô de cultura celular.
  2. Coloque as explantas em placas de cultura de 96 poços com meio DMEM-F12 suplementado com 1% de penicilina-estreptomicina a 37 oC, 5% DE CO2e 80% de umidade.
    1. Para estabelecer um modelo de OA orientado para inflamação, suplementar o meio de cultura celular com oncostatina M de 10 ng/mL e 2 ng/mL fator de necrose tumoral alfa (TNFα).
  3. Trate as explantas com 1 × 109 partículas/poço de EVs rotulados (PKH-PL-EV) ou controle em meio de cultura celular complementado com oncostatina M e TNFα.
    NOTA: Meça o volume da amostra contendo 1 × 109 partículas/poço e use o mesmo volume para o controle.
  4. Remova o meio das placas de cultura celular de 96 poços contendo explants de cartilagem. Adicione 200 μL do meio de cultura celular descrito na etapa 5.3 para cada poço.
    NOTA: Se as placas de 96 poços tiverem estado em contato com o soro bovino fetal (FBS), lave cada poço três vezes com 200 μL de PBS para remover quaisquer EVs do FBS.
  5. Pare o ensaio in vitro em horários diferentes: 0, 1, 2, 3, 4 e 5h.
  6. Lave os poços de cultura celular contendo as explantas de cartilagem duas vezes com 200 μL de PBS.
  7. Adicione 100 μL de 4% de paraformaldeído (PFA) ao tecido para fixá-lo por 3h a 4 oC.
    NOTA: As etapas que envolvem a PFA devem ser realizadas em um capô de fumaça seguindo as recomendações da Ficha de Dados de Segurança.
  8. Retire o PFA, adicione 100 μL de PBS, armazene o tecido fixo a 4 °C e processe as amostras dentro de 48 h.

6. Preparação e visualização de microscopia

NOTA: Este procedimento histológico consiste em desidratação, incorporação de parafina e etapas de reidratação. Essas etapas podem reduzir a fluorescência geral do corante (uma limitação mencionada na folha de dados para PKH26). Portanto, outros procedimentos, como a secção congelada, podem ser mais adequados para visualização de EV por microscopia confocal.

  1. Incorpore os tecidos fixos em blocos de parafina. Corte o tecido em seções de 6 μm de espessura.
  2. Desparafinar as seções de tecido.
    NOTA: Todas as etapas que utilizam xileno devem ser realizadas em um capô de fumaça.
    1. Mergulhe as seções teciduais em xileno por 30 min, 100% etanol por 2 min, 96% etanol por 2 min, 75% etanol por 1 min, e finalmente em água destilada por 30 s.
  3. Permeabilize as seções teciduais.
    1. Prepare uma solução de citrato de sódio Triton-0,1% de 0,1% para permeabilizar o tecido. Adicione uma gota de 20 μL em cada seção de tecido e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente. Lave cada seção duas vezes com 20 μL de PBS.
  4. Em um slide microscópico, adicione uma gota de meio de montagem contendo 4′,6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI) com um meio de montagem aquoso para preservar a fluorescência. Cubra a lâmina contendo 3 seções teciduais da etapa 6.3.1.
  5. Incubar os slides durante a noite à temperatura ambiente, protegidos da luz.
  6. Armazene a 4 °C, protegido da luz até a microscopia confocal.

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Results

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Uma visão geral esquemática para o monitoramento de rotulagem e absorção de EV é exibida na Figura 1. A concentração de partículas e o tamanho de EV detectados pela NTA na Tabela 1 mostram que a concentração de EV diminui durante o processo devido à etapa de purificação realizada duas vezes após a rotulagem com a coluna. No entanto, a quantidade obtida está na faixa ideal do número de partículas para usar para tratamento. Esta concentração de partículas é usada para calcular...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A imagem EV ajuda a entender as propriedades de EV, como seus mecanismos de liberação e absorção. Sua imagem permite o monitoramento de sua biodistribução e a caracterização de suas propriedades farmacocinéticas como veículos de drogas. No entanto, a imagem e o rastreamento de EV podem ser difíceis devido aos seus pequenos tamanhos, embora muitos dispositivos de imagem e técnicas de rotulagem tenham sido desenvolvidos para ajudar os pesquisadores a monitorar EVs sob condições in vitro e in vivo

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, co-financiado pelo Fundo Social Europeu da ESF e pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional do ERDF (MS16/00124; CP16/00124); pelo PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), financiado pelo imposto sobre o turismo sustentável das Ilhas Baleares; pelo Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); pelo programa de pós-doutorado FOLIUM (FOLIUM 17/01) dentro do FUTURMed, financiado em 50% pelo imposto sobre o turismo sustentável das Ilhas Baleares e em 50% pela ESF; e pelo Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Material
1,5 mL Tubo de centrífugaSPL ciências da vidaPLC60015
1 mL Seringa BD PlastipakBD303174
2-Propanol (Isopropanol)Panreac AppliChem1.310.901.211Preparado a 20% com água Milli-Q
96 poços placa de culturaSPL ciências da vida
Etanol absoluto PharmpurScharlabET0006005PUsado para preparar etanol de 96% e 75% com água Milli-Q
Punção de biópsia com êmbolo 3 mmScandidactMTP-33-32
Soro bovino  Albumina (BSA)Sigma-AldrichA7030Preparado a 5% com
explantes de cartilagemIdISBa Biobank
Tubo de concentração 15 mL Nanosep 100 kD OmegaPallMCP100C41
Tubo de concentração 500 µ L Nanosep 100 kD OmegaPallOD003C33
Vidro de cobertura 24 x 60 mmDeltalabD102460
DMEM-F12 -GlutaMAX meioBiowestL0092
Dulbecco's PBS (1x)Capricorn ScientificPBS-1A
Blocos de tecido de parafina embutidosIdISBa BiobankTaxa de serviço
Colunas mini-HD Exo-spinSistemas de orientação celularEX05
Feather S35 Microtome BladeFeather43037
Filtropur S 0.2 µ m filtro de seringaSarstedt83.1826.001
Fluoroshield com DAPISigma-AldrichF-6057
Oncostatina M HumanSigma-AldrichO9635-10UGPrepare uma solução estoque para uma concentração final de 0,1 µ g/µ L diluído em PBS-0,1% BSA
ParaformaldeídoSigma-Aldrich8.18715.1000Preparado a 4% com PBS e armazenado a 4 &graus; C
Solução de Penicilina-Estreptomicina 100xBiowestL0022
PKH26 Kit de Ligação de Células Fluorescentes Vermelhas para Rotulagem Geral de Membranas CelularesSigma-AldrichMINI26PKH26 e Dliuent C incluído
Citrato de sódio di-hidratadoScharlabSO019911000
Superfrost Plus Lâminas de microscópioThermo ScientificJ1800AMNZ
TNF&alfa;R& D systems210-TA-005Preparar uma solução estoque para uma concentração final de 0,01 µ g/µ L diluído em PBS-0,1% BSA
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Usado para preparar uma solução de citrato de sódio a 0,1% Triton-0,1% com água Milli-Q
XilenoScharlabXI0050005P
Equipment
Centrifuge 5430 REppendorf5428000210F-45-48-11 rotor
NanoSight NS300Dispositivo MalvernNS300com laser embutido em λ= 532 nm e câmera sCMOS
Shandon Finesse 325 Manual MicrotomeThermo Scientific™
confocal A78100101 TCS-SPELeica Microsystems5200000271
PLC30096 PBS microscópio

References

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