Rotulagem de vesículas extracelulares para monitoramento de migração e absorção em Explants de cartilagem

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para rotular vesículas extracelulares derivadas de plaquetas para monitorar sua migração e absorção em explanações de cartilagem usadas como modelo de osteoartrite.

Abstract

Vesículas extracelulares (EVs) são utilizadas em diferentes estudos para comprovar seu potencial como tratamento livre de células devido à sua carga derivada de sua fonte celular, como o lisato plaqueta (PL). Quando usados como tratamento, espera-se que os EVs entrem nas células-alvo e afetuem uma resposta a partir delas. Nesta pesquisa, os EVs derivados do PL têm sido estudados como um tratamento livre de células para osteoartrite (OA). Assim, foi criado um método para rotular EVs e testar sua absorção em explants de cartilagem. Os EVs derivados do PL são rotulados com o corante lipofílico PKH26, lavados duas vezes através de uma coluna e, em seguida, testados em um modelo OA in vitro orientado para inflamação por 5 h após quantificação de partículas por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). De hora em hora, as explantas de cartilagem são fixas, parafinadas, cortadas em seções de 6 μm para montar em lâminas, e observadas sob um microscópio confocal. Isso permite verificar se os EVs entram nas células-alvo (condrócitos) durante esse período e analisam seu efeito direto.

Introduction

A osteoartrite (OA) é uma doença degenerativa articular que implica uma inflamação progressiva e irreversível e destruição da matriz extracelular da cartilagem articular¹. Embora várias formas de artrite tenham inúmeros tratamentos^2,3,4, estes são restritos por seus efeitos colaterais e eficácia limitada. Técnicas de engenharia de tecidos utilizando implantação de condrocito autólogo são rotineiramente aplicadas para o tratamento regenerativo da cartilagem lesionada nas lesões precoces da cartilagem OA⁴. As terapias baseadas em ....

Protocol

NOTA: As explanagens de cartilagem foram obtidas junto ao IdISBa Biobank (IB 1995/12 BIO) em conformidade com as diretrizes institucionais após aprovação ética do projeto pelo CEI-IB (IB 3656118 PI).

1. Preparação da coluna

1. Colunas de equilíbrio seguindo as instruções do fabricante ou a seguir:
   1. Remova a tampa da coluna e equilibre a coluna. Remova o buffer de armazenamento por eluição.
   2. Lave a coluna 3 vezes com 2,5 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS). Durante cada lavagem, espere que a coluna absorva todo o volume.
      NOTA: Não deixe a coluna secar.
   3. Cubra a coluna com a tampa após a últ....

Results

Uma visão geral esquemática para o monitoramento de rotulagem e absorção de EV é exibida na Figura 1. A concentração de partículas e o tamanho de EV detectados pela NTA na Tabela 1 mostram que a concentração de EV diminui durante o processo devido à etapa de purificação realizada duas vezes após a rotulagem com a coluna. No entanto, a quantidade obtida está na faixa ideal do número de partículas para usar para tratamento. Esta concentração de partículas é usada para calcular.......

Discussion

A imagem EV ajuda a entender as propriedades de EV, como seus mecanismos de liberação e absorção. Sua imagem permite o monitoramento de sua biodistribução e a caracterização de suas propriedades farmacocinéticas como veículos de drogas. No entanto, a imagem e o rastreamento de EV podem ser difíceis devido aos seus pequenos tamanhos, embora muitos dispositivos de imagem e técnicas de rotulagem tenham sido desenvolvidos para ajudar os pesquisadores a monitorar EVs sob condições in vitro e in vivo

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
1,5 mL Tubo de centrífuga	SPL ciências da vida	PLC60015
1 mL Seringa BD Plastipak	BD	303174
2-Propanol (Isopropanol)	Panreac AppliChem	1.310.901.211	Preparado a 20% com água Milli-Q
96 poços placa de cultura	SPL ciências da vida
Etanol absoluto Pharmpur	Scharlab	ET0006005P	Usado para preparar etanol de 96% e 75% com água Milli-Q
Punção de biópsia com êmbolo 3 mm	Scandidact	MTP-33-32
Soro bovino  Albumina (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	Preparado a 5% com
explantes de cartilagem	IdISBa Biobank
Tubo de concentração 15 mL Nanosep 100 kD Omega	Pall	MCP100C41
Tubo de concentração 500 µ L Nanosep 100 kD Omega	Pall	OD003C33
Vidro de cobertura 24 x 60 mm	Deltalab	D102460
DMEM-F12 -GlutaMAX meio	Biowest	L0092
Dulbecco's PBS (1x)	Capricorn Scientific	PBS-1A
Blocos de tecido de parafina embutidos	IdISBa Biobank		Taxa de serviço
Colunas mini-HD Exo-spin	Sistemas de orientação celular	EX05
Feather S35 Microtome Blade	Feather	43037
Filtropur S 0.2 µ m filtro de seringa	Sarstedt	83.1826.001
Fluoroshield com DAPI	Sigma-Aldrich	F-6057
Oncostatina M Human	Sigma-Aldrich	O9635-10UG	Prepare uma solução estoque para uma concentração final de 0,1 µ g/µ L diluído em PBS-0,1% BSA
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	8.18715.1000	Preparado a 4% com PBS e armazenado a 4 &graus; C
Solução de Penicilina-Estreptomicina 100x	Biowest	L0022
PKH26 Kit de Ligação de Células Fluorescentes Vermelhas para Rotulagem Geral de Membranas Celulares	Sigma-Aldrich	MINI26	PKH26 e Dliuent C incluído
Citrato de sódio di-hidratado	Scharlab	SO019911000
Superfrost Plus Lâminas de microscópio	Thermo Scientific	J1800AMNZ
TNF&alfa;	R& D systems	210-TA-005	Preparar uma solução estoque para uma concentração final de 0,01 µ g/µ L diluído em PBS-0,1% BSA
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Usado para preparar uma solução de citrato de sódio a 0,1% Triton-0,1% com água Milli-Q
Xileno	Scharlab	XI0050005P
Equipment
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000210	F-45-48-11 rotor
NanoSight NS300	Dispositivo Malvern	NS300	com laser embutido em λ= 532 nm e câmera sCMOS
Shandon Finesse 325 Manual Microtome	Thermo Scientific™
confocal A78100101 TCS-SPE	Leica Microsystems	5200000271