Transdução Transitória das Formas Estrofes estropidas de Echinococcus granulosus

A echinocococcose cística (CE) é uma das doenças helmintos mais importantes causadas pelo Echinococcus granulosus, uma pequena tênia dentro da família Taeniidae ^1,2. Foram realizados estudos extensivos sobre o desenvolvimento de imunodiagnósticos e vacinas para e. granuloso. No entanto, o conhecimento inadequado sobre a base molecular da biologia dos parasitas apresenta grandes limitações no diagnóstico, manejo e prevenção da doença hídida 3,4,5,6.

Nos últimos anos, devido ao desenvolvimento de sequenciamento de genomas e métodos transcriptômicos, uma ampla gama de estudos moleculares têm sido realizados em flatworms por vários grupos de pesquisa ^7,8,9. No entanto, no mundo dos parasitas, os avanços na tecnologia de transferência de genes em flatworms parasitas ainda são limitados em comparação com os métodos de transdução transitório altamente reprodutíveis desenvolvidos para alguns protozoários 10,11,12.

O uso de sistemas de entrega viral emergiu como uma ferramenta essencial para a entrega de transgenes e investigações de genes/proteínas nas últimas duas décadas¹³. O lentivírus infecta células divisórias e não-divisórias, possibilitando infectar células pós-médicos 14,15,16. Evidências recentes indicam que o uso de um sistema de transdução baseado em lentivírus em células de mamíferos oferece o potencial de superar a maioria das limitações das técnicas anteriores de knock-in/knock-down. O desenho e construção de vetores lentivirais de expressão com marcadores moleculares apropriados, como a expressão GFP, foram descritos anteriormente¹⁶. Portanto, avaliamos a transdução transitória lentiviral de um gene repórter GFP nas protoscolés e vermes estroboscópicos de E. granulosus.

Este estudo foi aprovado pelo Instituto Nacional de Desenvolvimento de Pesquisas Médicas e pelo Comitê de Revisão de Ética em Pesquisa, nº 958680. Os lentivírus são classificados como organismos BSL-2; portanto, todos os procedimentos de cultura laboratorial neste protocolo foram realizados utilizando práticas laboratoriais estéreis e conduzidos sob uma coifa de fluxo laminar de acordo com as diretrizes do NIH. A Figura 1 demonstra uma apresentação esquemática do protocolo de estudo para as diferentes etapas de E. granulosus .

1. Coleta de cistos de hidátida

1. Recolher cistos de hidátínio hepático de ovelhas naturalmente infectadas rotineiramente abatidos em um matadouro.
2. Esterilize completamente a superfície do cisto usando gaze estéril e 70% de álcool antes de aspirar os protoscolés (PSCs).
3. Aspire 20-50 mL de fluido de hidátido em tubos cônicos estéreis de 50 mL.
4. Depois de drenar, limpe o cisto com uma lâmina afiada, transfira a camada germinal em um tubo cônico estéril de 50 mL e agite-o por um curto período (~2 min) para aumentar a coleta de PSCs. Transfira a camada germinal para um novo tubo de 1,5 mL para caracterização molecular.
5. Lave os PSCs 3-5x com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS).
6. Observe os PSCs em eosina de 0,1% por 5 minutos para determinar a viabilidade do PSC sob um microscópio leve. Use PSCs com pelo menos 95% de viabilidade para cultura.
7. Trate o PSC precipitado com 2 mL de pepsina (2 mg/mL, pH 2) por 15-20 min.
8. Para isolar PSCs individuais, resuspenque o sedimento PSC em PBS e passe-o através de duas camadas de gaze estéril em um novo tubo cônico estéril de 50 mL.
   NOTA: Calcule a média de três contagens em 50 μL de sedimentos PSC usando um microscópio leve. Para ensaios subsequentes, use o valor estimado para determinar PSCs/μL. Cada isolado de cisto de hídida deve ser caracterizado com base em polimorfismos de nucleotídeos por métodos moleculares, como pcr-sequenciamento¹⁷ ou análise de curva de fusão de alta resolução¹⁸.

2. Cultivo bifásico de PSCs de E. granulosus para obter vermes adultos

NOTA: Os PSCs isolados devem ser cultivados em condições estéreis sob um gabinete de fluxo laminar Classe II. Prepare as fases sólidas e líquidas do meio de cultura bifásica separadamente antes de prosseguir para os próximos passos¹⁹.

1. Prepare o meio de cultura bifásica para consistir em duas fases.
   1. Para a fase sólida, adicione 10 mL de soro bovino a um frasco de 25 mL e deixe-o coagulado a 76 °C por 20-30 min.
   2. Para a fase líquida (CMRL modificada), misture 100 mL de soro de bezerro fetal inativado a calor (FCS), 36 mL de extrato de levedura de 5%, 5,6 mL de 30% de glicose (em água destilada), 1,4 mL de 5% de bile de cão em PBS, tampão HEPES de 20 mM e 10 mM NaHCO₃ em 260 mL de cmrl-1066 médio. Por fim, adicione penicilina (100 UI/mL) e estreptomicina (100 mg/mL) à mistura.
2. Adicione 10 mL do meio de fase líquida a cada frasco de cultura^{de 25 cm 2} .
3. Adicione ~5.000 PSCs ao frasco de cultura e transfira o frasco para a incubadora de CO₂ (37 °C, 5% CO₂).
4. Após 24-48 h, transfira os PSCs para um novo frasco com a fase sólida (soro bovino) e adicione 1 mL do mesmo meio de fase líquida fresca por frasco. Transfira os frascos para a incubadora de CO₂ (37 °C, 5% DE CO₂).
5. A cada 5 a 7 dias, substitua o meio por meio de fase líquida fresca com base em mudanças na cor do meio de cultura e na proporção estimada de PSCs diferenciados.
   NOTA: Os protoscolés respondem rapidamente às mudanças ambientais após serem cultivadas, e a maioria delas sofre diferenciação dentro de 2-3 semanas. Devido ao consumo de nutrientes e ao crescimento e desenvolvimento de protoscolés, o pH do meio cultural muda, e sua cor muda para laranja e amarelo.

3. Cultivo monofásico de PSCs de E. granulosus

1. Certifique-se de que o cultivo monofásico seja feito 24-48 h antes da transdução.
   1. Cultura ~5.000 PSCs em um frasco de cultura de 25 cm² com RPMI e 10% de soro bovino fetal (FBS).
   2. Transfira os frascos para a incubadora de CO₂ (37 °C, 5% DE CO₂) até usar.

4. Cultura celular para produção e preparação de vírus

NOTA: As células de rim embrionário humano 293T (HEK293T) foram obtidas para a produção de vetores do Centro de Pesquisa de Patologia e Células-Tronco da Universidade kerman de Ciências Médicas.

1. Transfira 5 ×¹⁰ células HEK293T para um frasco de^{25 cm 2} contendo 5 mL de DMEM com 10% de FBS, penicilina de 100 U/mL e estreptomicina de 100 μg/mL.
2. Incubar as células HEK293T a 37 °C em 5% de CO₂ e passá-las no meio de cultura completa a cada 48 h. Por fim, use células HEK293T de baixa passagem para transdução²⁰.

5. Produção e preparação do vírus com os vetores lentivirais de terceira geração

NOTA: O vetor de lentivírus pCDH513b (vetor de transferência) e PLPII, PLPI e PMD2G (vetores auxiliares) foram usados para expressar o gene repórter do GFP. Veja a Tabela de Materiais e Figura Suplementar S1.

1. Dia 1º:
   1. Depois de tentar experimentar as células HEK293T²¹ em placas de cultura de 6 poços, a semente 7 × 10⁴ células por poço com DMEM fresco sem antibióticos contendo 10% de FBS.
   2. Use células com confluência de 50%-60% para transdução pelo método fosfato de cálcio.
2. Dia 2:
   1. Substitua o meio de cultura celular 2-3 h antes do experimento com DMEM fresco sem antibióticos contendo 2% de FBS.
   2. Em um tubo de 1,5 mL, misture os plasmídeos lentivirais de terceira geração, incluindo 7 μg/μL pCDH513b (vetor de transferência), 4 μg/μL PLPII, 4 μg/μL PLPI e 2 μg/μL PMD2G (vetores auxiliares).
   3. Adicione o buffer HEPES (0,28 M NaCl, 0,05 M HEPES e 1,5 mM Na₂HPO₄; faixa de pH ideal, 7,00-7,28) à mistura a um volume de 422 μL.
   4. Adicione 16 μL de 1% de tampão Tris-EDTA (TE) à mistura.
   5. Adicione 62 μL de cloreto de cálcio de 2,5 mM aos tubos e misture bem.
   6. Adicione 500 μL de soro fisiológico 2x com tampo de HEPES (HBS) à mistura, gota a gota, dentro de 1-2 min usando uma pipeta Pasteur. Misture suavemente até obter uma solução semi-opaca e incubar a mistura por 20 minutos à temperatura ambiente.
   7. Adicione a mistura a cada prato lentamente e distribua-a com movimentos circulares lentos.
   8. Incubar as placas a 37 °C em uma incubadora de CO₂ de 5% e substituir o meio após 4-6 h por DMEM sem antibióticos contendo 10% de FBS.
3. Dia 3:
   1. Confirme a transdução transitória bem sucedida e a viabilidade celular usando um microscópio de fluorescência invertida.
4. Dia 4:
   1. Colher vírus do meio de cultura coletando o supernanato de cada poço e armazená-los a -70 °C até o uso.
      NOTA: As lentivírus colhidas podem ser concentradas e tituladas para transfecção precisa²².

6. Transdução transitória de diferentes estágios de E. granulosus com o vírus

1. Dia 1º:
   1. Use uma placa de cultura de 12 poços para transferência de genes. Cultura 5 × 10^3-5 × 10 células HEK293T em triplicado, com meio DMEM completo como referência interna.
   2. Cultura 150 PSCs frescos em triplicado em RPMI e 10% FBS.
   3. Cultura 30 vermes estrogonofados em triplicado em DMEM contendo FBS 10% inativados pelo calor.
      NOTA: Todas as mídias de transdução devem ser livres de antibióticos. Mantenha três poços de controle não tratados para células HEK293T, PSCs e worms estrofes no processo.
   4. Prepare uma mistura de 1 × 10⁶ vírus com reagente de transfecção de 4 μg/mL (ver a Tabela de Materiais) para transduzir as células HEK293T e diferentes estágios do verme.
   5. Adicione a mistura a cada prato lentamente e distribua-a com movimentos circulares lentos. Incubar as placas por 4-6 h em uma incubadora de CO₂ (37 °C, 5% CO₂). Substitua o meio por cada amostra pelo mesmo meio de cultura completo para minimizar os efeitos tóxicos do reagente de transfecção.
2. Dia 2:
   1. Repita as etapas 6.1.4-6.1.5 para aumentar a eficiência da transdução transitória para as células HEK293T, PSCs e worms estrofiados.
   2. Incubar todas as placas por 24-48 h em uma incubadora de CO₂ com as mesmas condições de cultura baseadas no tipo de mídia celular.
3. Dia 3:
   1. Verifique se a transdução é bem sucedida usando microscopia de fluorescência.
      NOTA: Considere usar outros ensaios confirmatórios como PCR/qPCR^20,23 ou ocidentais manchando²⁴ técnicas no procedimento de transferência de genes.

Aqui, descrevemos uma técnica de transdução transitória rápida e eficiente em E. granulosus usando vetores lentivirais de terceira geração. Nós cultuamos PSCs em um meio de cultura bifásica para obter vermes estrofes, como descrito anteriormente25,26. Protoscolés se desenvolvem em vermes estrobofâneos após 6 semanas in vitro. Diferentes estágios de E. granulosus foram observados no meio de cultura bifásica, incluindo PSCs invaginados (Figura 2A), PSCs evagidos (Figura 2B) e vermes estrofados com primeira e terceira formação proglottid (Figura 2C-E). Os protoscoleces e os vermes estrogonofados obtidos a partir de culturas monofásicas e bifásicas, respectivamente, foram transfeinados com lentivírus expressos em GFP (Figura 3). Para evitar efeitos de autofluorescência, observações microscópicas foram comparadas com a fluorescência de fundo nos três grupos de amostras, e todas as amostras acima desse nível de fundo foram consideradas transfeminadas.

Ajustamos a iluminação do campo e reduzimos o obturador para evitar qualquer possível emissão de autofluorescência nas amostras de controle para cada tratamento. Verificamos então amostras lentiviras tratadas por vetores, em que a emissão de luz verde contra um campo negro foi considerada transdução transitória eficaz. Células HEK293T - o controle do processo de transdução transitória - claramente expressa GFP (Figura 3D). Os vermes adultos expressaram GFP mais distintamente na camada tegumental (Figura 3F); no entanto, os PSCs demonstraram um nível um pouco mais baixo de expressão GFP após 48 h. Alguns resíduos de fluidos de cisto e/ou detritos de camada germinal ao redor dos PSCs causaram alguma fluorescência ao fundo nas amostras transfeminadas. A intensidade da fluorescência nas células HEK293T e vermes estroboscópicos aumentou após 24 h e 48 h (pequenas alterações foram observadas em PSCs).

Figura 1: Apresentação esquemática do protocolo de estudo. Abreviação: PSCs = protoscoleces. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Os diferentes estágios de Echinococcus granulosus no meio da cultura bifásica. (A) PSCs invaginados, (B) PSCs evagidos, (C, D) vermes no processo de estromabilização, (E) vermes estrogonofeados com terceira formação proglote, (F) vermes em diferentes estágios de estrobilização no meio da cultura. Barras de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Transdução transitória de diferentes estágios de Echinococcus granulosus e a linha celular de controle em microscopia de luz e fluorescência. (A,D) células HEK293T como controle de processo de transdução, (B, E) protoscoleces e (C, F) vermes estrobilizados. (G, H, I) Microscopia de luz mista e florescence. Barras de escala = 50 μm, 100 μm e 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar S1: Mapa da clonagem cDNA pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro cDNA. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.