Transdução Transitória das Formas Estrofes estropidas de Echinococcus granulosus

Summary

Descrevemos uma técnica de transdução transitória rápida em diferentes estágios de desenvolvimento do Echinococcus granulosus usando vetores lentivirais de terceira geração.

Abstract

A echinocococose cística ou doença hídátida é uma das doenças parasitárias zoonóticas mais importantes causadas pelo Echinococcus granulosus, uma pequena tênia abrigada no intestino dos caninos. Há uma necessidade urgente de pesquisa genética aplicada para entender os mecanismos da patogênese e controle e prevenção de doenças. No entanto, a falta de um sistema de avaliação genética eficaz impede a interpretação direta da genética funcional dos parasitas cestode, incluindo as espécies de Echinococcus . O presente estudo demonstra o potencial da transdução transitória de genes lentiviral nas formas metacestode e estrobólicas de E. granulosus. Os protoscolés (PSCs) foram isolados de cistos de hidátíndicos e transferidos para meios específicos de cultura bifásica para se desenvolverem em vermes estrofiados. Os vermes foram transfectados com lentivírus de terceira geração colhidos, juntamente com células HEK293T como um controle de processo de transdução. Uma fluorescência pronunciada foi detectada nos vermes estroboscópicos ao longo de 24 h e 48 h, indicando transdução lentiviral transitória em E. granulosus. Este trabalho apresenta a primeira tentativa de transdução transitória baseada em lentivírus em tênias e demonstra os resultados promissores com potenciais implicações em estudos experimentais sobre biologia de vermes planos.

Introduction

A echinocococcose cística (CE) é uma das doenças helmintos mais importantes causadas pelo Echinococcus granulosus, uma pequena tênia dentro da família Taeniidae ^1,2. Foram realizados estudos extensivos sobre o desenvolvimento de imunodiagnósticos e vacinas para e. granuloso. No entanto, o conhecimento inadequado sobre a base molecular da biologia dos parasitas apresenta grandes limitações no diagnóstico, manejo e prevenção da doença hídida 3,4,5,6.

Protocol

Este estudo foi aprovado pelo Instituto Nacional de Desenvolvimento de Pesquisas Médicas e pelo Comitê de Revisão de Ética em Pesquisa, nº 958680. Os lentivírus são classificados como organismos BSL-2; portanto, todos os procedimentos de cultura laboratorial neste protocolo foram realizados utilizando práticas laboratoriais estéreis e conduzidos sob uma coifa de fluxo laminar de acordo com as diretrizes do NIH. A Figura 1 demonstra uma apresentação esquemática do protocolo de estudo para as diferentes etapas de E. granulosus .

1. Coleta de cistos de hidátida

1. Recolher cistos d....

Results

Aqui, descrevemos uma técnica de transdução transitória rápida e eficiente em E. granulosus usando vetores lentivirais de terceira geração. Nós cultuamos PSCs em um meio de cultura bifásica para obter vermes estrofes, como descrito anteriormente^25,26. Protoscolés se desenvolvem em vermes estrobofâneos após 6 semanas in vitro. Diferentes estágios de E. granulosus foram observados no meio de cultura bifásica, incluindo PSCs invaginados (<.......

Discussion

Compreender a base molecular de nematoides e platyhelminthes biologia é crucial para entender a patogenicidade dos parasitas zoonóticos²⁷. A falta de um sistema de avaliação genética eficaz é um grande obstáculo para a interpretação direta da genética funcional dos parasitas cestode, incluindo a espécie Echinococcus ^12,27. O presente estudo demonstra o excelente potencial do lentivírus na transdução transitória de E. granulosu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placas de cultura de 12 poços	SPL Life Sciences	30012
25 cm2 frasco de cultura	SPL Life Sciences	70325
Placas de cultura de 6 poços	SPL Life Sciences	30006
Cloreto	de cálcio Sigma-Aldrich	C4901-500G	Concentração de trabalho: 2,5  mM
CMRL 1066 médio	Thermo Fisher Scientific	11530037
CO2 incubadora	memmert	ICO150
D-(+)-glicose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
DMEM	Life Technology	12100046
bile			Isolado de um cão eutanasiado e esterilizado por 0,2 μ m filtro de seringa
Eosin Y	Sigma-Aldrich	E4009-5G	prepara 0,1% de Eosin para teste de exclusão de trabalho
Soro Fetal Bovino (FBS)	DNAbiotech	DB9723-100ml	Inativação por calor  de  FBS (30 min em 40 &graus; C)
Soro de Bezerro Fetal (FCS)	DNAbiotech	DB9724-100ml	Inativação por calor  de  FCS (30 min em 40 ° C)
Células HEK293T	BONbiotech	BN_0012.1.14	Rim embrionário humano 293T
HEPES tamponado com solução salina (HBS)	Sigma-Aldrich	51558-50ML	2x
concentrado Microscópio de fluorescência invertida	OLYMPUS	IX51
Penicilina	Sigma-Aldrich	P3032-10MU	Concentração de trabalho: 100 UI / mL
Pepsina	Roche	10108057001	Concentração de trabalho: 2 mg/mL, pH 2
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	DNAbiotech	DB0011	Este reagente resolve em menos de 1 min em D.W
Polybrene (reagente de transfecção)	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
Meio RPMI	BioIdea	BI-1006-05
Bicarbonato de sódio (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761-1KG
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S9137-25G	Concentração de trabalho: 100 μ g/mL
Plasmídeo lentiviral de terceira geração (pCDH513b)	SBI System Biosciences (BioCat GmbH)	CD513B-1-SBI	Vetor de transferência (obtido comercialmente do Departamento de Pesquisa em Medicina Molecular do Centro Acadêmico Iraniano de Educação, Cultura e Pesquisa (ACECR), Mashhad, Irã)
Plasmídeo lentiviral de terceira geração (pLPI e pLPII)	Invitrogen (Life Technologies)	K4975-00	Vetor auxiliar (obtido comercialmente do Departamento de Pesquisa em Medicina Molecular do Centro Acadêmico Iraniano de Educação, Cultura e Pesquisa (ACECR), Mashhad, Irã)
Plasmídeo lentiviral de terceira geração (pMD2G)	Addgene	Plasmid 12259	Vetor auxiliar (obtido comercialmente do Departamento de Pesquisa em Medicina Molecular do Centro Acadêmico Iraniano de Educação, Cultura e Pesquisa (ACECR), Mashhad, Irã)
Tampão Tris/EDTA (TE)	DNAbiotech	DB9713-100ml
Tripsina	Sigma-Aldrich	T9935-50MG	1x soluções de trabalho (pH 7.4– 7.6)