Avaliação quantitativa da macropinocitose em células hiperativas mTORC1 usando citometria de fluxo

Resumo

Este protocolo fornece ferramentas experimentais para avaliar a absorção macropinocítica de nutrientes (carboidratos e proteínas) por células hiperativas mTORC1. Etapas detalhadas para quantificar a captação de dextrano marcado com fluorescência e albumina de soro bovino (BSA) são descritas.

Resumo

A macropinocitose é um processo endocítico altamente conservado, dependente de actina, que permite a captação de material extracelular, incluindo proteínas e lipídios. Nas células em proliferação, a macropinocitose pode fornecer nutrientes extracelulares ao lisossomo, processados em blocos de construção críticos de macromoléculas. Estudos recentes destacaram a dependência de múltiplos cânceres na macropinocitose, incluindo câncer de mama, colorretal e pancreático. Acredita-se que as mutações Ras sejam os eventos condutores por trás do início da macropinocitose, levando à ativação de processos anabólicos celulares por meio da via de sinalização mTORC1. Curiosamente, o mTORC1 também pode ser ativado por macropinocitose independentemente de Ras. Portanto, a macropinocitose representa uma vulnerabilidade metabólica que pode ser aproveitada para atingir tumores macropinocíticos, limitando seu acesso a nutrientes terapeuticamente.

No Complexo de Esclerose Tuberosa (TSC) e na Linfangioleiomiomatose (LAM), a hiperativação do mTORC1 leva ao aumento da macropinocitose e à reprogramação metabólica. Aqui, descrevemos um protocolo baseado em citometria de fluxo para avaliar quantitativamente a macropinocitose em células de mamíferos. MEFs deficientes em TSC2 são empregados, que exibem ativação aberrante de mTORC1 e demonstraram ter macropinocitose aumentada em comparação com células que expressam TSC2. As células tratadas com inibidores farmacológicos da macropinocitose são incubadas com dextrana de 70 kDa marcada com fluorescência, fixável por lisina, ou albumina de soro bovino marcada com fluorescência (BSA) ensaiada por citometria de fluxo. Até o momento, técnicas robustas baseadas em imagens foram desenvolvidas para avaliar quantitativamente a macropinocitose em células tumorais in vitro e in vivo. Esta análise fornece uma avaliação quantitativa da macropinocitose em múltiplas condições experimentais e complementa as técnicas existentes baseadas em imagens.

Introdução

A macropinocitose é um processo endocítico dedicado à captação em massa de material extracelular seguido pela formação de macropinossomos, reciclados na membrana plasmática ou fundidos com lisossomos para degradar a carga internalizada ^1,2. Embora a absorção de carga não seja seletiva, a macropinocitose é um processo de várias etapas, rigidamente regulado por Rab GTPases e fosfolipídios de membrana ^3,4. Notavelmente, as células cancerígenas empregam macropinocitose para internalizar nutrientes extracelulares, incluindo proteínas, polissacarídeos e lipídios. A macropinocitose em células cancerígenas é ativada por oncogenes a jusante de Ras ou v-Src como um mecanismo para apoiar sua proliferação, especialmente sob condições de estresse nutricional ^5,6. Portanto, a macropinocitose representa uma nova abordagem terapêutica para atingir as células cancerígenas, interrompendo as vias de absorção de nutrientes ^7,8.

No Complexo de Esclerose Tuberosa (TSC) e na Linfangioleiomiomatose (LAM), a perda de mutações funcionais em TSC1 ou TSC2 leva à hiperativação do alvo mamífero/mecanicista do complexo de rapamicina 1 (mTORC1)⁹. A ativação aberrante do mTORC1 é conhecida por conduzir uma extensa reprogramação metabólica, incluindo captação e utilização de glicose e glutamina, síntese aprimorada de ácidos nucléicos, síntese lipídica e autofagia^10,11. Para compensar essas demandas anabólicas aumentadas, as células hiperativas mTORC1 aumentam a absorção de nutrientes exógenos via macropinocitose e aumentam a degradação lisossômica da carga internalizada¹². Em trabalhos recentes, identificamos a ritanserina, um inibidor da diacilglicerol quinase alfa (DGKA) como um agente que inibe seletivamente a proliferação de células deficientes em TSC2 ¹³. A DGKA é uma quinase lipídica que metaboliza diacilglicerol em ácido fosfatídico (PA)¹⁴. O PA é uma molécula mensageira crucial que também desempenha um papel vital na manutenção da homeostase da membrana celular. Surpreendentemente, a ritanserina inibe fortemente a macropinocitose reprogramando o metabolismo fosfolipídico em células deficientes em TSC2. Portanto, direcionar a via de captação de nutrientes da macropinocitose em células deficientes em TSC2 pode fornecer novas abordagens terapêuticas em TSC e LAM.

A quantificação da captação de macropinocíticos in vitro e in vivo pode fornecer informações cruciais sobre a regulação da formação de macropinossomas e acelerar a descoberta de mecanismos moleculares, ao mesmo tempo em que identifica novas abordagens terapêuticas ^2,6. Até o momento, várias metodologias foram desenvolvidas para quantificar adequadamente a captação macropinocítica de dextrano fluorescente in vitro e in vivo ^2,15. Aqui descrevemos uma abordagem baseada em citometria de fluxo para avaliar diretamente a quantidade de dextrana e albumina internalizadas em células hiperativas mTORC1 (Figura 1). Este método pode ser utilizado para analisar várias condições experimentais em paralelo e complementa as abordagens existentes baseadas em imagens.

Figura 1. Fluxo de trabalho para a avaliação da macropinocitose em células de mamíferos. As células são semeadas em placas de seis poços e posteriormente tratadas com compostos de interesse. Dextrana fluorescente ou BSA são adicionados por 60 min, e a absorção é inibida pela lavagem com PBS gelado. As células são fixadas usando paraformaldeído e a intensidade de fluorescência é quantificada por citometria de fluxo. As células são fechadas e os dados são analisados com o software apropriado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

1. Tratamento celular

Dia 1

1. Semear fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) deficientes em TSC2 e que expressam TSC2 em triplicata, em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de seis poços usando DMEM, suplementado com 10% de FBS. As células devem estar 60-70% confluentes no dia 3.
   1. Semeie poços de controle adicionais para cada condição de medicamento que não será corada com FITC-Dextran ou TMR-BSA.

Dia 2

2. Aspire cuidadosamente o meio e enxágue as células duas vezes com PBS em temperatura ambiente.
   1. Trate as células com veículo (DMSO), 100 μM de ácido fosfatídico (PA), 25 μM de EIPA, 10 μM de ritanserina ou uma combinação de PA e ritanserina. Use DMEM suplementado com 1% de FBS.
      NOTA: O volume de DMSO deve ser igual ao volume máximo de solvente usado no tratamento de condições. Por exemplo, se forem utilizados 10 μL de EIPA, o volume de DMSO nas condições do veículo também deve ser de 10 μL.

Dia 3

3. Substitua o meio por DMEM sem soro contendo os medicamentos acima mencionados e 0,5 mg / mL de FITC-Dextran ou 0,5 mg / mL de TMR-BSA 16 h após o tratamento. Incubar as células em uma incubadora de cultura de células a 37 °C/5% CO₂ por 60 min.
   NOTA: Para minimizar o fotobranqueamento dos fluoróforos, os tubos FITC-Dextran e TMR-BSA devem ser envoltos em papel alumínio e o experimento deve ser realizado em um gabinete de cultura de células com as luzes apagadas.
4. Aspire o meio e lave duas vezes com PBS gelado.
   1. Separar as células usando 500 μL de tripsina. Coloque as células em uma incubadora de cultura de células a 37 °C / 5% de CO₂ por 2-3 min.
      NOTA: Certifique-se de que todas as células estejam destacadas observando-as sob um microscópio de campo claro.
   2. Usando uma ponta de pipeta limpa todas as vezes, colete as células em tubos de 1,5 mL usando DMEM suplementado com FBS a 1% no gelo.
   3. Células de pellets por centrifugação a 425 x g durante 2 min a 4 °C.
   4. Aspire o sobrenadante.
5. Ressuspenda o pellet celular usando 50 μL de paraformaldeído a 2%.
   CUIDADO: O paraformaldeído é altamente tóxico e deve ser manuseado sob uma coifa apropriada. Os resíduos contendo formaldeído devem ser descartados de acordo com as diretrizes institucionais.
   1. Incube as células em temperatura ambiente por 10 min.
   2. Adicione 1 mL de PBS gelado a cada tubo e ressuspenda o pellet celular suavemente. Coloque os tubos no gelo.
6. Centrifugar células a 425 x g durante 2 min a 4 °C.
7. Aspire o sobrenadante.
   1. Ressuspenda o pellet celular em 300 μL de PBS gelado.
   2. Transfira as células para os tubos FACS apropriados no gelo.
   3. Prossiga com a citometria de fluxo.

2. Citometria de fluxo

1. Vortex breve as células antes de inseri-las no suporte de amostra FACS.
2. Usando fluxo de baixa velocidade, bloqueie células vivas de cada amostra não corada (controle negativo) usando a potência do laser apropriada, conforme visto na Figura 2A. Esta etapa difere entre os instrumentos e precisará ser otimizada para cada experimento. Ajuste a potência para dispersão direta (FSC) e dispersão lateral (SSC) para que as células vivas sejam distintas de detritos ou aglomerados de células.
3. Usando o recurso de portão automático, selecione as populações de células vivas para cada amostra, evitando detritos celulares e aglomerados de células.
   NOTA: Todos os eventos celulares (independentemente do gating) são registrados pelo citômetro. Portanto, selecionar uma porta nesta etapa não é crítico.
4. Registre a intensidade de fluorescência de cada amostra usando os lasers verdes ou vermelhos apropriados.

3. Análise por citometria de fluxo

1. Células de porta usando parâmetros de dispersão direta e lateral. Aplique a mesma porta a todas as amostras.
2. Crie histogramas para fluorescência em cada amostra, como na Figura 2B.
3. Dentro de cada porta celular, calcule a intensidade de fluorescência média/mediana para todas as amostras.
4. Exporte dados para análise estatística apropriada.
   NOTA: Durante a análise dos dados, a intensidade média/mediana de fluorescência de cada amostra deve ser normalizada subtraindo-se os valores da amostra não corada.

Resultados

Ritanserina inibe macropinocitose em células deficientes em TSC2
Mostramos anteriormente que a absorção macropinocítica de nutrientes é aumentada em três vezes em células deficientes em TSC2 em comparação com células que expressam TSC2 ¹⁶. No TSC e LAM, a macropinocitose é mediada pela diacilglicerol quinase alfa (DGKA). O produto metabólico da DGKA é o ácido fosfatídico (PA), um componente crucial das membranas celul...

Discussão

Aqui, descrevemos uma abordagem quantitativa para avaliar a macropinocitose usando citometria de fluxo. Este método fornece uma medição precisa e rápida da carga macropinocítica marcada com fluorescência dextrana e albumina. Estudos anteriores caracterizaram cuidadosamente o índice macropinocítico de células cancerígenas usando abordagens de microscopia confocal^15,20. Embora esses métodos quantifiquem com precisão a internalizaçã...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	Gibco	11965-092	Meio de crescimento
EIPA (amilorida)	Sigma Aldrich	A3085	Inibidor de macropinocitose
FBS	R & D Systems	S11150	Soro Bovino Fetal
FITC-Dextran	Invitrogen	D1822	Polissacarídeo fluorescente (70kDa)
Parafolmadeídeo	Pierce	28906	Agente de fixação
PBS	Gibco	10010-023	Tampão fosfato
penicilina / estreptomicina	Sigma Aldrich	P4458-100ML	Antibióticos
de cultura celularÁcido fosfatídico	Avanti	840101P	Fosfolipídio derivado do ovo
Ritanserin	Tocris	1955	Inibidor de DGKA
TMR-BSA	Invitrogen	A23016	Albumina fluorescente
Tripsina	Sigma Aldrich	25300-054	Agente de dissociação