Summary
As explanações de blastoderme de zebrafish são geradas por células embrionárias isolantes de centros de sinalização endógenos dentro do embrião inicial, produzindo aglomerados celulares relativamente ingênuos facilmente manipulados e cultivados ex vivo. Este artigo fornece instruções para fazer tais explantes e demonstra sua utilidade interrogando papéis para sinalização nodal durante a gastrulação.
Abstract
Devido à sua clareza óptica e rápido desenvolvimento, os embriões de zebrafish são um excelente sistema para examinar comportamentos celulares e processos de desenvolvimento. No entanto, devido à complexidade e redundância dos sinais embrionários, pode ser desafiador discernir o papel completo de qualquer sinal durante a embriogênese precoce. Ao explanejar a região animal do blastoderme de zebrafish, são gerados aglomerados relativamente ingênuos de células embrionárias que podem ser facilmente cultivados e manipulados ex vivo. Ao introduzir um gene de interesse pela injeção de RNA antes da expiração, pode-se avaliar o efeito desta molécula na expressão genética, comportamentos celulares e outros processos de desenvolvimento em isolamento relativo. Além disso, células de embriões de diferentes genótipos ou condições podem ser combinadas em uma única explanta quimrica para examinar interações celulares/tecidos e funções genéticas específicas do tecido. Este artigo fornece instruções para a geração de explantes de blastoderm de zebrafish e demonstra que uma única molécula de sinalização - um ligante nodal - é suficiente para induzir a formação de camadas de germes e a morfognese de extensão em tecidos embrionários ingênuos. Devido à sua capacidade de recapitular comportamentos de células embrionárias, gradientes de morfógenos e padrões de expressão genética em um sistema ex vivo simplificado, essas explantas são esperadas como de grande utilidade para muitos pesquisadores de zebrafish.
Introduction
Um objetivo perene do campo da biologia do desenvolvimento é desvendar a complexidade do desenvolvimento de embriões para entender a origem da forma e função animal. Mesmo os embriões primitivos contêm um complexo medley de moléculas de sinalização, interações celulares e tecuais, e forças mecânicas, todas sujeitas a rigorosa regulação espacial e temporal. Por essa razão, muitas vezes é desafiador identificar o papel preciso de um determinado sinal em um processo de desenvolvimento de interesse. Ao remover tecidos embrionários de seu ambiente endógeno, a explantação de embriões cria uma plataforma simplificada para discernir os papéis de desenvolvimento de tecidos e moléculas individuais em isolamento relativo. As técnicas de explantação são talvez mais conhecidas em Xenopus laevis, onde têm sido usadas para estudar indução tecidual, sinalização celular, adesão celular e morfogênese, entre outros processos1,2,3,4. As chamadas explantas da tampa animal, nas quais a região animal do estágio blastula Os embriões xenopus são isolados antes das interações indutivas5,6,7, são uma técnica de explant generalizada e poderosa. As tampas de animais não domesticadas estão fadadas a se tornar emêxtase 7,8. Ainda assim, são competentes para responder a vários fatores indutivos, permitindo-lhes formar tecidos das três camadas de germes e sofrer movimentos morfogenéticos apropriados para o tecido9,10,11. No entanto, ferramentas genéticas limitadas e adequação sub-ideal para imagens vivas impedem o uso de explantes de tampa animal Xenopus para muitos biólogos de desenvolvimento. Ao explanar células de blastoderm de embriões de zebrafish, os pesquisadores podem combinar a utilidade do ensaio da tampa animal com a clareza óptica, abundância de ferramentas genéticas e outras vantagens experimentais do sistema modelo de zebrafish.
Até o momento, os pesquisadores fizeram uso de dois sabores de explantes de zebrafish: os chamados pescoides e as explantas blastoderm. No modelo pescoide, todo o blastoderm, incluindo a zona marginal, é isolado da gema e permitido desenvolver ex vivo sem a camada sinciticional de gema extraembrínica (YSL)12,13. Desta forma, os pescoides têm uma notável semelhança com as explanações da Fundulus geradas décadas atrás por Jane Oppenheimer e J.P. Trinkaus14,15. Essas explantas recapitulam muitos aspectos da padronização embrionária e morfogênese12,13. No entanto, como esses isolados contêm centros de sinalização endógenos (a margem embrionária), eles não são simplificados em relação ao seu meio molecular. Alternativamente, os pesquisadores podem gerar explantes de blastodermia de zebrafish relativamente ingênuos, excluindo a zona marginal16,17,18,19,20,21. Explanações de blastoderme de zebrafish não domesticadas expressam altos níveis de proteína morfogenética óssea (BMP) morfogens19 e dão origem a ectoderme não-neural e camada envolvente (EVL) quando cultivado ex vivo18. No entanto, eles recapitulam muitos aspectos da padronização axial e morfogênese em resposta aos gradientes de sinalização exógena19,20,21, semelhantes às tampas animais Xenopus. Por essa razão, as explanações de blastoderm são um modelo vantajoso para estudar o papel de um determinado morfogênio (ou morfógenos) na especificação da camada de germes, movimentos de células morfogenticas e gradientes de sinalização dentro de um ambiente de sinalização simplificado. Além disso, blastoderms de embriões de diferentes genótipos ou condições podem ser combinados em uma única explantaquimrica 19,21 para investigar a autonomia celular/tecido e interações indutivas.
As explanações de blastoderm de zebrafish podem ser usadas para investigar o papel de sinais embrionários (por exemplo, Nodal) na morfogênese e especificação tecidual durante a gastrulação. Injetando RNA ndr2 sintético (codificando um ligante Nodal) no estágio unicelular, a sinalização nodal é ativada durante todo o blastoderm do embrião. Explantas desses embriões geram gradientes de sinalização nodal, formam as três camadas de germes e sofrem movimentos de expansão e extensão (C&E) como visto em embriões intactos20. Além disso, explantos quiméricos são usados para ilustrar a capacidade dos tecidos de mesoderm de induzir neuroectoderma de blastoderm não injetado (ingênuo). Este protocolo fornece instruções para a criação de explantes de blastoderm de zebrafish e demonstra sua utilidade na definição do papel da sinalização nodal na indução tecidual e morfogênese.
Protocol
1 Prepare os reagentes e suprimentos
- Preparação de reagentes
- Prepare 500 mL da solução 3x Danieau (Solução 1, Tabela 1).
- Prepare 1 L de água de ovo (Solução 2, Tabela 1).
- Prepare uma solução de 1,2% de agarose em água de ovo. Derreta a agarose inteiramente no micro-ondas e depois esfrie a 55 °C em um banho de água.
- Prepare 4 mL de mídia de explant (Solução 3, Tabela 1, modificada ligeiramente a partir de19,21) por condição experimental.
NOTA: Lembre-se de contabilizar pelo menos um poço de explants de embriões não injetados (ou controlados injetados) no cálculo do volume necessário.- Higienize o espaço de trabalho com 70% de etanol.
- Remova a mídia de cultura celular a partir de 4 °C e pulverize/limpe com 70% de etanol.
- Faça mídia de explant e coloque na incubadora de 28,5 °C para aquecer enquanto os embriões são injetados.
NOTA: Inclua sempre embriões de irmãos intactos e com correspondência etária para fins de encenação. Descorpor esses embriões e cultuá-los em placas revestidas de agarose na solução 0,3x Danieau (Solução 4, Tabela 1).
- Remova as alíquotas de pronase (1 mL a 20 mg/mL) a partir de -20 °C e deixe descongelar no gelo. Descongele uma alíquota de 1 mL para cada três condições experimentais.
- Prepare placas de ágarose
- Faça as placas de injeção.
- Encha uma placa de Petri de plástico de 100 mm x 15 mm no meio do caminho com agarose derretida na água do ovo.
- Coloque suavemente o molde de injeção em cima da agarose derretida em um ângulo de 45° e abaixe-o gradualmente para a agarose, garantindo que nenhuma bolha esteja presa por baixo. Deixe esfriar completamente.
- Remova o molde. Use a placa imediatamente ou guarde para depois adicionando 2 mL de água de ovo, embrulhando a placa e armazenando-a a 4 °C. Aqueça a placa por 15-30 min na incubadora de 28,5 °C antes da injeção.
- Faça placas de corte de explanta.
- Adicione 3 mL de 1,2% de água de ovo a uma placa de Petri de 60 mm x 15 mm, garantindo que todo o fundo do poço esteja revestido. Deixe esfriar completamente.
- Casaco de pratos de cultura com agarose.
- Para cada condição experimental, dispense 1 mL de 1,2% de derretimento em água de ovo em um poço de uma placa de 6 poços, garantindo que toda a parte inferior do poço seja revestida. Deixe esfriar completamente.
- Para fazer explants quiméricos, crie uma placa de corte de explant com pequenos poços adicionando doze contas de vidro de 1 mm a agarose derretida em uma placa de Petri de 60 mm x 15 mm. Remova as contas com fórceps assim que a agarose esfriar completamente.
- Faça as placas de injeção.
2 Injetar embriões com RNA
- Usando luvas, remova uma alíquota de ndr2 mRNA sintético do armazenamento a -80 °C e coloque-a imediatamente no gelo.
- Prepare a agulha de injeção.
- Encha uma agulha capilar de vidro puxada com RNA. Coloque a agulha cheia em um micromedutor e quebre a ponta da agulha com fórceps.
- Calibrar o volume de injeção usando um micrômetro de estágio com uma gota de óleo mineral, ajustando o tempo de injeção e a pressão no injetor pneumático para obter um bolus do tamanho desejado. Um bolus com diâmetro de 120 μm tem um volume de 1 nL.
NOTA: O volume desejado do bolus dependerá da concentração do RNA e da dose desejada por embrião. Por exemplo, se o RNA for aliquotado a 10 ng/μL, injete 1 nL para alcançar uma quantidade final de 10 pg.- Mantenha a ponta da agulha de RNA submersa no óleo até estar pronta para injetar.
- Carregue os embriões e injete.
- Puxe os divisores em tanques de reprodução, permita que os peixes desovem por 10-15 minutos, e colete os embriões usando um coador de chá.
- Coloque os embriões na placa de injeção usando uma pipeta Pasteur e uma bomba de pipeta e, em seguida, use um dedo enluvado para pressionar os ovos nos cochos suavemente.
- Injete 10 pg ndr2 RNA na gema de embriões unicelulares até que o número desejado de embriões seja atingido ou até que os embriões comecem a se dividir.
NOTA: Não injete após o estágio unicelular para garantir a distribuição uniforme do RNA em todo o embrião. - Lave os embriões da placa de injeção em uma placa de Petri de 100 mm x 15 mm com um fluxo suave de água de ovo de uma garrafa de espremer.
NOTA: Mantenha sempre um grupo de irmãos com idade compatível e não injetados como controles. - Coloque os embriões na incubadora de 28,5 °C até atingirem o estágio de 128 células. Remova ovos não fertilizados e embriões mortos do prato.
3 Deschorionato os embriões
- Uma vez que os embriões tenham chegado ao estágio de 128 células, coloque-os em pratos de vidro rotulados e decantar o máximo de água de ovo possível deles.
- Rotular pratos cristalizadores de vidro com fita de laboratório (correspondente a nomes de pratos pequenos) e encher 2/3 do caminho com água de ovo. Coloque esses pratos ao lado do microscópio de dissecação para uma acessibilidade rápida.
- Adicione 1 mL de estoque de pronase (20 mg/mL, descongelado no gelo) a 15 mL de solução 3x Danieau em um tubo cônico de 50 mL.
NOTA: Este montante é suficiente para até três condições experimentais. Aumente o volume de pronase e a solução 3x Danieau para condições adicionais de explant.
ATENÇÃO: Pronase é irritante; portanto, use luvas ao manusear. - Adicione pelo menos 5 mL de solução de pronase a cada placa de vidro Petri contendo embriões.
- Agitar os pratos de vidro em um movimento circular, monitorando o progresso da descorção consistentemente sob um microscópio dissecando.
- Uma vez que os acordes começam a enrugar e 1-2 embriões estão fora de seus acordes, mergulhe cuidadosamente a placa de vidro Petri contendo pronase e os embriões no prato de cristalização de vidro correspondente contendo água de ovo.
- Lave os embriões desocorados.
- Lave os embriões três vezes com água de ovo adicionando delicadamente e, em seguida, decantando a água do ovo do prato.
- A terceira e última lavagem é com a solução de 0,3x Danieau.
NOTA: Se os embriões ainda tiverem corões após a lavagem, pipeta suavemente os embriões até que os acordes sejam removidos ou deixe-os sentar na lavagem (água do ovo ou solução de Danieau 0,3x) por um minuto ou dois e agitar suavemente com movimentos circulares.
- Cubra embriões desocupados com uma tampa de placa de Petri e devolva-os à incubadora (28,5 °C) até atingirem o estágio de 256 células.
4 Explantes de corte
- Encha a placa de Petri revestida de 60 mm x 15 mm com solução danieau 3x.
- Uma vez que os embriões estejam no estágio de 256 células, transfira-os para a placa revestida de agarose contendo 3x a solução de Danieau, alinhando-os ao longo do centro do prato.
- Corte as explantes usando fórceps(Figura 1).
- Use um par de fórceps, mantidos fechados, para estabilizar o embrião e usar o outro para cortar o blastoderm a aproximadamente metade de sua altura (da margem ao polo animal)(Figura 1A).
- Para cortar, aperte suavemente as células de blastoderm com um par de fórceps. Em seguida, pegue os fórceps estabilizantes e execute-os ao longo dos outros fórceps para cortar aproximadamente metade do blastoderm(Figura 1B).
- Gire o embrião, colocando as fórceps no corte existente e, em seguida, corte o ortopedia do blastodermo restante ao primeiro corte(Figura 1C).
- Mantenha explantas na solução 3x Danieau por pelo menos 5 minutos para curar, em seguida, transfira-as para o poço de uma placa de 6 poços revestida com agarose e preenchida com 4 mL de mídia explant.
NOTA: Corte explantas de irmãos não injetados (ou controle injetado) como controles negativos. Se as explanações forem realizadas corretamente, essas explanações não se estenderão nem expressarão marcadores de endoderme, mesoderme ou neuroectoderme. - Coloque as placas de cultura de explanta na incubadora de 28,5 °C até que o ponto de tempo/estágio desejado (determinado a partir de irmãos intactos) seja alcançado.
NOTA: Se tratar explantas com um composto, como um pequeno inibidor de moléculas, a concentração desejada pode ser adicionada diretamente à mídia explant dentro dos poços nos pontos de tempo desejados. Lembre-se de incluir o volume de agarose no cálculo das concentrações. (Exemplo: 1 mL agarose + 4 mL de mídia explant = volume total de 5 mL por poço).
5 Preparem explants quiméricos
- No lugar de uma placa recorada regular, corte explants quiméricos em um prato com agarose moldada em doze poços pequenos e rasos usando contas de vidro de 1 mm (seção 1.2.4). Encha este prato com 3x solução Danieau.
NOTA: Explantas quimricas são geradas a partir de células blastoderm de dois embriões de genótipos ou condições diferentes. Certifique-se de que essas condições possam ser distinguidas umas das outras pela expressão de marcadores fluorescentes transgênicos ou injetados.- Prepare-se adicionando doze embriões de um genótipo/condição ao lado esquerdo da placa e doze embriões do outro genótipo/condição ao lado direito da placa.
- Mova um embrião de cada condição para o centro da placa, perto de um dos 12 poços.
- Usando fórceps, corte uma explanta de cada embrião como descrito para explantes de embriões únicos (etapa 4.3).
- Pressione rapidamente as bordas cortadas das duas explantas juntas dentro do poço raso usando fórceps para permitir que as duas metades se curem juntas em uma única explanta.
- Continue com os onze poços restantes dentro da placa. Uma vez que as explantas sejam curadas, transfira-as para o poço de uma placa de 6 poços revestida com agarose e preenchida com 4 mL de mídia explant. Repita até que o número desejado de explants seja alcançado.
6 Cultura e/ou imagem das explantas fixas
- A cultura explanta na incubadora de 28,5 °C até que embriões de irmãos intactos atinjam o estágio desejado.
- Explantas ao vivo podem ser montadas para imagens contínuas de lapso de tempo, imagens periodicamente durante todo o período de cultura ou imagens ao vivo no ponto final experimental.
- Fixar as explantas, se desejar. Uma vez que as explanações atinjam o ponto final desejado, observe o estágio dos irmãos embriões intactos e coloque as explanações em um frasco de cintilação de vidro com 1 mL de 4% de paraformaldeído na PBS. Fixar durante a noite em um agitador a 4 °C.
ATENÇÃO: O paraformaldeído é tóxico. Use luvas ao manusear este produto químico e descarte-o através de métodos aprovados por cada instituição.- Após a fixação, enxágue explantas seis vezes, 15 min cada com PBS + 0,1% Tween-20, e desidratar gradualmente em metanol. Armazene explants a -20 °C para análise posterior pelo conjunto de hibridização in situ, coloração imunofluorescente, etc.
Representative Results
Ligantes nodais impulsionam formação de camada de germes e C&E de explanações de blastoderm de zebrafish
Explants de controle cortados de embriões do tipo selvagem não injetados (WT) ou aqueles injetados com 50 pg de proteína fluorescente verde codificadora de mRNA (GFP) permaneceram arredondados durante todo o período de cultura (Figura 2A-C) e não expressaram marcadores de mesoderme, endoderme ou neuroectoderme(Figura 3C)20. Juntos, estes indicam ausência da morfogênese e formação de camada de germes que caracterizam a gastrulação de vertebrados. No entanto, explanações cortadas de embriões injetados com 10 pg de ndr2 mRNA tornaram-se altamente alongadas após 8-9 h na cultura(Figura 2D). Imagens de lapso de tempo ao vivo dessas explants por microscopia de contraste de interfering diferencial (DIC) revelaram que os inícios de extensão em ou em torno de 8h pós-fertilização (hpf)(Figura 2F),ao mesmo tempo em que a morfogênese C&E começa em embriões de zebrafish intactos22. Explantas cortadas de MZoep-/- embriões, que não possuem o co-receptor tdgf1 Nodal23,não se estenderam em resposta à injeção de ndr2 (Figura 2E),demonstrando que a atividade nodal é fundamental para esta morfogênese ex vivo. Além disso, a hibridização completa in situ mostrou ainda que explants expressantes ndr2expressam marcadores expressos de neuroectoderme (sox2) e vários subtipos de mesoderme(tbxta, noto, tbx16)(Figura 2G),bem como o endoderme e o organizador embrionário20.
Sinalização nodal não é necessária para indução de neuroectoderm pelo mesoderm
A atividade de sinalização nodal é essencial para a indução de endodermia e a maioria do mesoderm, mas é dispensável para especificação de neuroectoderm dentro do gastrulae de zebrafish23,24. Enquanto as explanações de blastoderme de zebrafish não injetadas não se diferenciam no neuroectoderme(Figura 3C18),explantes de embriões injetados com 10 pg ndr2 apresentaram expressão robusta do marcador de neuroectoderme sox2 em listras distintas ao longo do eixo longo da explanta (Figura 2G),indicando que a atividade nodal é necessária para a formação de neuroectoderm ex vivo. Há muito se sabe que os tecidos mesodérmicos podem induzir tecido neural25,26,27,28,29, inclusive em explanações de blastoderme de zebrafish17. No entanto, não está claro se a formação de neuroectoderma neste sistema explant requer sinalização nodal diretamente ou se ligantes nodais exógenos induzem mesoderme que, em seguida, induz tecidos neurais em segundo lugar.
Explanagens quimricas contendo possíveis porções de mesoderm e neuroectoderm de dois embriões diferentes foram geradas para testar se a sinalização nodal é necessária de forma autônoma para especificação neuroectoderm ex vivo. A porção de mesoderme de cada explanta foi cortada de um embrião WT expressando um repórter transgênico de GFP específico de mesoderme, Tg[lhx1a:eGFP]30, injetado com uma dose alta (100 pg) de ndr2 (Figura 3A). A porção de neuroectoderme putativo de cada explanta foi cortada de um embrião WT de controle ou de sinalização nodal deficiente MZoep-/- embrião injetado apenas com mRNA codificando o marcador nuclear fluorescente H2B-RFP(Figura 3A). Cada explanta quimrica foi gerada combinando um blastoderm de cada uma dessas duas condições, que foram avaliadas para a expressão de marcadores específicos de tecido por hibridização in situ em 12 hpf.
A maioria das explantas de embriões de embriões injetados com 100 pg ndr2 expressou pouco ou nenhum sox2, e expressou marcadores de mesoderme, incluindo tbxta e o repórter lhx1a:gfp em toda a explanta (Figura 3B,G). O blastoderme WT não injetado (do tipo que compreende a porção potencial de neuroectoderme de explants quiméricos) não expressou nem marcadores de mesoderme nem sox2 quando cultivado como uma única explanta, indicando falta de neuroectoderme e especificação de mesoderme(Figura 3C,H). Explantas de embriões únicos de MZoep-/- embriões similarmente não tinham expressão tanto de marcadores de neuroectoderme quanto de mesoderme, mesmo quando injetados com ndr2 (Figura 3D). No entanto, quando blastoderms WT não injetados foram combinados com mesoderme induzido por altas doses de ligantes nodais, essas explanagens quimricas expressaram tanto marcadores de mesoderme quanto sox2 robustamente(Figura 3E, I). Esses resultados demonstram que, como observado anteriormente17,26,27,29, o mesoderme pode induzir o destino neural em células que de outra forma se tornariam ectoderme não-neural. Para testar se a sinalização nodal é necessária diretamente dentro da parte potencial de neuroectoderme dessas explantes para sua indução neural, foram criadas explanações quimricas a partir de blastoderms de TT injetados com 100 pg ndr2 e blastoderms de MZoep-/- embriões(Figura 3J). Apesar de sua incapacidade de receber sinais Nodal da porção mesodérmica vizinha, essas explantas expressaram sox2 em um grau semelhante ao wt control quimeras(Figura 3F). Este resultado demonstra que consistente com embriões intactos nos quais os tecidos neurais são especificados na ausência de atividade nodal, a sinalização nodal não é necessária de tecido autônomo para ex vivo porindução de neuroectoderme .
Figura 1: Procedimento para explantação de blastoderm de zebrafish (etapa 4.3). (A) Segure os fórceps na mão não dominante (laranja) fechados contra a gema para estabilizar o embrião enquanto belisca o blastoderm a aproximadamente 1/2 de sua altura usando os fórceps na mão dominante (azul). (B) Execute os fórceps laranjas ao longo da borda das fórceps azuis segurando o embrião para cortar através do blastoderm de modo que o primeiro corte atinja aproximadamente metade do blastoderm. (C) Gire o embrião 90°, depois coloque os fórceps azuis dentro (mas ortogonal para) o corte original e belisque para cortar o blastoderm restante. (D) Permitir que células de blastoderm explantadas se curem em solução de Danieau 3x por aproximadamente 5 minutos antes de transferir para mídia explant. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 (modificada a partir de20): Ligantes nodais promovem morfogênese C&E e formação de camada de germes em explantes de blastoderm de zebrafish. (A) Diagrama de injeção e explantação de embriões de zebrafish. (B-E) Imagens representativas de campo brilhante de explantes de blastoderm ao vivo das condições/genótipos indicados no equivalente ao estágio 2-4 de somite. N = número de explants de dois a quatro ensaios independentes. (F) Série DIC de lapso de tempo de uma explanta representativa de um embrião WT injetado com RNA ndr2 pg 10 pg. (G) Imagens representativas da hibridização total in situ para as transcrições indicadas em explants de embriões WT injetados com 10 pg ndr2 RNA. As barras de escala são de 200 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 (Modificada a partir de31): Explantas quimricas revelam que a especificação do neuroectoderm não requer sinalização nodal autônoma de tecido ex vivo . (A) Diagrama do procedimento para gerar explicações quimricas de zebrafish. (B-F) Hibridização total in situ para o marcador de mesoderme tbxta (topo) e marcador de neuroectoderme sox2 (inferior) em explantes de embriões WT injetados com 100 pg ndr2 RNA(B),unin controles WT injetados(C),MZoep-/- injetado com 10 pg ndr2 (D),e explantos quiméricos contendo porções neuroectoderme de WT(E) ou MZoep-/- (F ) embriões no equivalente ao estágio 2-4 de somite. As frações indicam o número de explantas com o fenótipo mostrado sobre o número total de explantas examinadas. (G-J) Imagens representativas de explanações de Tg[lhx1a:gfp] de um único embrião (G-H) ou combinadas com blastoderms expressos em H2B(I-J, magenta) das condições indicadas no equivalente ao estágio 2-4 de somite. N = número de explantas de três ensaios independentes. As barras de escala são de 200 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução 1 | Solução 2 | Solução 3 | Solução 4 | |
| Solução | 3x Danieau's | Água de Ovo | Mídia explant | 0,3x Danieau's |
| Ingredientes | 174 mM NaCl | 60 μg/mL sais marinhos | DMEM/F12 + 2,5 mM L-Glutamina e 15 mM HEPES | 17,4 mM NaCl |
| 2,1 mM KCl | 1 L água destilada | Volume total de 3% de soro de bezerro recém-nascido ou soro bovino fetal | 0,21 mM KCl | |
| 1,2 mM MgSO4. 7H2O | 1:200 Penicilina (50 unidades/mL)-Estreptomicina (50 μg/mL) | 0,12 mM MgSO4•7H2O | ||
| 1,8 mM Ca(NO3)2 •4H2O | 0,18 mM Ca(NO3)2 •4H2O | |||
| 15 mM HEPES | Exemplo: | HEPES de 1,5 mM | ||
| Água destilada | 4 mL/condição x 9 Condições = 36 mL | Água destilada | ||
| 1,08 mL Soro de Bezerro Recém-Nascido (NCS, aliquotado em -20 °C (3%) | ||||
| 0,18 mL 200x Pen-Strep (PS, aliquoted em -20 °C) (1:200) | ||||
| 35 mL DMEM/F12 |
Mesa 1.
Discussion
Este artigo descreveu como gerar explanações de blastoderm de zebrafish e discutiu duas aplicações práticas dessas explantas ao abordar o papel da sinalização de morfogênio nodal na gastrulação. Este método de cortar ecultura de explants fornece uma ardósia em branco de células ingênuas que podem ser manipuladas usando injeções de RNA e tratamento com pequenos compostos de moléculas para investigar uma via molecular de interesse.
Passos críticos
Há quatro passos neste protocolo que são particularmente críticos para o seu sucesso. O primeiro é injetar os embriões com a quantidade apropriada de Nodal. Este protocolo recomenda 10 pg de NDR2 RNA, e embora uma série de doses promova a extensão, muito ou muito pouco Nodal impedirá a extensão de explant ideal20. O segundo passo é descorioar os embriões. Se os embriões permanecerem em pronase por muito tempo, as gemas estourarão, e os embriões não serão viáveis de cortar. Se eles não estiverem na pronase por tempo suficiente, os acordes não serão afrouxados pela lavagem e, em vez disso, exigirão descorção manual demorada. O terceiro passo crítico é cortar as explantas. O corte na solução 3x Danieau é recomendado, pois o menor teor de sal da solução de 0,3x Danieau ou água de ovo não promove a cura e a sobrevivência de explantas.
Além disso, as explanações devem ser cortadas aproximadamente metade da altura do blastoderm para garantir a ingenuidade das células. Se forem cortados muito perto da gema, eles conterão sinais da margem (incluindo nodal endógeno) que promovem a especificação tecidual e morfogênese. O quarto e último passo crítico está na cura de explantas quimricas. Duas explantas não se fundirão para formar quimeras a menos que suas bordas cortadas sejam gentilmente pressionadas imediatamente após serem cortadas.
Modificações e solução de problemas
As etapas críticas descritas acima oferecem oportunidades para solução de problemas. Algumas questões comuns e soluções propostas são apresentadas abaixo.
Se as explantas não estão se estendendo na presença de sinalização Nodal, existem algumas soluções possíveis. (A) Injete embriões no estágio unicelular para garantir que o RNA seja uniformemente disperso por todo o embrião. (B) Evite injetar muito RNA nodal, garantindo que o volume injetado esteja correto usando um micrômetro para medir o bolus de injeção. (C) Evite injetar muito pouco RNA nodal medindo sua concentração para garantir que não tenha se degradado. (D) Mantenha alguns irmãos intactos com correspondência etária para inferir o estágio equivalente das explantas. Explantas atingem extensão máxima quando irmãos intactos atingem a fase 2-5 de somite. Se as explantas forem coletadas muito cedo, então a extensão ideal não será alcançada.
Se as gemas estão estourando após a descorção, e os embriões não são viáveis de cortar, remova os embriões da solução de pronase assim que os acordes começarem a enrugar e embriões 1-2 derramarem seu chorão. Em seguida, enxágue imediatamente na água do ovo.
Se as explantas aparecerem borbulhando ao redor das bordas, há algumas soluções. (A) Cortar explantes apenas dentro de um prazo específico de desenvolvimento. Embora as explanagens cortadas em qualquer estágio de estágios de 128 a 1000 células possam sobreviver e se estender na cultura, aqueles cortados em estágios de 256 a 512 células tendem a ser os mais robustos. (B) Certifique-se de que as explantas sejam cortadas na solução 3x de Danieau para garantir a cura adequada. (C) Corte as explantes de forma limpa, mas suavemente. Evite esticar ou separar as células durante o processo de corte.
Se as explantas de controle não injetadas estiverem se estendendo, é provável que as explanagens sejam cortadas muito perto da gema. Para que as explantas sejam ingênuas, certifique-se de que os cortes sejam feitos no meio do caminho entre a gema e o topo do blastoderm.
Se as explantas quimricas não se fundem, é provável porque a tendência de explantas na solução 3x Danieau uma vez cortadas é arredondar e curar sobre a borda de corte. Para garantir que os dois blastoderms se curem um ao outro em vez de si mesmos, pressione-os imediatamente após o corte. Use fórceps para aplicar pressão suave aos blastoderms recém-unidos dentro da agarose bem para incentivá-los a se curarem juntos.
Limitações
Embora essas explantas sejam uma ferramenta valiosa para estudar o papel de um determinado morfogênico (ou outra molécula de interesse) em isolamento relativo, observações feitas em qualquer modelo ex vivo devem ser interpretadas com cuidado. Explantas exibem morfogênese C&E muito semelhante à observada in vivo20,mas não recapitulam todos os aspectos da gastrulação, por exemplo, movimentos epiboly. Eles também não têm muitos outros fatores regulatórios e moléculas de sinalização que estão presentes dentro de um embrião intacto. Embora esta seja uma vantagem experimental significativa das explants, também pode levar a conclusões que não se mantêm in vivo. Por exemplo, uma vez que explantas que não recebem ligantes nodais exógenos não expressam marcadores de neuroectoderme, pode-se concluir apenas a partir de explantes que a sinalização nodal é necessária para a especificação do neuroectoderme. No entanto, o neuroectoderme é formado dentro de embriões intactos sem toda a sinalização Nodal23,24, demonstrando o papel vital de outras moléculas de sinalização na especificação neural32. Explantas podem nos dizer do que um morfogênico é capaz em um ambiente isolado. Ainda assim, todos esses achados devem ser confirmados em/comparados com embriões intactos para que os resultados sejam interpretados minuciosamente. Em outras palavras, explantas não podem tomar o lugar de um embrião em desenvolvimento. Em vez disso, são uma ferramenta complementar para identificar o papel e a relação de um morfogênico com o ambiente. Com essas limitações em mente, as explanações de blastoderm de zebrafish são uma ferramenta valiosa para muitas questões de pesquisa.
Significância em relação aos métodos existentes
Com interesse renovado em embriologia sintética, várias abordagens ex vivo e in vitro são regularmente empregadas para modelar aspectos do desenvolvimento embrionário. Por exemplo, gastruloides 2 e tridimensionais compostos de células-tronco pluripotentes embrionárias ou humanas podem ser persuadidos, através da aplicação de moléculas de sinalização exógenas, para recapitular alguns dos eventos de padronização e/ou morfogentices de gastrulation, segmentação e neurulação33,34,35,36,37 . Embora poderosos, esses métodos requerem métodos de cultura laboriosos e prolongados para manter continuamente células-tronco pluripotentes e cultivar gastruloides, que levam muitos dias para chegar aos estágios de gastrulação. Em contrapartida, as explantas de zebrafish não exigem manutenção das culturas de células-tronco, pois os embriões são simplesmente coletados conforme necessário. Eles são relativamente simples de gerar e alcançar estágios de gastruação em poucas horas, o mesmo que embriões de zebrafish. Isso destaca outra vantagem das explanações de zebrafish, seu relógio de desenvolvimento intacto. Como a era de desenvolvimento de células-tronco pluripotentes embrionárias e induzidas pode ser variável e altamente debatida, explantas embrionárias são talvez mais adequadas para investigar a regulação temporal do desenvolvimento. Finalmente, enquanto as explicações de zebrafish pescoid (que contêm a margem embrionária) se estendem da mesma forma na cultura12,13, eles o fazem em resposta aos centros de sinalização endógenos. Em vez disso, as explanações descritas aqui permitem aos pesquisadores investigar moléculas de interesse com relativamente pouca interferência de tais sinais embrionários.
Aplicações futuras potenciais
Aqui, explantas foram usadas para demonstrar que a sinalização nodal é necessária e suficiente para morfogênese C&E. Ainda assim, prevê-se que eles possam e serão usados para discernir o papel de muitas moléculas diferentes em muitos outros processos de desenvolvimento, por exemplo, regulação da expressão genética, gradientes de sinalização e programas morfogenéticos adicionais. Além disso, como essas explanações são viáveis até pelo menos 24 hpf19,pode-se esperar que sua utilidade se estenda além da gastrulação em processos como segmentação e organogênese, qualquer processo em que os pesquisadores desejem uma ardósia em branco de desenvolvimento.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo NICHD R00HD091386 para a MLKW e pelo NIEHS T32ES027801 para a AAE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass beads | Millipore-Sigma | Z250473 | |
| 4% Paraformaldehyde | VWR | J19943-K2 | |
| 6-well plates | Fisher | FB012927 | |
| Agarose | Thermo-Fisher | 16500500 | |
| Ca(NO3)2 .4H2O | Thermo-Fisher | 12364-36 | |
| DMEM/F12 media | Gibco | 11330032 | |
| Dumont #5 watchmakers forceps | World Precision Instruments | 500341 | |
| Embryo injection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| Glass crystalizing dishes | Fisher | 08-741A | |
| Glass Petri dishes | Fisher | 08-748A | |
| HEPES | VWR | JT4018-1 | |
| Instant Ocean sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| KCl | VWR | BDH9258-500G | |
| Low temperature incubator | Fisher | 15-015-2632 | |
| MgSO4.7H2O | VWR | 97062-134 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micrometer | SPI supplies | 02265-AB | |
| Mineral oil | VWR | MK635704 | |
| NaCl | VWR | BDH9286-500G | |
| Newborn Calf Serum | Invitrogen | 26010-066 | |
| Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-30 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Pico-pump pneumatic injector | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Pipet pump | Fisher | 13 683C | |
| Plastic Petri dishes 100 mm | Fisher | FB0875712 | |
| Plastic Petri dishes 60 mm | Fisher | FB0875713A | |
| Plastic wash bottles | Fisher | 03-409-10E | |
| Pronase | Millipore-Sigma | 10165921001 | |
| Tween-20 | VWR | 200002-836 |
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