Method Article

Formulação e modulação acústica de nanogotículas de perfluorocarbono opticamente vaporizadas

DOI:

10.3791/62814

⸱

July 16th, 2021

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering and School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As nanogotículas de perfluorocarbono ativadas opticamente mostram-se promissoras em aplicações de imagem fora do sistema vascular. Este artigo demonstrará como sintetizar essas partículas, cruzar fantasmas de poliacrilamida e modular as gotículas acusticamente para melhorar seu sinal.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As microbolhas são o agente de contraste de imagem mais comumente usado no ultrassom. No entanto, devido ao seu tamanho, eles são limitados a compartimentos vasculares. Essas microbolhas podem ser condensadas ou formuladas como nanogotículas de perfluorocarbono (PFCnDs) que são pequenas o suficiente para extravasar e, em seguida, serem acionadas acusticamente no local alvo. Essas nanopartículas podem ser ainda mais aprimoradas pela inclusão de um absorvedor óptico, como corante orgânico infravermelho próximo ou nanopartículas (por exemplo, nanopartículas de sulfeto de cobre ou nanopartículas/nanobastões de ouro). PFCnDs opticamente marcados podem ser vaporizados através de irradiação a laser em um processo conhecido como vaporização óptica de gotículas (ODV). Este processo de ativação permite o uso de núcleos de perfluorocarbono de alto ponto de ebulição, que não podem ser vaporizados acusticamente abaixo do limiar máximo de índice mecânico para diagnóstico por imagem. Núcleos de ponto de ebulição mais altos resultam em gotículas que se recondensarão após a vaporização, resultando em PFCnDs "piscando" que produzem brevemente contraste após a vaporização antes de condensar de volta à forma de nanogotículas. Esse processo pode ser repetido para produzir contraste sob demanda, permitindo a imagem livre de fundo, multiplexação, super-resolução e aprimoramento de contraste através de modulação óptica e acústica. Este artigo demonstrará como sintetizar PFCnDs de casca lipídica opticamente desencadeáveis utilizando sonicação de sonda, criar simuladores de poliacrilamida para caracterizar as nanogotículas e modular acusticamente os PFCnDs após ODV para melhorar o contraste.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As microbolhas são o agente de contraste ultrassônico mais onipresente devido à sua biocompatibilidade e excelente ecogenicidade em comparação com os tecidos moles. Isso os torna ferramentas valiosas para visualizar o fluxo sanguíneo, a delimitação de órgãos e outras aplicações1. No entanto, seu tamanho (1-10 μm), o que os torna excepcionais para exames de imagem com base em sua frequência ressonante, restringe suas aplicações à vasculatura2.

Essa limitação levou ao desenvolvimento de PFCnDs, que são nanoemulsões compostas por um surfactante envolto em torno de um núcleo líquido de perfluorocarbono. Essas nanopartículas podem ser sintetizadas em tamanhos tão pequenos quanto 200 nm e são projetadas para tirar proveito da vasculatura ou poros "com vazamento" e fenestrações abertas encontradas na vasculatura tumoral. Embora essas rupturas sejam dependentes do tumor, essa permeabilidade permite o extravasamento de nanopartículas de ~200 nm - 1,2 μm, dependendo do tumor 3,4. Em sua forma inicial, essas partículas produzem pouco ou nenhum contraste de ultrassom. Após a vaporização - induzida acusticamente ou opticamente - a fase central muda de líquido para gás, induzindo um aumento de duas vezes e meia a cinco vezes no diâmetro 5,6,7 e gerando contraste fotoacústico e ultrassonográfico. Embora a vaporização acústica seja o método de ativação mais comum, essa abordagem cria artefatos acústicos que limitam a imagem da vaporização. Além disso, a maioria dos perfluorocarbonetos requer ultrassom focalizado com índice mecânico além do limiar de segurança para vaporizar8. Isso levou ao desenvolvimento de PFCnDs de menor ponto de ebulição, que podem ser sintetizados pela condensação de microbolhas em nanogotículas9. No entanto, essas gotículas são mais voláteis e sujeitas à vaporização espontânea10.

A vaporização óptica de gotículas (ODV), por outro lado, requer a adição de um gatilho óptico como nanopartículas 11,12,13 ou corante6,14,15 e pode vaporizar perfluorocarbonos de maior ponto de ebulição usando fluências dentro do limite de segurança ANSI 11. Os PFCnDs sintetizados com núcleos de ponto de ebulição mais altos são mais estáveis e se recondensam após a vaporização, permitindo imagens livres de fundo16, multiplexação 17 e super-resolução18. Uma das principais limitações dessas técnicas é o fato de que os PFCnDs de alto ponto de ebulição são ecogênicos após a vaporização por apenas um curto período de tempo, na escala de milissegundos19, e são relativamente fracos. Embora esse problema possa ser mitigado por meio de vaporizações repetidas e média, a detecção e a separação do sinal de gotículas continuam sendo um desafio.

Inspirando-se na inversão do pulso, a duração e o contraste podem ser potencializados modificando a fase do pulso de ultrassonografia19. Ao iniciar o pulso de imagem de ultrassom com uma fase de rarefação (n-pulso), tanto a duração quanto o contraste dos PFCnDs vaporizados aumentam. Em contraste, iniciar o pulso de imagem de ultrassom com uma fase de compressão (pulso-p), resulta em contraste reduzido e menor duração. Este artigo descreverá como sintetizar nanogotículas de perfluorocarbono opticamente acionáveis, simuladores de poliacrilamida comumente usados em imagens e demonstrar o aprimoramento do contraste e a longevidade do sinal aprimorado por meio da modulação acústica.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Formulação de nanogotículas de perfluorocarbono

  1. Enxaguar um balão de fundo redondo de 10 ml com clorofórmio e lavar uma seringa de vidro à prova de gás de 10 μL e 1 ml com clorofórmio, aspirando repetidamente o volume total da seringa e expulsando-a por um total de três vezes.
    CUIDADO: O clorofórmio é volátil e pode ser tóxico se inalado. Todo o trabalho com este solvente deve ser realizado em um exaustor.
  2. Com as seringas, adicionar 200 μL de DSPE-mPEG2000 (25 mg/mL), 6,3 μL de 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC, 25 mg/mL) e 1 mL de IR 1048 (1 mg/mL em clorofórmio) no frasco de fundo redondo. Lembre-se de limpar as seringas entre lipídios/corante para evitar a contaminação do estoque.
    NOTA: Os corantes infravermelhos são sensíveis à luz, e o trabalho deve ser feito em condições fracas ou os frascos devem ser cobertos com papel alumínio.
  3. Remova o solvente utilizando um evaporador rotativo. Certifique-se de que o vácuo seja ajustado lentamente para 332 mbar para evitar colisões. Após 5 min, reduza a pressão para 42 mbar para remover qualquer água que possa ter entrado na solução.
    NOTA: O bolo lipídico pode ser conservado durante a noite num balão de fundo redondo coberto com parafilme a 4 °C.
  4. Suspender o bolo lipídico em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e sonicate ou vórtice à temperatura ambiente por 5 min ou até que todo o bolo lipídico tenha sido suspenso e dissolvido na solução. Sonicate por mais 2 minutos para homogeneizar a solução.
  5. Transfira a solução para um frasco para injetáveis de vidro de 7 ml e coloque o frasco para injetáveis num prato de vidro cheio de gelo para permitir que a solução arrefeça durante 5 minutos antes de adicionar 50 μL de perfluorohexano utilizando uma seringa de vidro estanque a gás. Lembre-se de enxaguar a seringa com perfluorohexano antes de a dispensar no frasco para injetáveis.
  6. Coloque o frasco para injetáveis de vidro que contém os lípidos e o banho de gelo no invólucro do sonicador da sonda e submerja a ponta da sonda abaixo do miniscus. Certifique-se de que os lados da sonda sonicator não tocam o lábio do frasco para injetáveis de vidro.
  7. Sonda sonicate a mistura com as seguintes configurações: Amplitude 1, Tempo de processo: 20 s, Pulse-On: 1s, Pulse-off: 5s. Em seguida, sonicate nas seguintes configurações: Amplitude: 50, Tempo de processo: 5 s, Pulse-on: 1 s, Pulse-off: 10 s.
  8. Transfira a solução de nanogotículas para um tubo de centrífuga de 1,5 mL e centrífuga a 300 x g por 3 min para separar as gotículas maiores (>1 μm) das gotículas menores.
  9. Descarte o pellet e transfira o sobrenadante para outro tubo de centrífuga de 1,5 mL. Lavar o sobrenadante centrifugando a 3000 x g durante 5 min para colocar todas as gotículas em solução. Ressuscite os PFCnDs em 1 mL de PBS pipetando a pelota para cima e para baixo e, em seguida, sonicate em um sonicator de banho por 1 min.
  10. Meça o tamanho das gotículas usando o espalhamento dinâmico de luz (DLS). Diluir o estoque de PFCnDs em 100 vezes (10 μL de estoque de PFCnD em 990 μL de PBS) e banho sonicate para dispersar os PFCnDs antes de medir. Os resultados representativos são apresentados na Figura 1.
  11. Determine a concentração dos PFCnDs utilizando o analisador de rastreamento de nanopartículas (consulte Tabela de Materiais). Diluir os PFCnDs em 100-1000 vezes para garantir a medição precisa da concentração. O protocolo normalmente produz gotículas em uma concentração na ordem de 10a 10 partículas/mL.
  12. Prepare 10 mL de gel de acoplamento de ultrassom em um tubo de centrífuga de 50 mL e adicione 1% (v/v) ou 100 μL de PFCnDs para fazer a solução de ~108 partículas/mL. Vórtice a solução para misturar. Centrifugar a mistura a 4000 x g durante 3 minutos para remover as bolhas.

2. Preparação fantasma de poliacrilamida

  1. Desgaseifique a água enchendo um balão de vácuo de 500 ml com 400 ml de água desionizada, sele com uma rolha de borracha e ligue o balão à linha de vácuo. Abra a linha de vácuo e submerja o fundo do balão no sonicador de banho. Sonicate por 5 min ou até que nenhuma formação de bolha de gás seja visível.
  2. Preparar solução de persulfato de amónio (APS) a 10% dissolvendo 500 mg em 5 ml de água desgaseificada. Agite suavemente a solução se o persulfato de amónio não se dissolver totalmente.
  3. Em um copo de 400 mL com uma barra de agitação em uma placa de agitação, adicione 150 mL de água desgaseificada e 50 mL de solução de acrilamida-bisacrilamida a 40% (p/v) para formar 200 mL de solução de acrilamida-bisacrilamida a 10%. Mexa a mistura a 200 rpm para permitir a mistura adequada sem introduzir bolhas.
    CUIDADO: A acrilamida é um carcinógeno, e todo o trabalho deve ser feito em um exaustor com luvas, especialmente se trabalhar com acrilamida em forma de pó.
  4. Pesar 400 mg de sílica e adicioná-la à solução de acrilamida-bisacrilamida a 10% a partir do passo 2.3 para formar uma solução a 0,2 % (p/v) de sílica e acrilamida.
    CUIDADO: A sílica quando inalada pode ser cancerígena. Todo o trabalho, incluindo a pesagem, deve ser realizado em um exaustor.
  5. Prepare um molde quadrado de 58 mm x 58 mm x 78 mm com uma inclusão cilíndrica, cortando as pontas de uma pipeta de transferência de plástico e apoiando-a no molde com fita adesiva de laboratório. Consulte a Figura 2.
  6. Adicionar 2 ml de solução APS a 10 % ao copo para obter uma concentração final de APS a 0,1% e adicionar 250 μL de tetrametiletilenodiamina (TEMED) à solução fantasma. Deixe a solução mexer brevemente (menos de um min).
  7. Despeje rapidamente a solução no molde, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar na solução. A solução deve polimerizar dentro de 10 min. Remova o fantasma passando a extremidade plana de uma espátula de laboratório ao redor da borda do molde e invertendo o molde.
    NOTA: Esses simuladores podem ser reutilizados várias vezes e devem ser submersos em água e armazenados a 4 ° C.

3. Imagem de nanogotículas de perfluorocarbono

  1. Ligue e aqueça o sistema de laser pulsado por ~20 minutos seguindo as instruções do fabricante. Certifique-se de que o feixe de fibra óptica esteja conectado corretamente à saída do laser e que as duas pernas estejam adequadamente colocadas dentro do suporte do feixe de fibra.
  2. Ligue o sistema de imagem de ultrassom, conecte o transdutor de imagem de matriz (L11-4v) ao sistema e fixe o transdutor dentro do suporte para alinhar seu plano de imagem com a seção transversal do laser.
  3. Defina a frequência de repetição de pulso do sistema a laser para 10Hz e coloque um medidor de potência no final do feixe de fibras para medir a energia. Ajuste o atraso do interruptor q até que a fluência estimada seja de 70 mJ/cm2.
    CUIDADO: Óculos apropriados devem ser usados ao disparar o laser e as cortinas de laser devem envolver o espaço.
  4. Encha um dos canais no simulador de poliacrilamida com a mistura de gel de ultrassom/PFCnD usando uma seringa de ponta deslizante de plástico de 1 mL. Cubra liberalmente a parte superior do canal com gel de ultrassom e remova todas as bolhas com uma seringa de ponta deslizante de plástico de 1 mL. Coloque o fantasma de poliacrilamida sob o transdutor e o feixe de fibras, conforme mostrado na Figura 3.
  5. Use a plataforma de imagem combinada de ultrassom e elasticidade a laser (CLUE) baseada no software20 para visualizar PFCnD sincronizado com ativação óptica. Altere os parâmetros gerais definidos pelo usuário na estrutura Param para geração de imagens: defina a profundidade de início/fim para 0/40mm, a frequência central para 6,9MHz e o nome do transdutor para 'L11-4v'.
  6. Defina um novo RunCase e projete uma sequência de módulos para ativação/recondensação óptica repetida e imagens de US de PFHnDs. Isso é feito listando módulos predefinidos, como imagem ultrarrápida (mUF), laser externo (mExtLaser) e ocioso (mIdle).
    1. Repita o conjunto de sequências mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF duas vezes para adquirir dados de imagem n-pulse e p-pulse.
      NOTA: O primeiro módulo mExtLaser em cada sequência é definido como um laser simulado definindo ExtLaser.Enable como 0 e o 'mIdle' é incluído para minimizar o tempo entre as imagens de fundo dos EUA e as imagens dos EUA de pulso n/p após a ativação do laser.
  7. Defina os parâmetros do módulo para cada módulo colocado na sequência de módulos do caso de execução atual. Acesse cada parâmetro de módulo por índice correspondente à sua ordem na sequência de módulos. Os módulos executarão operações predefinidas com os parâmetros do módulo definidos pelo usuário aqui.
    1. Defina ExtLaser.QSdelay em módulos de laser externos para o valor de atraso do interruptor Q do laser ajustado na etapa 3.3, em microssegundos. Este módulo aguarda a saída do acionamento da lanterna do sistema a laser e gera o gatilho Q-switch após o atraso especificado no QSdelay.
    2. No módulo de imagem ultrarrápido, defina Resource.numFrame como 100, defina SeqControl.PRI como 200 (μs) e defina TW.polarity como 1 para pulso P e -1 para pulso N (consulte a Figura 4 para a forma de pulso correspondente). Este módulo transmitirá onda plana ultrarrápida de 0 graus com tipo de pulso especificado em TW.polarity.
      1. Adquira uma janela de imagem de abertura total de 38,8 mm de largura para o número de quadros em Resource.numFrame, intervalo de repetição de pulso de SeqControl.PRI e, em seguida, salve os dados para processamento off-line.
    3. Defina SeqControl.lastPRI_Module no módulo ocioso para o período de tempo entre pulsos de laser (100 ms) subtraídos pelo atraso do interruptor Q, tempo de aquisição de dados de imagem (20 ms) e uma margem de 20 μs para o sinal viajar. Este módulo mantém o sistema sob o estado de "nenhuma operação" pelo tempo em SeqControl.lastPRI_Module para preencher a lacuna de tempo entre o final da aquisição de dados de imagem e a próxima excitação de pulso de laser.

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Results

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A formulação bem-sucedida e a separação centrífuga dos PFCnDs devem produzir gotículas em torno do tamanho de 200-300 nm de diâmetro (Figura 1A). Gotículas inadequadamente separadas podem mostrar pequenos picos em torno de 1 μm. Essas soluções podem ser ainda mais sonicadas por banho para quebrar as gotículas maiores. O tamanho das gotículas aumentará ao longo do tempo devido à coalescência e/ou difusão em um processo conhecido como amadurecimento de Ostwald21,22...

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Discussion

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A sonicação da sonda é um método relativamente simples e fácil de aprender para fabricar PFCnDs. Existem alguns passos em que o cuidado deve ser tomado. Ao manusear clorofórmio, é imperativo que uma pipeta de deslocamento positivo ou seringas de vidro seja usada, pois é volátil e "vazará" das pipetas de deslocamento de ar padrão. Além disso, se estiver usando um deslocamento positivo, certifique-se de que uma ponta apropriada seja usada, pois o clorofórmio dissolverá a maioria das pontas plásticas, o que pode introduzir ...

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Disclosures

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Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

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O trabalho foi apoiado em parte pela Breast Cancer Research Foundation sob a concessão BCRF-20-043.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Persulfato de amônio (APS)VWR97064-592
1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC)Avanti Polar Lipids850365CLipídios, estes podem ser adquiridos suspensos em clorofórmio ou em pó. Para armazenamento a longo prazo, a forma de pó é a melhor, mas o clorofórmio é mais prático.
1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenoglicol)-2000] (sal de amônio) (DSPE-PEG)Avanti Polar Lipids880120CLipídios, estes podem ser adquiridos suspensos em clorofórmio ou em pó. Para armazenamento a longo prazo, a forma de pó é a melhor, mas o clorofórmio é mais prático.
Acrilamida : Solução de bisacrilamida (19:1) 40% (p/v), OmniPur®VWREM-1300solução de acrilamida, menor concentração/pó
IR-1048Sigma405175Corante infravermelho
L11-4vTransdutor de matriz linear de ultrassomVerasonics
Microtip 1/8"Qsonica LLC4418microtip para sonda sonicador
N, N, N′, N′ -Tetrametiletilenodiamina (TEMED)VWR97064-902Usado para polimerizar poliacrilamida formando radicais livres na presença de persulfato de amônio
Nova IIOphir-Spiricon7Z01550medidor de potência a laser
PerfluorohexanoFluoromedAPF-60Mperfluorocarbono líquido
Comprimidos salinos tamponados com fosfato (PBS)VWR97062-732Comprimidos usados para fazer PBS
Q500Qsonica LLCQ500-110Sonda sonicador
Gel de sílicaSigma-Aldrich2885002-25 μ m tamanho de partícula
Tempest 30New waveresearch-Sistemade laser pulsado
Vantage 128Verasonics-researchsistema de imagem de ultrassom
Zetasizer Nano ZSMalvern InstrumentsLtd-Fazmedições de tamanho com base em dispersão dinâmica de luz

References

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