O desenvolvimento embrionário requer coordenação em larga escala do movimento celular. A ablação a laser mediada por dois fótons permite a ablação espacialmente controlada em três dimensões de grandes grupos de células profundas. Além disso, essa técnica pode sondar a reação de células migratórias coletivamente in vivo a perturbações em seu ambiente mecânico.
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Artigo de método
Ablações de volume profunda e espacialmente controladas usando um microscópio de dois fótons no Gás de Peixe-Zebra
Neste artigo
Resumo
Resumo
A morfogênese envolve muitos movimentos celulares para organizar células em tecidos e órgãos. Para o desenvolvimento adequado, todos esses movimentos precisam ser rigorosamente coordenados, e acumular evidências sugere que isso é alcançado, pelo menos em parte, através de interações mecânicas. Testar isso no embrião requer perturbações físicas diretas. As ablações a laser são uma opção cada vez mais utilizada que permite aliviar restrições mecânicas ou isolar fisicamente duas populações celulares uma da outra. No entanto, muitas ablações são realizadas com um laser ultravioleta (UV), que oferece resolução axial limitada e penetração tecidual. Um método é descrito aqui para ablto de volumes profundos, significativos e espacialmente bem definidos usando um microscópio de dois fótons. As ablações são demonstradas em uma linha transgênica de zebrafish expressando a proteína fluorescente verde no mesendoderme axial e usadas para cortar o mesendoderme axial sem afetar o ectoderme sobreceptório ou a célula de gema subjacente. O comportamento celular é monitorado por imagens ao vivo antes e depois da ablação. O protocolo de ablação pode ser usado em diferentes estágios de desenvolvimento, em qualquer tipo de célula ou tecido, em escalas que variam de alguns mícrons a mais de cem mícrons.
Introdução
As interações célula-célula desempenham papéis vitais no desenvolvimento. As células fornecem sinais que seus vizinhos diretos, ou células mais distantes, podem perceber, influenciando assim seu destino e/ou comportamento. Muitos desses sinais são de natureza química. Por exemplo, nos eventos de indução bem caracterizados, um grupo celular produz moléculas difusíveis que afetam o destino de outra população celular1. Outros sinais, no entanto, são mecânicos; as células exercem forças e restrições sobre seus vizinhos, que os vizinhos percebem e respondem a2.
Uma forma de estudar a importância de....
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Protocolo
Todo o trabalho animal foi aprovado pelo Comitê de Ética n 59 e pela Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche sob o número de arquivo APAFIS#15859-2018051710341011v3. Algumas das etapas descritas abaixo são específicas para nossos equipamentos e software, mas podem ser facilmente adaptadas a diferentes equipamentos.
1. Preparação para injeção
- Prepare 75 mL de solução de 1% de agarose em Embrião Médio (EM).
- Coloque o molde de injeção em uma placa de Petri de 90 mm e despeje aproximadamente 50 mL de agarose, o suficiente para o molde flutuar. Deixe a agarose solidificar e remover o....
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Resultados
Para cortar o polster em seu meio, um embrião Tg(gsc:GFP), injetado com Histone2B-mCherry mRNAs foi montado no estágio de 70% epiboly, como descrito na etapa 4. O polster foi identificado pela expressão GFP, e o embrião foi montado para que o plano do polster seja perpendicular ao eixo óptico (Figura 1B). Inclinar o embrião para longe desta posição complicará o procedimento. A luz terá que passar por mais tecidos para alcançar os planos de ablação, e os aviões de ablação serão incli.......
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Discussão
Aqui, descrevemos um protocolo que usa óptica não linear para realizar ablações de volume profundas e espacialmente bem definidas. O passo mais crítico do protocolo é encontrar condições de tratamento que forneçam energia suficiente para permitir ablações, mas não muita energia, para evitar detritos excessivos ou cavitação. A quantidade de energia entregue no local alvo depende principalmente de: (1) a potência de saída a laser, (2) a qualidade do alinhamento a laser, (3) a natureza do tecido através do qual a luz passa .......
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Divulgações
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos a Emilie Menant pelo cuidado com os peixes, o Polytechnique Bioimaging Facility, em particular Pierre Mahou, pela assistência com imagens ao vivo em seus equipamentos, em parte apoiados por Région Ile-de-France (interDIM) e Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029 Morphoscope2, ANR-10-INBS-04 France BioImaging). Este trabalho foi apoiado pelas bolsas ANR 15-CE13-0016-1, 18-CE13-0024, 20-CE13-0016, e o programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia sob o acordo de subvenção Marie Skłodowska-Curie No 840201, a Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche e o Centre National de la Recherche Scientifique.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Objetiva de imersão em água 25x | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Agarose | PanReac AppliChem | A8963,0500 | |
| Software de análise de dados: Matlab | Math Works | ||
| Modulador eletro-óptico (EOM) | ConOptics | 350-80LA | |
| Solução | de meio embrionário (EM)Westerfield, M. O Livro do Peixe-Zebra. Um Guia para o Uso Laboratorial do Peixe-Zebra (Danio rerio), 5ª Edição. Imprensa da Universidade de Oregon, Eugene (Livro). (2000). | ||
| Câmara de câmara ambiental | Okolab | H201-T-UNIT-BL | |
| EOM driver | ConOptics | 302RM | |
| Fonte de fluorescência | Lumencor | SOLA | |
| Pratos de fundo de vidro | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Capilares de vidro | Harvard | Apparatus 300085 | Diâmetro externo 1,0 mm, diâmetro interno 0,58 mm |
| Pipetas de vidro | Volac | D810 | A ponta deve ser polida a fogo |
| Laser verde/ablação | Spectra Physics | Mai Tai HP DeepSee | |
| Histone2B-mCherry mRNA | sintetizado a partir do plasmídeo pCS2-H2B-mCherry (Dumortier& al. 2012) | ||
| Software de análise de imagem: IMARIS | Bitplane | ||
| Software ImSpector | Abberior Equipe | ||
| Molde de injeção | Ferramentas de Ciência Adaptativa | I-34 | |
| Pontas de microcarregador | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulador | Narishige | MN-151 | |
| Extrator de micropipeta | Sutter | P-1000 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcrição | Invitrogen | AM1340 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Thermofisher | 15140-122 | 10 000 unidades de penicilina e 10 mgestreptomicina por ml |
| Tubo fotomultiplicador (PMT) | Hammamatsu | H7422-40 | |
| PicoPump (injetor de ar) | World Precision Instrument | PV820 | |
| Laser vermelho | Espectros Física | OPO/Insight DeepSee | |
| RNAse água livre para injeção | Sigma | W3500 | |
| Software de planilha: Excel | Microsoft | ||
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ18 | |
| Tg(gsc:GFP) linha | Doitsidou, M. et al. Orientação da migração de células germinativas primordiais pela quimiocina SDF-1. Célula. 111 (5), 647 59, doi: doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002). | ||
| Microscópio TriM Scope II | La Vision Biotech |
Referências
- Slack, J. M. W. Embryonic induction. Mechanisms of Development. 41 (2-3), 91-107 (1993).
- Fernandez-Sanchez, M. -E., Brunet, T., Röper, J. -C., Farge, E. Mechanotransduction's impact on animal development, evolution, and tumorigenesis. Annual Review of Cell....
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Reimpressões e permissões
