Expressão GFP induzida pela luz em embriões de zebrafish usando o sistema OPtogenético TAEL/C120

Summary

Optogenética é uma ferramenta poderosa com aplicações abrangentes. Este protocolo demonstra como alcançar a expressão genética indutível à luz em embriões de zebrafish usando o sistema TAEL/C120 de resposta à luz azul.

Abstract

Sistemas de expressão genética indutíveis são uma ferramenta inestimável para estudar processos biológicos. Sistemas de expressão optogenética podem fornecer controle preciso sobre o tempo, localização e amplitude da expressão genética usando a luz como agente indutor. Neste protocolo, um sistema de expressão optogenética é usado para alcançar a expressão genética indutível à luz em embriões de zebrafish. Este sistema se baseia em um fator de transcrição projetado chamado TAEL baseado em um fator de transcrição ativado pela luz natural da bactéria E. litoralis. Quando iluminado com luz azul, o TAEL escurece, liga-se ao seu elemento regulatório cognato chamado C120 e ativa a transcrição. Este protocolo utiliza embriões transgênicos de zebrafish que expressam o fator de transcrição do TAEL sob o controle do onipresente promotor ubb. Ao mesmo tempo, o elemento regulatório C120 impulsiona a expressão de um gene repórter fluorescente (GFP). Usando um simples painel LED para fornecer luz azul ativante, a indução da expressão GFP pode ser detectada primeiro após 30 minutos de iluminação e atinge um pico de mais de 130 vezes de indução após 3h de tratamento leve. A indução de expressão pode ser avaliada por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) e por microscopia de fluorescência. Este método é uma abordagem versátil e fácil de usar para a expressão genética optogenética.

Introduction

Sistemas de expressão genética indutíveis ajudam a controlar a quantidade, o tempo e a localização da expressão genética. No entanto, alcançar o controle espacial e temporal exato em organismos multicelulares tem sido desafiador. O controle temporal é mais comumente alcançado adicionando compostos de pequenas moléculas¹ ou ativação dos promotores de choque térmico². Ainda assim, ambas as abordagens são vulneráveis a questões de tempo, força de indução e respostas de estresse fora do alvo. O controle espacial é alcançado principalmente pelo uso de promotores específicos do tecido^3,mas essa abordage....

Protocol

Este estudo foi realizado com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Califórnia Merced.

1. Travessia de zebrafish e coleta de embriões

1. Mantenha linhas separadas de zebrafish transgênicos contendo o ativador transcricional TAEL ou o gene repórter controlado pelo C120 para minimizar a ativação espúria.
2. Cruze 6-8 zebrafish adultos de cada linha usando métodos padrão⁹ para produzir embriões transgênicos duplos que contêm os componentes TAEL e C120(Figura 1B).
   NOTA: Alternativamente, ambos os componentes podem ser exp....

Results

Para esta demonstração, uma linha de repórteres GFP responsiva C120 -responsiva (Tg(C120F:GFP)^ucm107)foi cruzada com uma linha transgênica que expressa TAEL-N onipresentemente a partir da ubiquitina b (ubb) promotor(Tg(ubb:TAEL-N)^ucm113)) para produzir embriões transgênicos duplos contendo ambos os elementos. 24 h pós-fertilização, os embriões foram expostos à ativação da luz azul, pulsado a uma frequência de 1 h on/1 h off. A indução da expressão GFP foi quantifi.......

Discussion

Este protocolo descreve o uso do sistema optogenético TAEL/C120 para alcançar a expressão genética indutível da luz azul. Este sistema consiste em um ativador transcricional, TAEL, que escurece após a iluminação com luz azul e ativa a transcrição de um gene de interesse a jusante de um elemento regulatório C120. A expressão induzida de um repórter do GFP pode ser detectada após apenas 30 minutos de exposição à luz, sugerindo que essa abordagem possui cinética relativamente rápida e responsiva.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ferramenta de ilustração científica baseada na web BioRender			Câmera
digital CCD https://biorender.com/ Color	Lumenara	755-107
Console compacto de medidor de energia e energia, LCD digital de 4	Thorlabs	PM100D
, 545 nm	Olympus	ET545 / 25x
illustra RNAspin Mini kit	GE Healthcare	95017-491
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS15-10
MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (azul e branco)	Amazon	B017GWDF7E
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M7140
NEARPOW Interruptor de temporizador digital programável	Amazon	B01G6O28NA
PerfeCTa SYBR verde mistura rápida	Quantabio	101414-286
Software de processamento de imagem	Photoshop Adobe
Prism software de gráficos e estatísticas	GraphPad
qScript XLT cDNA SuperMix	Quantabio	10142-786
QuantStudio 3 Sistema de PCR em Tempo Real	Applied Biosystems	A28137
Estereomicroscópio	Olympus	SZX16
Tricaine (Etil 3-aminobenzoato metanossulfonato)	Sigma-Aldrich	E10521
X-Cite 120 Fonte de luz LED de fluorescência	Excelitas	010-00326R	Descontinuado. Ele foi substituído pelo X-Cite mini+