Ensaios automatizados usando microplatas multi-poços são abordagens vantajosas para identificar reguladores de vias, permitindo a avaliação de uma infinidade de condições em um único experimento. Aqui, adaptamos o bem estabelecido protocolo de imagem e quantificação de macropinoso para um formato de microplacão de 96 poços e fornecemos um contorno abrangente para automação usando um leitor de placas de vários modos.
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Artigo de método
Imagem e Análise Automatizada para a Quantificação de Macropinoss fluorescentes rotulados
Neste artigo
Resumo
Resumo
Macropinocistose é uma via de absorção não específica da fase de fluidos que permite que as células internalizem grandes cargas extracelulares, como proteínas, patógenos e detritos celulares, através da endocitose a granel. Esse caminho desempenha um papel essencial em uma variedade de processos celulares, incluindo a regulação de respostas imunes e metabolismo de células cancerosas. Dada essa importância na função biológica, examinar as condições da cultura celular pode fornecer informações valiosas identificando reguladores dessa via e otimizando condições a serem empregadas na descoberta de novas abordagens terapêuticas. O estudo descreve uma técnica automatizada de imagem e análise utilizando equipamentos de laboratório padrão e um leitor de placas multimodestração de imagem celular para a rápida quantificação do índice macropinocítico em células aderentes. O método automatizado baseia-se na absorção de dextran fluorescente de alto peso molecular e pode ser aplicado a microplacões de 96 poços para facilitar avaliações de múltiplas condições em um experimento ou amostras fixas montadas em tampas de vidro. Esta abordagem visa maximizar a reprodutibilidade e reduzir a variação experimental, ao mesmo tempo em que economiza tempo e econômica.
Introdução
A via endocítica não específica da macropinocistose permite que as células internalizem uma variedade de componentes extracelulares, incluindo nutrientes, proteínas, antígenos e patógenos, através da absorção em massa de fluido extracelular e seus constituintes1. Embora importante para a biologia de numerosos tipos celulares, cada vez mais, a via macropinotose é descrita como um papel essencial na biologia tumoral, onde, através da absorção macropinócítica, as células tumorais são capazes de sobreviver e proliferar na presença de um microambiente empobrecido de nutrientes2,3. A absorção....
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Protocolo
1. Preparação de materiais
- Dissolver 70 kDa dextran rotulado com FITC ou tetrametilrhodamina (TMR) em PBS para obter uma solução de 20 mg/mL. Armazene as alíquotas a -20 °C.
- Dissolver o DAPI no ddH2O para obter uma solução de 1 mg/mL. Armazene as alíquotas a -20 °C.
ATENÇÃO: O DAPI é um potencial cancerígeno e deve ser tratado com cuidado. - No dia da fixação, prepare formaldeído fresco de grau ACS de 3,7% na PBS.
ATENÇÃO: O formaldeído é um carcinógeno fixável e conhecido e é tóxico se inalado. Faça a solução em um capô de fumaça química para evitar a inalação e manuseie com cuidado. - Prepare as tampas lavadas com....
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Resultados
Quando as etapas e o ajuste do protocolo acima descrito são seguidos em conformidade, os resultados experimentais finais devem fornecer informações sobre se as condições de cultura celular estudadas ou inibidores induzem ou reduzem a macropinocistose na linha celular de interesse. Para fortalecer a validade desses achados, a inclusão das condições de controle permitirá a análise dos resultados para determinar se o experimento foi concluído com sucesso. Os controles de indução da macropinocitose fornecerão informações sob.......
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Discussão
A qualidade dos experimentos e a aquisição de dados dependem muito da qualidade dos reagentes, da otimização das configurações e da limpeza das tampas e das microplacões. Os resultados finais devem dar uma variação mínima entre as réplicas; no entanto, as variações biológicas ocorrem naturalmente ou podem ser causadas por uma série de fatores. A densidade celular pode fazer com que as células respondam mais ou menos aos indutores ou inibidores da macropinocitose. É, portanto, crucial aderir à confluência de 80% proposta .......
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Divulgações
C.C. é um inventor de uma patente emitida intitulada ''Diagnóstico de câncer, terapêutica e descoberta de medicamentos associados à macropinocistose'', Patente nº 9.983.194.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por subvenções do NIH/NCI (R01CA207189, R21CA243701) a C.C. KMO.G. é um beneficiário do TRDRP Postdoctoral Fellowship Award (T30FT0952). O BioTek Cytation 5 é uma parte do Núcleo de Imagens de Células Prebys de Sanford Burnham, que recebe apoio financeiro do NCI Cancer Center Support Grant (P30 CA030199). As figuras 1-3 foram criadas utilizando-se o BioRender.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,25% Tripsina | Corning | 25053CI | 0,1% EDTA em HBSS sem Bicarbonato de Cálcio, Magnésio e Sódio |
| 1,5 mL Tubo de microcentrífuga | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| Placa de cultura de tecidos de 10 cm | Greiner Bio-One | 664160 | CELLSTAR |
| 15 mL Tubo de centrífuga | Fisherbrand | 07-200-886 | |
| 2 L Copo | Fisherbrand | 02-591-33 | |
| Placa de cultura de tecidos de 24 poços | Greiner Bio-One | 662160 | CELLSTAR |
| 25 mL Reservatório de reagente | Genesee Scientific Corporation | 28-121 | |
| Copo de 500 mL | Fisherbrand | 02-591-30 | |
| Placa de cultura de tecidos de 6 cm | Greiner Bio-One | 628160 | CELLSTAR |
| Adaptador de aspiração de 8 canais | Integra Biosciences | 155503 | |
| adaptador de aspiração de 8 canais para pontas padrão | Integra Biosciences | 159024 | |
| 95% Etanol | Decon Laboratories Inc | 4355226 | |
| Limpador de vidros sem amônia | Sparkle | FUN20500CT | |
| Black de 96 poços | PerkinElmer | 6055300 | CellCarrier-96 Ultra |
| Aplicador com ponta de algodão | Fisherbrand | 23-400-101 | |
| Lamínulas | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| Leitor multimodo de imagem de 5 células de | Biotek | CYT5FW | |
| DAPI | Millipore Sigma | 5.08741 | |
| Dextrano 70 kDa - FITC | Life Technologies | D1822 | Fixável por lisina |
| Dextran 70 kDa - TMR | Life Technologies | D1819 | |
| DMSO Millipore Sigma | D1435 | ||
| DPBS | Corning | 21031CV | Sem Pinça de Cálcio e Magnésio |
| Ciência Fina | 11251-20 | Dumont #5 | |
| Formaldeído, 37% | Ricca Químico | RSOF0010-250A | ACS Reagente Grau |
| Glicerol Fisher | BioReagents | BP229-1 | |
| Mídia de montagem de fluorescência endurecedora | Agilent Tech | S302380-2 | DAKO |
| Hoechst 33342 | Millipore Sigma | B2261 | |
| Ácido clorídrico (HCl) | Fisher Chemical | A144-212 | Certificado ACS Plus, 36,5%– 38.0% |
| Toalhetes sem fiapos | Kimberly-Clark | 34155 | Kimwipes |
| Lâminas Miscroscope | Fisherbrand | 12-544-1 | Pipeta multicanal de vidro liso premium |
| Gilson | FA10013 | 8 canais, 0.5– 10 µ L | |
| Pipeta multicanal | Gilson | FA10012 | 12 canais, 20– 200 µ L |
| Pipeta multicanal | Gilson | FA10011 | 8 canais, 20– 200 µ L |
| Parafilm M | Pechiney | PM996 | |
| Filme plástico | Kirkland Signature | 208733 | Stretch-Tite |
| Isoladores de silicone | Grace Bio Labs Inc | 664107 | 13 mm de diâmetro X 0,8 mm de profundidade ID, 25 mm X 25 mm |
| Adaptador de slide | Biotek | 1220548 | |
| Garrafa de lavagem | Fisherbrand | FB0340922C |
Referências
- Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. Macropinocytosis in different cell types: similarities and differences. Membranes. 10 (8), 21(2020).
- Recouvreux, M. V., Commisso, C. Macropinocytosis: a metabolic adaptation to nutrient stress in cancer. Frontier....
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Reimpressões e permissões
