Method Article

Construção de membranas lipídicas modelo incorporando receptores acoplados de proteína G (GPCRs)

DOI:

10.3791/62830

⸱

February 5th, 2022

 ,  , 
1Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Southern California

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo utiliza o inchaço de agarose como uma técnica poderosa e generalizável para incorporar proteínas de membrana integral (IMPs) em vesículas lipídicas unilamellar gigantes (GUVs), como descrito aqui para a reconstituição da proteína humana receptora de serotonina 1A (5-HT1AR), uma das classes de receptores farmacofarologicamente importantes acoplados à proteína G.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Investigações in vitro robustas da estrutura e função das proteínas da membrana integral tem sido um desafio devido às complexidades da membrana plasmática e aos inúmeros fatores que influenciam o comportamento proteico nas células vivas. Vesículas unilamellar gigantes (GUVs) são um sistema de modelo biomimético e altamente incapaz de in vitro para investigar interações proteína-membrana e sondar o comportamento proteico de forma precisa e dependente de estímulos. Neste protocolo, apresentamos um método barato e eficaz para a fabricação de GUVs com o receptor humano de serotonina 1A (5-HT1AR) firmemente integrado na membrana. Fabricamos GUVs usando um método modificado de inchaço de hidrogel; depositando uma película lipídica em cima de uma mistura de agarose e 5-HT1AR e, em seguida, hidratando todo o sistema, as vesículas podem ser formadas com 5-HT1AR devidamente orientados e funcionais incorporados na membrana. Esses GUVs podem então ser usados para examinar interações proteína-membrana e comportamento de localização via microscopia. Em última análise, este protocolo pode avançar nossa compreensão da funcionalidade das proteínas da membrana integral, fornecendo uma visão fisiológica profunda.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As membranas de modelo sintético são ferramentas poderosas na investigação das propriedades e funções fundamentais dos biomembranos. Vesículas unilamellar gigantes (GUVs) são uma das plataformas mais proeminentes para estudar uma variedade de propriedades de membrana plasmática e podem ser projetadas para imitar diferentes condições fisiológicas1,2,3,4,5,6,7,8. Está bem estabelecido que a membrana plasmática e sua organização desempenham um papel fundamental em uma infinidade de processos celulares, como transdução de sinal, adesão, endocitose e transporte9,10,11,12,13,14,15.

Os GUVs foram fabricados utilizando vários métodos, incluindo hidratação suave16, inchaço de hidrogel17, eletroformação18, técnicas microfluídicas19,20,21,22, jetting23 e troca de solventes24,25,26. Devido aos desafios no manuseio de proteínas de membrana integral (IMPs), as plataformas in vitro para estudá-las têm sido limitadas. Os GUVs apresentam uma plataforma simplificada para estudar IMPs em um ambiente que imita seu ambiente nativo. Embora tenha havido várias abordagens para a reconstituição de proteínas nos GUVs, os desafios surgem da incorporação de proteínas com a orientação correta e manutenção da funcionalidade proteica27.

A reconstituição de proteínas mais bem sucedida em GUVs requer o método de troca de detergentes; que envolve solubilizar as proteínas de seu ambiente nativo por detergentes, seguido pela purificação de proteínas, e, em seguida, substituir as moléculas de detergente por lipídios através de vários métodos28. Enquanto os detergentes servem para estabilizar a estrutura terciária dos IMPs durante a purificação, as micelas detergentes são um ambiente relativamente antinatural para essas proteínas, que são melhor estabilizadas, particularmente para estudos funcionais, em bicamadas lipídicas28,29,30. Além disso, a incorporação de proteínas transmembranas funcionais na bicamada lipídica utilizando técnicas tradicionais de fabricação de GUV tem sido difícil devido ao tamanho, à delicadeza dessas proteínas e às etapas adicionais de troca de detergente que seriam necessárias27,31,32,33. O uso de solvente orgânico para remover detergentes causa agregação de proteínas e desnaturação34. Um método melhorado mediado por detergente tem sido promissor, no entanto, é necessário cautela para a etapa de remoção do detergente e a otimização pode ser necessária para proteínas específicas31,35. Além disso, métodos que utilizam a eletroformação podem restringir a escolha da proteína e podem não ser adequados para todas as composições lipídicas especialmente lipídios carregados31,36,37. Outra técnica que tem sido utilizada é a fusão induzida por peptídeos de grandes vesículas unilamellar (LUVs) contendo a proteína desejada com GUVs, embora tenha sido considerada trabalhosa e pode levar à inserção de moléculas estranhas - os peptídeos fusogênicos33,38,39. As vesículas gigantes da membrana plasmática (GPMVs), derivadas de células vivas, podem ser usadas para superar algumas dessas questões, porém permitem o controle mínimo da composição lipídica e proteica resultante14,40,41. Portanto, a integração dos IMPs na camada bilipid de GUVs utilizando nosso método de inchaço agarose modificado apresenta um método confiável para examinar ainda mais essas proteínas no ambiente da membrana42,43,44,45.

A sinalização e comunicação celular envolve uma família de proteínas conhecidas como receptores acoplados à proteína G (GPCRs); Os GPCRs estão entre a maior família de proteínas e estão associados à modulação do humor, apetite, pressão arterial, função cardiovascular, respiração e sono entre muitas outras funções fisiológicas46. Neste estudo, utilizamos o receptor humano de serotonina 1A (5-HT1AR), que é um membro prototípico da família GPCR. 5-HT1AR pode ser encontrado no sistema nervoso central (SNC) e vasos sanguíneos; influencia inúmeras funções como funções cardiovasculares, gastrointestinais, endócrinas, além de participar da regulação do humor47. Uma grande barreira à pesquisa de GPCR surge de sua complexa estrutura anfílica, e os GUVs apresentam uma plataforma promissora para a investigação de várias propriedades de interesse, que vão desde a funcionalidade proteica, interações lipídica-proteínas e interações proteína-proteína. Várias abordagens têm sido utilizadas para estudar interações lipídica-proteína, como ressonância de plasmon superficial (SPR)48,49, espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR)50,51, sobreposição lipídica proteica (OLP) ensaio51,52,53,54, espectrometria de massa nativa555, calorimetria de titulação isotemal (ITC)56,57, e lipososom ensaio de sedimentação58,59. Nosso laboratório tem usado a abordagem simplificada do GUV para investigar o efeito das interações lipídica-proteína na funcionalidade proteica, incapsulando BODIPY-GTPγS, que se liga à subunidade Giα no estado ativo do receptor. Sua ligação insocra o fluoróforo produz um sinal de fluorescência que poderia ser detectado ao longo do tempo45. Além disso, vários estudos investigaram as interações lipídica-proteínas e o papel das proteínas na detecção ou estabilização da curvatura da membrana60,61, e utilizar uma abordagem Uctávia viável do GUV pode ser uma vantagem fundamental.

Este protocolo demonstra um método simples para incorporar GPCRs na membrana de GUVs usando um sistema de hidrogel agarose modificado17,42. Além disso, com base em nosso trabalho anterior, nosso método pode ser adequado para IMPs que podem suportar exposição a curto prazo a 30-40 °C. Resumidamente, espalhamos um filme fino de agarose combinado com fragmentos de membrana contendo o GPCR de interesse. Após a gelação desta camada, depositamos uma solução lipídica em cima da agarose e permitimos que o solvente evapore. A reidratação do sistema foi então realizada com um tampão aquoso, resultando na formação de GUVs com proteína incorporada na bicamada lipídica.

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Protocol

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1. Rotulagem de proteínas

  1. Permita que os fragmentos de membrana NHS-Rhodamine, 5-HT1A e uma coluna de dessecação de spin de 7 K MWCO se equilibrem à temperatura ambiente.
  2. Dissolver 1 mg de NHS-rhodamina em 100 μL de sulfóxido de dimetila (DMSO).
  3. Adicione 5 μL de solução de bicarbonato de sódio de 1 M para aumentar o pH da solução 5-HT1AR ao pH 8.
  4. Adicione 3,66 μL da solução NHS-rhodamine a 50 μL da solução 5-HT1AR e pipeta suavemente para cima e para baixo em um tubo de microcentrifuuge.
    NOTA: Certifique-se de ter pelo menos 10x de excesso molar de NHS-rhodamina.
  5. Mantenha a mistura protegida da luz e coloque o rotador em temperatura ambiente por 1h.
  6. Lave uma coluna de giro de 7 k MWCO com 200 μL de soro fisiológico tampão de fosfato de 1x (1x PBS) três vezes por 1,5 min a 1,5 RCF para cada lavagem.
  7. Adicione a proteína rotulada a uma coluna e equilibre a quantidade em outro tubo de microcentrífuga.
  8. Gire a proteína rotulada uma vez por 5 min a 1,5 RCF.
  9. Pegue um espectro UV-vis usando um espectotúmetro nanodrop a 280 nm e 554 nm e calcule a eficiência de rotulagem seguindo o manual do fabricante.
  10. Armazene a proteína rotulada coberta a 5 °C até que use mais. A solução é estável por aproximadamente uma semana após a rotulagem.

2. GUVs com 5-HT 1A incorporados por membrana

  1. Preparação de materiais e reagentes
    1. Permita que a proteína, lipídios e BSA (albumina de soro bovino) se equilibrem até a temperatura ambiente.
    2. Durante este tempo, limpe as tampas colocando-as em metanol e sonicando por 30 min a 40 °C. Certifique-se de que o metanol cubra completamente as manchas e que o nível de água no banho de água esteja acima do nível do metanol no recipiente.
      NOTA: O metanol é tóxico e deve ser manuseado em capô químico apropriado.
    3. Seque o excesso de metanol nas tampas com um fluxo suave de ar. Coloque o rack de deslizamento coberto em um forno de 40 °C por 15 minutos para garantir que as tampas em excesso sequem.
    4. Comece o processo de limpeza do plasma. Primeiro, coloque as tampas no limpador de plasma e feche a válvula de entrada de ar para evacuar todo o ar dentro da câmara.
    5. Uma vez que a câmara esteja sob vácuo, limpe as tampas por 5 minutos usando uma configuração de alta potência rf e um vácuo quase completo, com apenas uma leve entrada de ar na câmara de vácuo. Para garantir o nível adequado de plasma, ajuste a abertura da câmara de vácuo de modo que a cor resultante do plasma seja um rosa estável e brilhante.
      NOTA: É crucial ao usar o ar que o plasma permanece uma cor rosa brilhante durante a duração da etapa de tratamento plasmápide, pois uma cor roxa mais escura indica que há uma quantidade inadequada de ar na câmara e resultará em um tratamento de plasma subótimo.
    6. Uma vez que os 5 minutos tenham passado, desligue a energia RF e solte o vácuo.
      NOTA: Após a remoção da câmara de plasma, certifique-se de que as manchas permanecem cobertas.
  2. Preparação de hidrogel
    1. Combine 6 mg de temperatura de fusão ultra-baixa com 300 μL de água ultrauso (ou seja, 2% (w/v) agarose).
      NOTA: 2% de agarose serão usados para fazer GUVs livres de proteínas. A solução de agarose pode ser mantida a 45 °C por dois dias.
    2. Combine 9 mg de temperatura ultra-baixa agarose com 300 μL de água ultrapura por 3 w/v% agarose como preparado na etapa 3.1. 3% de agarose será usado para fazer GUVs incorporados de proteína.
    3. Vórtice a solução brevemente antes de colocá-los no bloco de calor de 90 °C por 10 minutos. Em seguida, o vórtice do tubo novamente antes de transferi-lo para um bloco de calor de 45 °C para mantê-lo na forma derretida até que use mais.
  3. Agarose e mistura de proteínas
    1. Misture 21 μL de 3% de agarose com os 7 μL de fragmentos de membrana 5-HT1AR. Pipeta para cima e para baixo lentamente muitas vezes para garantir a mistura adequada. Em seguida, incubar a 45 °C por 1 min.
  4. Deposição de hidrogel e lipídida
    1. Para GUVs livres de proteínas: Faça uma película fina em tampas recém-limpas com plasma usando 20 μL de 2% de agarose. Solte rapidamente outra mancha de cobertura em cima da gotícula de agarose e deslize suavemente as tampas para fazer uma película fina em ambas as tampas.
      NOTA: Este passo é complicado na medida em que o deslizamento da gota deve ocorrer enquanto a agarose ainda está na forma derretida.
    2. Para GUVs incorporados por proteínas: Pipeta a mistura proteína/agarose para cima e para baixo mais uma vez, e, em seguida, depositar 20 μL dos 2% de agarose em uma tampa limpa de plasma. Siga as instruções de desemrapante, conforme descrito acima.
    3. Deixe a agarose gel protegido da luz por 30 minutos à temperatura ambiente.
    4. Deposite os lipídios em cima da camada agarose. Use um total de 10 μL de 2 mg/mL de 1-palmitoyl-2-oleoyl-glicero-3-fosforcholina (POPC) com 0,4 Mol% 1,2-Dipalmitoyl-sn-gliceo-3-fosfoetanolamina (DPPE) rotulado com ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (ou mistura lipídica de interesse) em clorofórmio em cima do filme agarose. Deposite as gotículas usando uma agulha de cromatografia a gás e espalhe uma gota de cada vez através de uma corrente de ar suave.
      NOTA: É necessário cuidado com esta etapa para fazer uma camada relativamente uniforme de lipídios em cima do hidrogel. Além disso, o clorofórmio é tóxico e deve ser manuseado em capô químico apropriado.
    5. Monte as câmaras Sykes-Moore (S-M) colocando um o-ring em cima do deslizamento de tampas e, em seguida, colocando o componente superior da câmara em cima do anel O. Use a chave fornecida pelo fabricante para montar a câmara, aparafusando os componentes da câmara para selar a câmara e evitar qualquer vazamento.
      NOTA: A parte superior da câmara deve ser apertada no anel O, mas é necessário cautela para garantir que o deslizamento de tampa permaneça intacto, pois o deslizamento de tampa pode rachar se o anel O não se sentar corretamente na câmara. Além disso, certifique-se de que a câmara esteja bem fechada para que a câmara não vaze quando a solução de inchaço for adicionada. A não ressarcimento da câmara resultará em vazamentos e perda de amostra.
  5. Inchaço e colheita de vesículas
    1. Hidrate todo o sistema, tubondo suavemente 450 μL de sacarose de 200 mM em 1x PBS e tocando suavemente as câmaras para garantir uma cobertura tampão adequada das camadas hidrogel-lipídicas.
      NOTA: A solução de sacarose pode ser substituída por um tampão de reidratação contendo sondas biológicas de interesse.
    2. Coloque as câmaras a 45 °C e cubra a parte superior da câmara com uma tampa para evitar a evaporação. Deixe a amostra inchar, protegida de detritos e luz por 1h.
    3. Adicione 100 μL de 1 mg/mL BSA em água ultrauso em cada poço de uma placa de 96 poços destinada a ser usada. Incubar em temperatura ambiente por 1h.
    4. Lave três vezes com água ultra-pura e uma vez com sacarose de 200 mM em 1x PBS.
    5. Por fim, adicione 200 mM de glicose em 1x PBS até a adição da solução amostral GUV.
      NOTA: O BSA foi usado para bloquear a adsorção do GUV.
    6. Depois de permitir que o hidrogel incha, agite suavemente e bata na câmara para desalojar quaisquer GUVs que possam permanecer ligados à superfície do hidrogel. Em seguida, cuidadosamente pipeta até a solução GUV-sucrose.
      NOTA: Como um passo opcional para garantir que todas as vesículas sejam separadas da superfície, pipete suavemente parte da suspensão de sacarose de volta para a superfície do hidrogel.
    7. Mova a suspensão para um tubo de microcentrifuuge previamente preparado contendo 700 μL de glicose de 200 mM em 1x PBS.
      NOTA: O gradiente de densidade levará à fixação das vesículas na parte inferior do tubo centrífuga.
    8. Permita que as vesículas se contentem por mais uma hora para garantir que as vesículas possam afundar até o fundo do tubo de microcentrifusagem, permitindo uma coleta ideal.
    9. Após a fixação de GUVs em glicose, transfira 300 μL da parte inferior do tubo de centrífuga (as vesículas assentadas) para a placa de 96 poços previamente preparada e tratada por BSA para examinar as vesículas sob o microscópio confocal.
      NOTA: Certifique-se de evitar a parte inferior do tubo de microcentragem para minimizar a quantidade de detritos coletados na amostra final.
  6. Verifique as amostras sob o microscópio.
    1. Brilhe um laser de 488 nm na amostra (que nos permite visualizar a membrana, já que a bicamada foi rotulada com ATTO-488-DPPE).
    2. Brilhe um laser de 561 nm na amostra (que nos permite visualizar a proteína, uma vez que foi rotulada com NHS-Rhodamine).
      NOTA: É necessário ter cuidado ao ver a amostra como a fotooxidação pode desestabilizar as vesículas. Vesículas foram observadas no mesmo dia.

figure-protocol-1
Figura 1: Ilustração das etapas detalhadas do protocolo. Criado com BioRender.com Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A concentração de proteína foi medida, e o grau de rotulagem foi calculado como a razão molar entre o corante e a proteína a ser de 1:1. Examinando os GUVs utilizando microscopia confocal, pudemos confirmar a formação bem sucedida e a integração proteica das vesículas. Os lipídios foram rotulados com 0,4 mol% ATTO 488-DPPE, e a proteína foi rotulada covalentemente através da modificação de rhodamina NHS-éster de aminas primárias. A Figura 2a e a Figura 2b mostra...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identificamos duas etapas que são fundamentais para o sucesso do protocolo geral: tratamento plasmás e deposição lipídica. A limpeza plasmática das tampas é essencial para garantir que haja cobertura adequada e adesão do hidrogel agarose ao deslizamento de tampas de vidro. A limpeza plasmática realiza duas coisas: primeiro, remove vestígios de matéria orgânica da superfície do vidro; segundo, ativa a superfície do deslizamento de tampas, permitindo um aumento na capacidade de verícula à medida que a hidrofilidade da supe...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Matthew Blosser por valiosa discussão e conselhos. Este trabalho foi apoiado pelo Escritório de Pesquisa Naval (N00014-16-1-2382) e pela Fundação Nacional de Ciência (PHY-1915017).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL850375C-25mg
  Microscópio invertido TI-EclipseNikon, Melville, NYEclipse Ti
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DPPC)Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ O-rings de silicone ODSterling Seal & Fornecimento, Netuno, IN5-003-8770
Câmera de dispositivo acoplado de carga múltipla de 512 elétrons Cascade II de 16 bitsPhotometrics, Huntington Beach, CA  Cascade II 512
1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC)Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL850457C-25mg
Lasers de estado sólido de 50 mW a 488 nm e filtro de emissão centrado em 525 nm e 561 nm com filtro de emissão centrado em 595 nmCoherent, Santa Clara, CA488/561-50-LS
Fragmentos de membrana 5-HT1ARPerkin Elmer, Waltham, MARBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPPE)ATTO-TEC, Siegen, AlemanhaAD 488-155
Limpador de plasma de bancadaHarrick Plasma, Ithaca, NYPDC-32G
(BSA)Sigma Aldrich, St. Louis, MOA9418
clorofórmio (CHCl3)Millipore Sigma, Burlington, MACX1055
Colesterol (Chol)Sigma Aldrich, St. Louis, MOC8667-5G
Corning 96-well Flat Clear BottomCorning, Corning, NY3904
Elmasonic E-Series E15H UltrasonicElma, Singen, Alemanha[não mais vendido no site principal]
glicoseSigma Aldrich, St. Louis, MOG7528
metanol (MeOH)Millipore Sigma, Burlington, MAMX0485
NanoDrop ND-1000Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAND-1000
NHS-RhodamineThermo Fisher Scientific, Waltham, MA46406
solução salina tamponada com fosfato (PBS) (10x PBS)Corning, Corning, NY21-040
cabeça confocal CSUX de disco giratórioYokogawa, Tóquio, JapãoCSU-X1
lamínulas de vidro padrão de 25 mm nº 1ChemGlass, Vineland, NJCLS-1760
sacaroseSigma Aldrich, St. Louis, MOS7903
Câmaras Sykes-MooreBellco, Vineland, NJ1943-11111
Agarose de temperatura de fusão ultrabaixaSigma Aldrich, St. Louis, MOA5030
VWR Bloco de calor analógicoVWR International, Radnor, PA[já não vendido no site principal]
VWR Tube RotatorVWR International, Radnor, PA10136-084
Colunas de dessalinização Zeba Spin, 7K MWCO, 0,5 mLThermo Fisher Scientific, Waltham, MA89882
Albumina de soro bovino

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9, 467-508 (1980).
  2. Mouritsen, O. G. Model answers to lipid membrane questions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), 004622(2011).
  3. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  4. Li, S., Hu, P., Malmstadt, N. Confocal imaging to quantify passive transport across biomimetic lipid membranes. Analytical Chemistry. 82 (18), 7766-7771 (2010).
  5. Lingwood, D., Simons, K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2010).
  6. Elbaradei, A., Brown, S. L., Miller, J. B., May, S., Hobbie, E. K. Interaction of polymer-coated silicon nanocrystals with lipid bilayers and surfactant interfaces. Physical Review E. 94 (4), 042804(2016).
  7. Veatch, S. L., Keller, S. L. Organization in lipid membranes containing cholesterol. Physical Review Letters. 89 (26), 268101(2002).
  8. Plasencia, I., Norlén, L., Bagatolli, L. A. Direct visualization of lipid domains in human skin stratum corneum's lipid membranes: Effect of pH and temperature. Biophysical Journal. 93 (9), 3142-3155 (2007).
  9. Dietrich, C., et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophysical Journal. 80 (3), 1417-1428 (2001).
  10. Deans, J. P., Li, H., Polyak, M. J. CD20-mediated apoptosis: signalling through lipid rafts. Immunology. 107 (2), 176-182 (2002).
  11. Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 32, 257-283 (2003).
  12. Pike, L. J. Lipid rafts: bringing order to chaos. Journal of Lipid Research. 44 (4), 655-667 (2003).
  13. Tsui-Pierchala, B. A., Encinas, M., Milbrandt, J., Johnson, E. M. Lipid rafts in neuronal signaling and function. Trends in Neurosciences. 25 (8), 412-417 (2002).
  14. Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
  15. Scheve, C. S., Gonzales, P. A., Momin, N., Stachowiak, J. C. Steric pressure between membrane-bound proteins opposes lipid phase separation. Journal of the American Chemical Society. 135 (4), 1185-1188 (2013).
  16. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  17. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of agarose enable rapid formation of giant liposomes in solutions of physiologic ionic strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  18. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81 (0), 303-311 (1986).
  19. Teh, S. -Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), (2011).
  20. Hu, P. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic fabrication of asymmetric giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (5), 1434-1440 (2011).
  21. Lu, L., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Continuous microfluidic fabrication of synthetic asymmetric vesicles. Lab on a Chip. 15 (17), 3591-3599 (2015).
  22. Maktabi, S., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Dewetting-induced formation and mechanical properties of synthetic bacterial outer membrane models (GUVs) with controlled inner-leaflet lipid composition. Soft Matter. 15 (19), 3938-3948 (2019).
  23. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  24. Kim, S., Martin, G. M. Preparation of cell-size unilamellar liposomes with high captured volume and defined size distribution. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 646 (1), 1-9 (1981).
  25. Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).
  26. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. le Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  29. Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods in Enzymology. 372, 65-86 (2003).
  30. Renthal, R. An unfolding story of helical transmembrane proteins. Biochemistry. 45 (49), 14559-14566 (2006).
  31. Jørgensen, I. L., Kemmer, G. C., Pomorski, T. G. Membrane protein reconstitution into giant unilamellar vesicles: a review on current techniques. European Biophysics Journal. 46 (2), 103-119 (2017).
  32. Hansen, J. S., et al. Formation of giant protein vesicles by a lipid cosolvent method. ChemBioChem. 12 (18), 2856-2862 (2011).
  33. Kahya, N., Pécheur, E. -I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
  34. Kahya, N., Merkle, D., Schwille, P. Pushing the complexity of model bilayers: Novel prospects for membrane biophysics. Fluorescence of Supermolecules, Polymers, and Nanosystems. , 339-359 (2008).
  35. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Lévy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  36. Shaklee, P. M., et al. Protein incorporation in giant lipid vesicles under physiological conditions. ChemBioChem. 11 (2), 175-179 (2010).
  37. Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1712 (2), 152-160 (2005).
  38. Girard, P., et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 87 (1), 419-429 (2004).
  39. Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  40. Levental, I., et al. Cholesterol-dependent phase separation in cell-derived giant plasma-membrane vesicles. The Biochemical Journal. 424 (2), 163-167 (2009).
  41. López-Montero, I., Rodríguez-García, R., Monroy, F. Artificial spectrin shells reconstituted on giant vesicles. The Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (12), 1583-1588 (2012).
  42. Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. Journal of the American Chemical Society. 135 (46), 17294-17297 (2013).
  43. Gutierrez, M. G., Malmstadt, N. Human serotonin receptor 5-HT 1A preferentially segregates to the liquid disordered phase in synthetic lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 136 (39), 13530-13533 (2014).
  44. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  45. Gutierrez, M. G., Mansfield, K. S., Malmstadt, N. The functional activity of the human serotonin 5-HT 1A receptor is controlled by lipid bilayer composition. Biophysical Journal. 110, 2486-2495 (2016).
  46. Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs. Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
  47. Nichols, D. E., Nichols, C. D. Serotonin receptors. Chemical Reviews. 108 (5), 1614-1641 (2008).
  48. Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using surface plasmon resonance to quantitatively assess lipid-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1376, Clifton, N.J. 141-153 (2016).
  49. Place, J. F., Sutherland, R. M., Dähne, C. Opto-electronic immunosensors: a review of optical immunoassay at continuous surfaces. Biosensors. 1 (4), 321-353 (1985).
  50. Brown, M. F., Miljanich, G. P., Franklin, L. K., Dratz, E. A. H-NMR studies of protein-lipid interactions in retinal rod outer segment disc membranes. FEBS letters. 70 (1), 56-60 (1976).
  51. Sun, F., et al. Structural basis for interactions of the Phytophthora sojae RxLR effector Avh5 with phosphatidylinositol 3-phosphate and for host cell entry. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (3), 330-344 (2013).
  52. Kavran, J. M., et al. Specificity and promiscuity in phosphoinositide binding by pleckstrin homology domains. The Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30497-30508 (1998).
  53. Stevenson, J. M., Perera, I. Y., Boss, W. F. A phosphatidylinositol 4-Kinase pleckstrin homology domain that binds phosphatidylinositol 4-Monophosphate. Journal of Biological Chemistry. 273 (35), 22761-22767 (1998).
  54. Han, X., Yang, Y., Zhao, F., Zhang, T., Yu, X. An improved protein lipid overlay assay for studying lipid-protein interactions. Plant Methods. 16 (1), 33(2020).
  55. Yen, H. -Y., et al. PtdIns(4,5)P 2 stabilizes active states of GPCRs and enhances selectivity of G-protein coupling. Nature. 559 (7714), 423-427 (2018).
  56. Myers, M., Mayorga, O. L., Emtage, J., Freire, E. Thermodynamic characterization of interactions between ornithine transcarbamylase leader peptide and phospholipid bilayer membranes. Biochemistry. 26 (14), 4309-4315 (1987).
  57. Swamy, M. J., Sankhala, R. S. Probing the thermodynamics of protein-lipid interactions by isothermal titration calorimetry. Lipid-Protein Interactions: Methods and Protocols. , 37-53 (2013).
  58. Han, X., Shi, Y., Liu, G., Guo, Y., Yang, Y. Activation of ROP6 GTPase by phosphatidylglycerol in arabidopsis. Frontiers in Plant Science. 0, (2018).
  59. Surolia, A., Bachhawat, B. K. The effect of lipid composition on liposome-lectin interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 83 (3), 779-785 (1978).
  60. Sarkis, J., Vié, V. Biomimetic models to investigate membrane biophysics affecting lipid-protein interaction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 270(2020).
  61. McMahon, H. T., Boucrot, E. Membrane curvature at a glance. Journal of Cell Science. 128 (6), 1065-1070 (2015).
  62. Banerjee, K. K., Kumar, S., Bremmell, K. E., Griesser, H. J. Molecular-level removal of proteinaceous contamination from model surfaces and biomedical device materials by air plasma treatment. Journal of Hospital Infection. 76 (3), 234-242 (2010).
  63. Raiber, K., Terfort, A., Benndorf, C., Krings, N., Strehblow, H. -H. Removal of self-assembled monolayers of alkanethiolates on gold by plasma cleaning. Surface Science. 595 (1), 56-63 (2005).
  64. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A 2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  65. Garten, M., Levy, D., Bassereau, P. The giant vesicle book. The giant vesicle book. , 38-51 (2021).
  66. Gutierrez, M. G., et al. G Protein-coupled receptors incorporated into rehydrated diblock copolymer vesicles retain functionality. Small. 12 (38), Weinheim an der Bergstrasse, Germany. 5256-5260 (2016).
  67. Peruzzi, J., Gutierrez, M. G., Mansfield, K., Malmstadt, N. Dynamics of hydrogel-assisted giant unilamellar vesicle formation from unsaturated lipid systems. Langmuir. 32 (48), 12702-12709 (2016).
  68. Shchelokovskyy, P., Tristram-Nagle, S., Dimova, R. Effect of the HIV-1 fusion peptide on the mechanical properties and leaflet coupling of lipid bilayers. New Journal of Physics. 13, 025004(2011).

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