Method Article

Software de aquisição de dados totalmente automatizado para microscopia crio-elétron de partículas únicas

DOI:

10.3791/62832

⸱

July 29th, 2021

 ,  ,  , 
1Molecular Biophysics Unit, Indian Institute of Science, 2Gatan Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A microscopia crio-elétron de partículas únicas exige um pacote de software adequado e um pipeline fácil de usar para aquisição automática de dados de alto rendimento. Aqui, apresentamos a aplicação de um pacote de software de aquisição de imagens totalmente automatizado, o Latitude-S, e um pipeline prático para coleta de dados de biomoléculas vitrificadas em condições de baixa dose.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos últimos anos, avanços tecnológicos e metodológicos na microscopia crio-elétron de partículas únicas (crio-EM) abriram um novo caminho para a determinação da estrutura de alta resolução de macromoléculas biológicas. Apesar dos avanços notáveis no crio-EM, ainda há espaço para melhorias em vários aspectos do fluxo de trabalho de análise de partículas únicas. A análise de partículas únicas exige um pacote de software adequado para aquisição automática de dados de alto rendimento. Vários pacotes automáticos de software de aquisição de dados foram desenvolvidos para imagens automáticas para crio-EM de uma única partícula nos últimos oito anos. Este artigo apresenta a aplicação de um pipeline de aquisição de imagens totalmente automatizado para biomoléculas vitrificadas em condições de baixa dose.

Ele demonstra um pacote de software, que pode coletar dados crio-EM de forma completa, automática e precisa. Além disso, vários parâmetros microscópicos são facilmente controlados por este pacote de software. Este protocolo demonstra o potencial deste pacote de software em imagens automatizadas da proteína de pico da síndrome respiratória aguda grave-coronavírus 2 (SARS-CoV-2) com um microscópio crio-elétron de 200 keV equipado com um detector de elétrons direto (DED). Cerca de 3.000 imagens de filmes crio-EM foram adquiridas em uma única sessão (48 h) de coleta de dados, produzindo uma estrutura de resolução atômica da proteína de pico do SARS-CoV-2. Além disso, este estudo estrutural indica que a proteína do pico adota duas principais conformações, 1-RBD (domínio de ligação receptora) abertas e todas as conformidades fechadas de RBD.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Crio-EM de partículas únicas tornou-se uma técnica de biologia estrutural convencional para determinação de estrutura de alta resolução de macromoléculas biológicas1. A reconstrução de partículas únicas depende da aquisição de um grande número de micrografos de amostras vitrificadas para extrair imagens de partículas bidimensionais (2D), que são então usadas para reconstruir uma estrutura tridimensional (3D) de uma macromolécula biológica2,3. Antes do desenvolvimento dos DEDs, a resolução obtida a partir da reconstrução de partículas únicas variou entre 4 e 30 Å4,5. Recentemente, a resolução alcançável do crio-EM de partículas únicas ultrapassou 1,8 Å6. O DED e o software automatizado de aquisição de dados têm sido os principais contribuintes para esta revolução de resolução7, onde a intervenção humana para a coleta de dados é mínima. Geralmente, a imagem crio-EM é realizada a baixas taxas de dose de elétrons (20-100 e/Å2) para minimizar os danos causados pela radiação induzida pelo feixe de elétrons de amostras biológicas, o que contribui para a baixa relação sinal-ruído (SNR) na imagem. Este baixo SNR impede a caracterização das estruturas de alta resolução das macromoléculas biológicas utilizando análise de partículas únicas.

Os detectores de elétrons de nova geração são detectores baseados em CMOS (complementar metal-óxido-semicondutor), que podem superar esses obstáculos relacionados ao SNR baixos. Essas câmeras CMOS de detecção direta permitem leitura rápida do sinal, devido à qual a câmera contribui com melhor função de spread de ponto, SNR adequado e excelente eficiência quântica de detetive (DQE) para macromoléculas biológicas. As câmeras de detecção direta oferecem alto SNR8 e baixo ruído nas imagens gravadas, resultando em um aumento quantitativo na eficiência quântica detetive (DQE)-uma medida de quanto ruído um detector adiciona a uma imagem. Essas câmeras também gravam filmes à velocidade de centenas de quadros por segundo, o que permite a aquisição rápida de dados9,10. Todas essas características tornam as câmeras de detecção direta rápida adequadas para aplicações de baixa dose.

As imagens de pilha corrigidas por movimento são usadas para o processamento de dados para calcular a classificação 2D e reconstruir um mapa de densidade 3D de macromoléculas usando vários pacotes de software como RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 e EMAN215. No entanto, para análise de partículas únicas, é necessário um enorme conjunto de dados para alcançar uma estrutura de alta resolução. Portanto, pedágios automáticos de aquisição de dados são altamente essenciais para a coleta de dados. Para registrar grandes conjuntos de dados crio-EM, vários pacotes de software foram usados na última década. Pacotes de software dedicados, como AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS e EPU, foram desenvolvidos para aquisição automatizada de dados.

Esses pacotes de software usam tarefas rotineiras para encontrar posições de furos automaticamente, correlacionando as imagens de baixa ampliação a imagens de alta ampliação, que auxilia na identificação de buracos com gelo vítreo de espessura de gelo apropriado para aquisição de imagens em condições de baixa dose. Esses pacotes de software reduziram o número de tarefas repetitivas e aumentaram o throughput da coleta de dados crio-EM, adquirindo uma vasta quantidade de dados de boa qualidade por vários dias continuamente, sem qualquer interrupção e a presença física do operador. Latitude-S é um pacote de software similar, que é usado para aquisição automática de dados para análise de partículas únicas. No entanto, este pacote de software só é adequado para DEDs K2/K3 e é fornecido com estes detectores.

Este protocolo demonstra o potencial do Latitude-S na aquisição automatizada de imagem da proteína de pico SARS-CoV-2 com um detector de elétrons direto equipado com um crio-EM de 200 keV (ver a Tabela de Materiais). Usando esta ferramenta de coleta de dados, 3.000 arquivos de filme de proteína de pico SARS-CoV-2 são automaticamente adquiridos, e mais processamento de dados é realizado para obter uma estrutura de proteína de pico de resolução 3.9-4.4 Å.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Três passos importantes são necessários para a coleta de dados crio-EM: 1. preparação da grade crio-EM, 2. calibração e alinhamento do microscópio, 3. coleta automática de dados (Figura 1). Além disso, a coleta automatizada de dados é subdividida em uma. seleção de área adequada, b. otimização do Latitude-S, c. iniciar a seleção automática de furos e d. iniciar a aquisição automática de dados (Figura 1).

1. Preparação da grade Cryo-EM e carregamento de amostras para aquisição automática de dados

  1. Limpe as grades usando um descarregador de brilho e varie os parâmetros de descarga de brilho com base em requisitos experimentais (aqui, 60 s a 20 mA).
  2. Adicione uma amostra de proteína recém-preparada (3 μL) à grade descarregada por brilho e incubar por 10 s.
  3. Borrique as grades para 3-5 s a 100% de umidade e rapidamente mergulhe-as em etano líquido usando um crio-êmbolo.
  4. Fixar as grades manualmente em um anel de corte para formar o cartucho usando um anel flexível de clipe C.
  5. Carregue as grades congeladas montadas no do carregador automático e transfira o pela tampa nano para o carregador automático pré-cozido do microscópio para coleta de dados.

2. Ajuste de microscópio e alinhamento básico antes da aquisição automática de dados

  1. Mudança de viga
    1. Clique em Deslocar feixe da guia Alinhamento Direto .
    2. Reduza a ampliação e centrale o feixe para o eixo óptico usando o botão Multifuncional X e Y .
  2. Alinhamento de ponto pivô
    1. Clique na opção inclinação do feixe em Alinhamento Direto pp X da guia Alinhamento Direto .
    2. Condensar o feixe a um ponto e minimizar o movimento usando o botão Multifuncional X e Y .
  3. Centro de abertura C2
    1. Selecione a abertura do condensador na guia Alinhamento .
    2. Condensar o feixe a um ponto, centralizar o feixe para o eixo óptico e, em seguida, expandir o feixe para cobrir o círculo uniformemente.
    3. Repita estas etapas até que a abertura do Condensador 2 seja ajustada.
  4. Alinhamento sem coma
    1. Clique em Alinhamento X livre de coma da guia Alinhamento Direto para alinhar o feixe ao eixo óptico.
    2. Use o botão Multifuncional para minimizar a forma e o movimento do FFT (certifique-se de que está estável).
    3. Repita o mesmo procedimento para coma - alinhamento livre Y.
  5. Defina a iluminação paralela antes da coleta de dados no crio-EM por causa da lente c gêmea.
    1. Insira a abertura objetiva (70 μm) no modo de difração.
    2. Concentre a abertura objetiva no plano focal dianteiro da lente de difração controlando o botão de intensidade de desfocus (lente objetiva e corrente de lente C2).
    3. Certifique-se de que a borda nítida da abertura objetiva seja vista após o desfoque adequado.
    4. Insira a rolha do feixe e espalhe a intensidade até que os anéis de difração em pó de ouro sejam minimizados.
      NOTA: Se o feixe estiver bem espalhado, um anel claro de difração do pó de ouro será visível na tela, o que indica que o feixe é paralelo.
    5. Retraia a rolha do feixe após definir a iluminação paralela e altere o modo microscópio para a sonda Nano.
      NOTA: Verifique o ajuste do microscópio antes de iniciar a coleta de dados para garantir o melhor desempenho do microscópio. Todas essas configurações seriam realizadas na guia GUI de alinhamento direto do microscópio. Toda a sintonia do microscópio é realizada usando uma grade de teste antes da coleta de dados.

3. Aquisição de dados com Latitude-S

  1. Inicie o software automatizado de aquisição de dados Latitude-S.
    NOTA: A instalação do Latitude-S também requer calibração do microscópio, que será realizada antes da coleta de dados, e as configurações serão armazenadas permanentemente. Cinco estados diferentes para coleta de dados são calibrados com quatro ampliações diferentes (Figura 1 e Figura 2). O estado do Atlas e o estado da rede estão em duas ampliações diferentes no modo LM (faixas de baixa ampliação). O estado do orifício está no modo SA (faixas de alta ampliação), mas com uma ampliação moderada. O foco e o estado de dados usam o modo SA de alta ampliação.
    1. Clique no DigitalMicrograph no menu Iniciar ou clique duas vezes no ícone DigitalMicrograph na área de trabalho.
    2. Selecione o ícone de gerenciador de técnicas do DigitalMicrograph.
      NOTA: Este sistema mostrará os ícones TEM e Latitude-S (Figura 2 e Figura Suplementar S1).
    3. Selecione o ícone Latitude-S para coleta de dados automatizados de partículas únicas.
      NOTA: A câmera K2 opera em três modos: linear/integrado, contado e super-resolução. O usuário pode selecionar qualquer modo na interface do DigitalMicrograph. As imagens de dados podem ser salvas como pilhas de imagens fracionadas por dose ou como imagens resumidas em arquivos MRC, TIF ou .dm4 com diferentes profundidades de bits. Além disso, os dados podem ser salvos como imagens corrigidas por movimento para a câmera K3. Em uma câmera K2, uma pilha de imagens não processadas poderia ser salva como mrc de 4 bits, TIF de 8 bits ou arquivos .dm4 de 8 bits.
  2. Crie uma nova sessão com base nas configurações de uma sessão anterior.
    1. Verifique a caixa de seleção de sessão anterior na paleta.
    2. Selecione o botão Novo .
    3. Escolha a pasta que contém a sessão em que as configurações da nova sessão estão baseadas. Vá ao diretório da sessão anterior para criar a nova sessão. Escolha a pasta para salvar a nova sessão e os dados associados.
    4. Selecione e escolha a pasta onde a nova sessão e os dados associados serão salvos.
      NOTA: Cada estado e suas configurações subjacentes (ampliação, condições de iluminação, imagem ou projetor) e parâmetros de mudança de feixe e câmera (exposição total, exposição de quadro único e binning) serão exportados da sessão existente para a nova sessão. O caminho da pasta é mostrado como uma sequência de texto na parte inferior da paleta. Cada um dos estados e paletas de configuração tem um asterisco (*) anexado ao título para mostrar que ele já foi configurado e está pronto para usar.
  3. Continue uma sessão existente.
    1. Pressione o botão Continuar na paleta para continuar uma sessão existente.
      NOTA: A montagem do atlas não pode ser modificada.
    2. Escolha e navegue até a pasta que contém a sessão que precisa ser continuada.
  4. Comece uma sessão totalmente nova.
    1. Clique em Nova guia na paleta. Escolha a pasta que contém a sessão a ser continuada. Selecione uma pasta para salvar os dados.
      NOTA: O nome da pasta padrão é construído usando a data e a hora.
    2. Clique no ícone Configuração . Na caixa de exploração do estado Gerenciar que aparece, adicionar estado, definir a condição TEM, a condição da câmera e imagem/pilha e, em seguida, nomear o estado.
      NOTA: O fluxo de trabalho automatizado de aquisição de dados utiliza 5 estados diferentes para coleta automatizada de dados. Esses estados são configurados e armazenados em suas respectivas paletas de estado. O resumo do estado é dado na Tabela 1.
  5. Configure o estado atlas.
    1. Clique na paleta de estado atlas.
    2. Configure o estado atlas com os seguintes parâmetros: ampliação 115x modo LM em nano sonda, condições de iluminação tamanho 8 e brilho 934400, binning: 1 e tempo de exposição da câmera: 1.0 s para imagem em baixa ampliação. Consulte o resumo do estado dado na Tabela 1.
    3. Clique em Next para passar para o próximo estado.
      NOTA: O estado da Atlas é o estado de ampliação mais baixo, o que fornece o levantamento de toda a rede (Figura Suplementar S2). Geralmente, este estado nos ajuda a visualizar as grades inteiras em baixa ampliação e julgar a espessura do gelo, o achatamento e o quadrado quebrado das grades. Recomenda-se gerar o atlas em diferentes áreas da rede para observar a espessura ideal do gelo e a espessura do gelo subótimo das grades (Figura Suplementar S3). Os parâmetros mencionados podem ser variados de acordo com as necessidades do usuário.
  6. Configure o estado da rede.
    1. Clique na paleta de estado Grade.
    2. Configure o estado da grade com as seguintes ópticas de imagem do microscópio (modo de ampliação 380x LM na sonda Nano), condições de iluminação (tamanho do ponto: 8 e brilho 626.200), binning: 1 e tempo de exposição da câmera: 1,0 s.
    3. Consulte o resumo do estado latitude-S fornecido na Tabela 1.
    4. Clique em Next para passar para o próximo estado.
      NOTA: O estado da rede é definido em uma ampliação superior ao atlas afirma que o campo de visão é um quadrado de grade (Figura 2). Nesta ampliação particular, observa-se uma grade quadrada. Portanto, os orifícios são observados corretamente nesta ampliação, o que ajuda a verificar a espessura do gelo dos orifícios (Figura Suplementar S4). Um simples filtro de bandpass é usado no estado de grade para localizar os furos na grade de patentes. Os parâmetros mencionados podem ser variados de acordo com as necessidades do usuário.
  7. Configure o estado do buraco.
    1. Clique na paleta de furos.
    2. Configure o estado do orifício com as seguintes configurações do microscópio: óptica de imagem (ampliação 4500x modo SM na sonda Nano), condições de iluminação (tamanho do ponto: 7 e diâmetro do feixe 8,81 μm), binning: 1 e tempo de exposição da câmera: 1,0 s.
    3. Altere os parâmetros se necessário com base no tipo de grade. Consulte o resumo do estado fornecido na Tabela 1.
    4. Clique em Next para passar para o próximo estado.
      NOTA: O modo SA indica uma faixa de alta ampliação no microscópio eletrônico. O estado do orifício está na faixa de ampliação SA com um campo de visão de alguns micrômetros (10-20 μm) (Figura 2 e Figura Suplementar S4). Esta faixa de ampliação é maior do que o estado atlas ou grid, mas muito menor do que o estado Focus/Data. Nesta ampliação, os buracos individuais serão visíveis. O tamanho do buraco é apropriado para observar altos graus de contaminações, buracos vazios e a espessura adequada do gelo dos buracos. Os furos para imagem são selecionados com base nessas suposições. Dois filtros são usados no estado do orifício: um para correlacionar uma imagem de referência de orifício com uma nova imagem de orifício e outro para ajustar a altura do palco à altura eucêntrica.
  8. Configure o estado de foco.
    1. Clique na paleta Focus.
    2. Configure o estado de foco com as seguintes configurações do microscópio: óptica de imagem (ampliação 45.000x modo SA em nanodusa), condições de iluminação (tamanho do ponto: 8 e brilho 934400), binning: 1 e tempo de exposição da câmera: 1,0 s.
    3. Concentre-se na área de carbono amorfa perto do buraco. Consulte o resumo do estado latitude-S fornecido na Tabela 1.
    4. Clique em Next para passar para o próximo estado.
      NOTA: O modo SA indica uma faixa de alta ampliação no microscópio eletrônico. O estado Focus é a ampliação da faixa de SA mais alta. No modo de foco, o feixe é deslocado para uma área de carbono próxima do orifício alvo e executa o foco automaticamente para coletar os dados no estado de dados. Um filtro de bandpass combinado com um filtro retangular macio ou hanning é usado no estado de foco para medir o deslocamento entre duas imagens de estado de foco da mesma área (Figura 2). Os parâmetros mencionados podem ser variados de acordo com as necessidades do usuário.
  9. Configure o estado de dados.
    1. Clique na paleta Data.
    2. Configure o estado de dados com as seguintes configurações de microscópio: óptica de imagem (por exemplo, ampliação 28.000x, 45.000x, 54.000x no modo SA em nano sonda), condições de iluminação (tamanho do ponto: 8 e brilho 934400), binning: 1 e tempo de exposição da câmera: 1.0 s.
    3. Consulte o resumo do estado latitude-S dado na Tabela 1.
    4. Clique em Next para passar para o próximo estado.
      NOTA: O estado de dados é a maior ampliação selecionada com base nos requisitos de tamanho do pixel e resolução de destino (Figura 2). Geralmente, após o foco, o feixe é automaticamente deslocado para a área alvo para coletar os dados. Os parâmetros acima mencionados podem ser alterados com base nos requisitos do usuário.

4. Configuração de foco

  1. Clique na paleta de configuração Focus. Especifique a faixa de valores de desfoco e o tamanho da etapa na guia dada.
  2. Pressione o próximo botão para passar para o próximo passo.
    NOTA: Valores de desfoco mais baixos podem ser usados para aquisição de dados de alta resolução. Geralmente, valores de desfoco de -0,5 a -3,0 μm com tamanhos de passo de 0,25 ou 0,5 desfoque são usados para aquisição de imagens. Os usuários podem pular a etapa de configuração do foco se quiserem apenas exibir a amostra. Basta pressionar o botão Next na paleta para pular a etapa de configuração de foco.

5. Alinhamento fino

  1. Foco em algumas características na rede (por exemplo, contaminação por gelo no gelo); ver Figura 3.
    NOTA: Os recursos não devem ser muito grandes ou muito pequenos. Eles devem ser visíveis tanto na ampliação do estado atlas 115x (modo LA) quanto na ampliação de dados.
  2. Clique no botão Capturar . Posicione a marca da cruz vermelha na mesma característica em cada imagem de estados diferentes.
  3. Comece com foco, dados e estados de buracos porque seu campo de visão é muito maior do que os estados atlas e grade. Zoom nos estados atlas e grade para posicionar a marca da cruz vermelha no mesmo recurso nos estados atlas e grade.
  4. Clique no botão Calcular para calcular as posições de cinco estados diferentes, que calcularão as compensações entre cada um dos estados e as refletirão para a janela de saída.
    NOTA: Os valores de deslocamento são integrados aos estados para uso posterior (Figura 3). O alinhamento fino é realizado para proporcionar alta precisão da posição de cada estado (Figura 3). Este alinhamento fino ajuda a identificar a posição exata em todos os cinco estados. O Fine Alignment é fundamental para a aquisição de dados de partículas únicas. Portanto, é altamente recomendável realizar o Alinhamento Fino antes da imagem.

6. Procedimento de aquisição de dados utilizando Latitude-S

  1. Clique na paleta Capturar.
    NOTA: Geralmente, os dados do atlas são coletados em baixa ampliação (115x) para visualizar a maioria dos quadrados da grade.
  2. Escolha o tamanho do atlas para cobrir toda a grade ou parte da grade com base no requisito (por exemplo, 6 x 6, 8 x 8, 12 x 12, 6 x 8, 8 x 6, 12 x 8, ou 8 x 12).
    NOTA: o tamanho do atlas de 16 por 16 cobre toda a grade.
  3. Clique no botão Capturar para capturar o atlas.
    NOTA: A principal janela de navegação Latitude-S abre e preenche o espaço disponível no DigitalMicrograph (Figura Suplementar S5). Três painéis de imagem na janela de navegação principal mostram imagens dos estados do sistema em três ampliações diferentes. O atlas global é atualmente exibido em seu estado atual de aquisição no painel mais à esquerda. As telhas no atlas se encherão à medida que cada captura ocorrer.
  4. Selecione o quadrado da grade com base na espessura do gelo navegando no atlas (Figura Suplementar S5). Uma vez selecionados os quadrados de grade desejados, clique no botão Agendar e observe os azulejos no quadrado da grade enquanto cada quadrado de grade é capturado.
  5. Clique no botão Agendar uma vez que os quadrados da grade sejam selecionados.
  6. Selecione um orifício representativo no quadrado da grade adicionando sua posição. Uma vez que uma imagem de furo é adquirida, defina os dados e as posições de foco e salve o layout como um modelo (Figura Suplementar S6).
  7. Clique em Auto find, dê o tamanho do furo (por exemplo, R1.2/1.3) e clique no botão Encontrar no programa, o que fará com que o programa Find encontre automaticamente os furos com base no diâmetro do orifício. Em seguida, clique no botão Marcar para adicionar o modelo (Figura 4) e adicione marcas de círculo vermelho em todos os orifícios em uma grade ou quadrado parcial da grade.
  8. Configure a intensidade para remover os orifícios do quadrado da rede e contaminação do gelo (Figura 4).
    NOTA: Finalmente, os orifícios selecionados serão marcados em amarelo para agendamento da coleta de dados.
  9. Clique no botão Agendar tarefas do Latitude depois de adicionar os furos através do Auto find.
    NOTA: Antes de agendar a coleta automatizada de dados, certifique-se de que o nível do tanque de nitrogênio líquido seja suficiente, a bomba turbo do carregador automático está desligada e o espaço de acionamento RAID é livre. O gerente de tarefas latitude-S mostra o número de estados de atlas, grid square, hole e data programados para coleta de dados (Figura 5). Na GUI Latitude-S, vários esquemas de cores serão visíveis, e o significado dos diferentes esquemas de cores será exibido: 1. Amarelo indica não programado; 2. O verde indica programado; 3. Azul indica Adquirido; 4. Vermelho indica falha.

7. Processamento de dados Cryo-EM

NOTA: O processamento de imagem crio-EM da proteína de pico é descrito em detalhes na literatura recente25.

  1. Realize o processamento de imagem da proteína de pico de SARS-CoV2 usando RELION 3.011.
  2. Tela as imagens do filme coletadas usando latitude-S manualmente e executa correção de movimento induzida por feixe dos filmes individuais usando software MotionCor29. Realize a triagem inicial dos micrografos corrigidos por movimento manualmente com a ajuda do pacote de software cisTEM14.
    NOTA: Quase 85% dos micrografos adquiridos automaticamente eram de boa qualidade, e os dados tinham sinal dentro de 3,7-5,2 Å, que é calculado utilizando o software cisTEM14 (Figura Suplementar S7A,B).
  3. Processe os dados usando o pacote de software RELION 3.011.
    1. Escolha partículas de espigão manualmente e submá-las à classificação de classe 2D (Figura Suplementar S7C). Use a melhor classe 2D como referência ao autopick 3.99.842 partículas de pico único dos micrografos usando a ferramenta de autopick RELION11.
      NOTA: Foram realizadas três rodadas de classificação 2D antes de submeter as partículas à classificação 3D (Figura Suplementar S8). Aproximadamente 2.55.982 partículas individuais foram selecionadas para classificação 3D, e o conjunto de dados foi classificado em seis classes. O último refinamento automático 3D foi realizado com a melhor classe; Foram obtidas 85.227 partículas de espigão da classificação 3D.
    2. Após o refinamento automático, realize o refinamento de partícula per partícula com parâmetros adequados de inclinação do feixe para melhoria de resolução. Em seguida, submeta as partículas ao polimento bayesiano usando o pacote de software RELION 3.011. Por fim, use o conjunto de partículas polidas para outra rodada de refinamento automático 3D usando RELION 3.011.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na atual situação pandêmica, o crio-EM desempenha um papel fundamental na caracterização das estruturas de várias proteínas do SARS-CoV-226,27,28,29, que podem ajudar a desenvolver vacinas e medicamentos contra o vírus. Há uma necessidade urgente de esforços de pesquisa acelerados com recursos humanos limitados para combater a doença coronavírus de 2019. A aquisição de dados em crio-EM de partí...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Latitude-S é uma interface de usuário intuitiva, que fornece um ambiente para configurar e coletar automaticamente milhares de micrografias de alta resolução ou arquivos de filme em dois dias. Fornece fácil navegação através das grades e mantém a posição do estágio do microscópio enquanto se move de baixa ampliação para alta ampliação. Cada etapa de aquisição de dados com o Latitude-S é eficiente em termos de tempo, com recursos como uma interface de usuário simples, streaming rápido de dados a até 4,5 GB/s de velocidade...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse concorrentes ou financeiros para declarar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reconhecemos o Departamento de Biotecnologia, Departamento de Ciência e Tecnologia (DST) e Ciência, e o Ministério do Desenvolvimento de Recursos Humanos (MHRD), Índia, para financiamento e a instalação crio-EM no IISc-Bangalore. Reconhecemos o Programa DBT-BUILDER (BT/INF/22/SP22844/2017) e o DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) para a instalação Nacional Cryo-EM no IISc, Bangalore. Reconhecemos o apoio financeiro do Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia (SERB) (Grant No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 e SERB-IPA/2020/000094), DBT (Grant No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Agradecemos à Sra. Ishika Pramanick por preparar grades crio-EM, coleta de dados crio-EM e preparar a Tabela de Materiais. Agradecemos também ao Sr. Suman Mishra pelo processamento de imagens crio-EM e por nos ajudar a preparar os números. Agradecemos ao Prof. Raghavan Varadarajan por nos ajudar a obter a amostra purificada de proteína de pico para este estudo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Papel mata-borrãoTed Pella, INC.47000-100 Item depreparação de amostras EM
CápsulaThermo Fisher Scientific9432 909 97591Unidade de preparação de amostras EM
ThermoFisher Scientific1020863Unidade de preparação de amostras EM
C-ClipThermo Fisher Scientific1036171Item de preparação de amostras EM
Ferramenta de inserção C-ClipThermo Fisher Scientific9432 909 97571Ferramenta de preparação de amostras EM
C-Clip RingThermo Fisher Scientific1036173Item de preparação de amostras
EM Grade EM (Quantifoil)Microscopia eletrônicaSciences Q3100AR1.3R 1.2/1.3 300 Mesh,
Gold Glow discharge MachineQuorumN/AQuorum GlowQube máquina de descarga de brilho
K2 DEDGatan Inc.N/ADispositivo de coleta de dados Cryo-EM (Câmera)
Latitude S SoftwareGatan Inc.Software de imagem
Estação de carregamentoThermo Fisher Scientific1130698Unidade de preparação de amostras EM
Talos 200 kV ArcticaThermo Scientific™N/AMicroscópio Crio-Eletrônico
Vitrobot Mark IVThermo FisherScientific N/AUnidade de preparação de amostras EM

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
  2. Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
  3. Stagg, S. M., et al. Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL. Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).
  4. Frank, J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years. Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).
  5. Biyani, N., et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
  6. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  7. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  8. McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy. Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).
  9. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  10. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980(2015).
  11. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  12. Grigorieff, N. FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
  13. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  14. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383(2018).
  15. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  16. Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).
  17. Lei, J., Frank, J. Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope. Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).
  18. Potter, C. S., et al. Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
  19. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  20. Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  21. Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications. Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).
  22. Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras. Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).
  23. Marsh, M. P., et al. Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography. Journal of Microscopy. 228, Pt 3 384-389 (2007).
  24. Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).
  25. Pramanick, I., et al. Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein. Structure. , (2021).
  26. Zhou, D., et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient. Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).
  27. Hillen, H. S., et al. Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase. Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).
  28. Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
  29. Thoms, M., et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).
  30. Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules. Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Particle Cryo EMAutomated Data AcquisitionCryo EM SoftwareHigh Throughput ImagingSpike Protein StructureElectron MicroscopyData Collection AutomationDirect Electron DetectorStructural Characterization3D Classification

Related Articles