Artigo de método

Microscopia de Reconstrução Óptica Estocástica Direta de Vesículos Extracelulares em Três Dimensões

DOI:

10.3791/62845

⸱

26 de agosto de 2021

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, The University of North Carolina at Chapel Hill School of Medicine

Neste artigo

Resumo

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A microscopia de reconstrução óptica estocástica direta (dSTORM) é usada para contornar o limite típico de difração de microscopia leve e para visualizar exosóis na escala de nanômetros. Pode ser empregado em duas e três dimensões para caracterizar exossomos.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vesículos extracelulares (EVs) são liberados por todos os tipos de células e desempenham um papel importante na sinalização celular e homeostase. A visualização de EVs muitas vezes requer métodos indiretos devido ao seu pequeno diâmetro (40-250 nm), que está abaixo do limite de difração da microscopia de luz típica. Desenvolvemos uma visualização de EVs baseada em microscopia de super resolução para contornar o limite de difração em duas e três dimensões. Usando esta abordagem, podemos resolver a forma tridimensional dos EVs para dentro de resolução de +/- 20 nm no eixo XY e resolução de +/- 50 nm ao longo do eixo Z. Em conclusão, propomos que a microscopia de super resolução seja considerada como um método de caracterização de EVs, incluindo exosósmos, bem como vírus envoltos.

Introdução

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Vesículas extracelulares (EVs) são vesículas ligadas à membrana liberadas por todos os tipos de células. Eles contêm lipídios, proteínas, metabólitos e ácidos nucleicos e transferem esses materiais localmente entre as células e distally entre tecidos e órgãos. Existem três subtipos primários de EVs: corpos apoptóticos, microvesículos e exosóis1,2. Aqui, focamos nossa discussão sobre exossomos e suas proteínas associadas.

Exosóis são vesículas secretadas originárias do brotamento interno de endosários primitivos no corpo multivesicular (MVB). O MVB então se funde com a membrana plasmática, liberando os exossomos no espaço extracelular para viajar para outras células3,4. Os exosóis existem em um espectro de tamanhos que variam de 40 a 150 nm e são enriquecidos com proteínas transmembranas endossomais conhecidas como tetraspaninas (CD9, CD63, CD81), complexo de triagem endosômico ligado à membrana necessário para o transporte (ESCRT), e proteínas lipídicas associadas à balsa1,2,5,6,7.

Caracterizar a composição bioquímica dos exossomos tornou-se um campo popular para os pesquisadores entenderem melhor sua natureza funcional. Existem muitos métodos para visualizar e caracterizar exossomos, incluindo citometria de fluxo nanoescala, análise de rastreamento de nanopartículas (NTA), microscopia eletrônica de varredura e transmissão (TEM), ressonância de plasmon superficial, sensoriamento de pulso resistivo e microscopia de luz tradicional, cada uma das quais contém prós intrínsecos e contras8,9. TEM e crio-EM podem alcançar resolução baseada em nanômetros, mas muitas vezes requerem etapas de desidratação e fratura congelante, diminuindo ou reduzindo os EVs10,11. O NTA conta com a dispersão de luz, permitindo a caracterização de centenas de EVs de cada vez, mas é uma medição indireta do tamanho das partículas e não pode distinguir facilmente entre EVs, vírus e agregados proteicos12,13,14,15,16. A citometria de fluxo nanoescala emprega a dispersão de luz a partir de um caminho de excitação, que pode então ser traduzido em medidas de tamanho, mas é uma tecnologia emergente, e há pouco consenso sobre o tamanho das partículas dentro da faixa linear de detecção para vários instrumentos12,17,18.

A microscopia leve tradicional usando proteínas fluorescentes ou corantes tem sido uma das técnicas mais utilizadas para visualizar compartimentos subcelulares, complexos proteicos e máquinas de sinalização dentro de uma célula. Embora essa técnica se mostre útil na visualização da localização de complexos, o limite de difração da microscopia de luz tradicional (em torno de 250-400 nm) impede a clara resolução de proteínas ou estruturas na faixa de tamanho típico de um exososomo (40-150 nm)12,19,20.

A microscopia de reconstrução óptica estocástica direta (dSTORM), distingue-se da microscopia de luz convencional, empregando as propriedades fotosssuráveis de fluoroforos específicos e detectando esses eventos piscando para reconstruir imagens até a precisão de nanômetros21. Eventos de captura de fotos são coletados usando uma câmera de detecção de alta moldura ao longo de dezenas de milhares de exposições individuais, e uma função de propagação de pontos é usada para mapear com alta confiança a localização exata do fluoróforo de fotossar19,20,22. Isso permite que o dSTORM contorne o limite de difração da microscopia leve. Vários grupos relataram o uso de técnicas de super-resolução para visualização e rastreamento de exossomos e suas proteínas associadas22,23,24,25. A resolução final depende das propriedades biofísicas do fluoróforo, mas muitas vezes varia de +/-10-100 nm ao longo do eixo XY, permitindo a resolução de molécula única.

A capacidade de resolver fluoroforos individuais nesta escala no eixo XY revolucionou a microscopia. No entanto, há poucos dados sobre o dSTORM tridimensional (3-D) de um exossomo. Por isso, buscamos estabelecer um procedimento operacional padrão (SOP) para visualização e caracterização baseada em dSTORM de EVs purificados, incluindo exosóis à precisão de nanômetros em 3D.

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Protocolo

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1 Propagação e manutenção de linhas celulares

  1. Adquira células de osteossarcoma humanas (U2OS) e coloque as células no meio de crescimento suplementadas com soro bovino fetal livre de 10% e 1x solução de penicilina/estreptomicina.
    NOTA: O Soro Bovino Fetal livre de exosome foi gerado seguindo o protocolo apresentado em McNamara et. al.26.
  2. Mantenha as células U2OS em uma incubadora revestida de cobre a 37 °C em 5% de CO2 e células de passagem em frascos T17526,27. As células devem ser mantidas em fase de crescimento logarítmico médio para evitar que subpopulações surjam, ou do acúmulo de detritos apoptóticos durante a fase estacionária.

2 Isolamento e purificação exososome

  1. Cresça as linhas celulares U2OS para total confluência em 10 frascos T175 separados com 50 mL de mídia por frasco. Remova a célula sobrenante e, sucessivamente, passe-a através de um aparelho de filtragem de vácuo de 0,45 μm e 0,22 μm.
  2. Sujeito o supernatante à filtragem de fluxo cruzado (também conhecido como filtragem de fluxo tangencial) em um sistema de filtragem equipado com o cartucho de fibra oca de 750 kDa, a fim de remover proteínas menores ou metabólitos28.
    1. Passe o sobrenante através do operador de filtragem de fluxo tangencial a uma pressão constante para a frente de 30 psi, mantendo uma pressão de retenção de <20 psi para produzir uma pressão Δ de 10 ou mais psi. Coloque uma barra de agitação magnética no tanque de retentate e coloque para 150 rpm26.
    2. Mantenha a taxa de alimentação em 40 mL/min ou superior. Recolher o permeado em um reservatório e descartá-lo.
  3. Concentre o supernatante a 30 mL e, em seguida, equilibre-se com quatro volumes de 1x PBS. Colete a solução filtrada e equilibrada de fluxo cruzado em um tubo cônico de 50 mL.
  4. Precipitar os EVs a 4 °C durante a noite em uma concentração final de 40 mg/mL de polietileno glicol com um peso molecular de 8.000 Da. Centrifugar os EVs a 1.200 x g a 4 °C por 1 h e resuspend em 500 μL de 1x PBS.
  5. Incubar os EVs com 50 μg/mL de corante intercalante de membrana vermelha fotocretável e 50 μg/mL de RNase A em 1x PBS a 4 °C por 1 h.
  6. Remova o excesso de corante através de uma coluna em um sistema de purificação de proteínas ligado a um coletor de frações. Identifique frações de EV através da absorvância UV e insirá-las em um tubo de microcentrifuuagem26.
  7. Selecione um total de 200 μL de EVs usando contas magnéticas anti-CD81 equilibradas em 1x PBS.
    1. Diluir 100 μL das contas magnéticas anti-CD81 em 1x PBS a um volume total de 1 mL e permitir que elas se liguem a 4 °C por 2 h em um tubo de microcentrífuga de 2 mL com balanço contínuo.
  8. Lave as contas anti-CD81 e EV três vezes com 1x PBS. Elute CD81+ EV da solução com 100 mM Glycine no pH 2.0 por 30 min a 37 °C.
  9. Pipeta o CD81+ EV purificado em um volume igual de 100 mM Tris-HCl em pH 7.5 em 1x PBS.
    NOTA: Uma alíquota da solução EV CD81+ purificada pode ser reservada para análise de rastreamento de nanopartículas ou microscopia eletrônica, a fim de confirmar a pureza da solução e presença de EVs26.

3 Fixação e preparação

  1. Coloque EVs purificados de afinidade em placas de 8 poços de deslizamento de μ de vidro em um volume total de 200 μL (pode diluir a amostra de EV em 100 mM Tris-HCl em pH 7.5 em 1x PBS) e permitir aderir à superfície durante a noite a 4 °C.
  2. Sem remover a solução existente da placa de 8 poços, fixe os EVs nas placas adicionando 200 μL de 4% de paraformaldeído em 1x PBS à solução contendo EV em cada poço e deixe incubar por 30 min a temperatura ambiente21.
  3. Remova cuidadosamente a solução paraformaldeída e o excesso com uma micropipette para não perturbar os EVs. Lave o EV com 1x PBS para remover o excesso de paraformaldeído. Realize o procedimento de lavagem três vezes. Remova o excesso de 1x PBS.
  4. Prepare 250 μL de solução tampão dSTORM B por amostra, criando uma solução de 5 mM protocatechuato dioxygenase (Parte A) diluída em tampão de imagem (Parte B) por protocolo do fabricante.
    NOTA: A concentração da enzima no buffer pode ser dobrada para 10 mM se ocorrer fotobleaching.
    1. Adicione 250 μL do buffer preparado a cada poço por protocolo do fabricante por 20 minutos à temperatura ambiente antes da imagem para catarver moléculas oxidantes.
      NOTA: O EV pode então ser visto imediatamente ou armazenado a 4 °C por até uma semana. Substitua o buffer após o armazenamento antes de cada visualização.

4 Calibração direta da microscopia de reconstrução óptica estocástica

  1. Prepare as contas necessárias para a calibração do microscópio de super resolução diluindo microesferas de 100 nm para uma concentração de 0,5% na água de grau de biologia molecular e tubulação de 200 μL em cada poço de uma placa de fundo de vidro μ-slide 8-well.
    1. Deixe as contas se instalarem nos poços por 1h a temperatura ambiente.
  2. Sem remover a solução existente, adicione 200 μL de 4% de paraformaldeído em PBS a cada poço à solução de contas de calibração e deixe incubar por 30 minutos à temperatura ambiente.
  3. Remova cuidadosamente o paraformaldeído com uma micropipette para não perturbar as contas e lave as contas três vezes com 1x PBS. Prepare o buffer de acordo com a etapa 3.4.
  4. Remova 1x PBS e adicione 250 μL do buffer preparado a cada poço. Deixe o buffer descansar por 20 minutos antes da visualização.
  5. Antes de colocar qualquer coisa no palco, conecte-se ao microscópio 3D usando o botão Conectar o microscópio. Adicione óleo 100x ao objetivo e coloque o centro do poço em cima do objetivo. Na configuração Acquire, ligue os lasers de excitação de 473 e 640 nm e clique em Exibir.
    1. Sem a lente 3D ativada, visualize as contas sob a configuração de saturação de fótons clicando em Contagem de Fótons nas opções de exibição de imagem. Defina os poderes de laser iniciais para 8,4 mW para o laser de 473 nm e para 11,6 mW para o laser de 640 nm.
    2. Diminua o foco do laser para cerca de -300 nm ou o plano focal das contas de calibração para produzir uma resolução clara das contas individuais. Uma vez que o plano Z esteja focado, ajuste ainda mais os níveis de potência do laser para explicar a variação em cada campo de visão.
  6. Sob as funções do instrumento, complete a calibração do mapeamento 3D e a calibração do mapeamento do canal para obter os erros no eixo X-, Y e Z. Defina o número máximo de FOVs para 20, o número de pontos alvo para 4.000, a distância máxima entre os canais para 5,0 pixels e o raio de exclusão entre os canais para 10,0 pixels durante a calibração do mapeamento do canal.
  7. Certifique-se de que a calibração produz uma cobertura pontual de >90% e qualidade de mapeamento que seja boa. Salve os dados de calibração dado para futuras aquisições de imagens.

5 Visualização de EV em três dimensões

  1. Adicione óleo 100x no objetivo e coloque os EVs preparados no microscópio. Sem a lente 3D ativada, ligue o laser de excitação de 640 nm e inicialmente eleve-o para entre 1,2 mW e 12,5 mW, dependendo da intensidade do sinal e do campo de visão para excitar a membrana vermelha intercalando EVs manchados de corante.
    1. Nas opções de exibição de imagem, mude o método de visualização da saturação de fótons para percentis para melhor visualizar os EVs. Ajuste a potência do laser para minimizar o ruído, ao mesmo tempo em que maximiza o sinal. Mantenha todos os outros parâmetros.
    2. Ajuste o foco do plano Z clicando no ícone para cima ou para baixo no eixo Z.
      NOTA: O plano Z deve ser focado entre -200 e -350 nm, mas vai variar dependendo do campo de visão.
  2. Ajuste o tempo de exposição para 20 ms, a captura do quadro para 10.000 quadros, e a potência inicial do laser entre 1,2 mW e 12,5 mW, ou a potência laser determinada na etapa 5.1, dependendo da intensidade do sinal e do campo de visão.
    1. Ative a lente 3D usando o ícone e inicie a aquisição clicando no botão Adquirir.
  3. Ao longo da aquisição de imagens, eleve a potência laser em 3 incrementos de 10 a cada 1000 quadros, ou o suficiente para manter uma alta relação sinal-ruído. Não ajuste o plano Z durante a aquisição.
    NOTA: O laser pode ser elevado a um máximo de 90 mW de potência laser.

6 Modificação pós-aquisição e rastreamento de EV

  1. Após a aquisição da imagem, alterne para a janela de visualização Analisar. Execute a correção de deriva na imagem não filtrada e, em seguida, ative filtros. Ajuste a contagem de fótons, precisão de localização, sigmas e índice de quadros de acordo com a Tabela 1.
  2. Sobrepor uma ferramenta de visão de plano XYZ ao longo do eixo X de EVs individuais do campo de visão e exportação . Arquivos CSV de eventos de fototaria.
  3. Bisecte EVs individuais no eixo XY em um campo de visão X by Y usando uma ferramenta de histograma de linha, que bins eventos de fotossar em grupos de distância definidos.
  4. Pegue imagens de EVs únicos e salve-as como .tiff arquivos.
  5. Crie vídeos 3D de EVs individuais usando uma ferramenta de visualização 3D e cor de acordo com a colocação ao longo do eixo Z.

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Resultados

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O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia da microscopia de super resolução na visualização de EVs individuais com resolução de nanômetros em três dimensões (3D). Para analisar a forma e o tamanho dos EVs individuais, utilizamos corante fotocrável e incubamos os EVs com um corante de intercalação de membrana e removeram o excesso de corante através da cromatografia29. Os EVs anti-CD81 capturados por afinidade e vermelho foram então vistos no microscópio de super resolução sob o laser de excit...

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Discussão

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Os EVs tornaram-se uma área de estudo popular devido ao seu importante papel em muitos processos intracelulares e sinalização celular-celular1,30. No entanto, sua visualização se mostra difícil, pois seu pequeno tamanho fica abaixo do limite de difração da microscopia leve. A microscopia de reconstrução óptica estocástica direta (dSTORM) é um método direto de visualização que contorna o limite de difração capturando eventos de fotofraco de fluoroforos individuais...

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Divulgações

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M.G.C. não tem conflitos de interesse para declarar. R.P.M e D.P.D. recebem suporte material da Oxford Nanoimaging (ONI) Inc. e Cytiva Inc. (anteriormente GE Healthcare). R.P.M. e D.P.D. declaram interesses concorrentes para a possível comercialização de algumas das informações apresentadas. Estes são gerenciados pela Universidade da Carolina do Norte. As fontes de financiamento não estavam envolvidas nas interpretações ou na escrita deste manuscrito.

Agradecimentos

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Gostaríamos de agradecer a Oxford Nanoimaging por seu feedback e orientação construtivas. Este trabalho foi financiado pelo 5UM1CA121947-10 para R.P.M. e o 1R01DA040394 para D.P.D.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
15 µ-Lâminas 8 placas de poçosIbidi80827
1X PBSGibco14190-144
1X Penicilina Estreptomicina soluçãoGibco15140-122
Tubo cônico de 50 mLThermo Fisher339652
500 mL 0,22 µ m aparelho de filtração a vácuoGenesee25-227
750 kDa filtro de corte de cartucho de fibra ocaCytiva29-0142-95
AKTA Flux SCytiva29-0384-37
AKTA StartCytiva29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 contas magnéticasThermo Fisher10616D
B-cubed bufferONI 
CellMask RedThermo FisherC10046
Dubelco's Modified Eagle MediumThermo Fisher10566016
Fetal BovineSerum VWR97068-085
Frac 30 Fraction collectorCytiva29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0Thermo FisherBP381-5
HiTrap CaptoCore 700 ColunaCytiva17548151
Biologia Molecular Grau ÁguaCorning9820003
NanoimagerOxford Nanoimaging
ParaformaldehhydeMicroscopia Eletrônica Ciências15710
PolietilenoglicolThermo FisherBP233-1
RNase APromegaA797C
T175 FrascosGenesee25-211
Microesferas TetraspekInvitrogenT7279
Tris- HCl pH=7.5Thermo FisherBP153-1
Unicorn VCytiva29022094-ECOMINSSW
BCA0017 Custom

Referências

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