Uma tela comportamental para convulsões induzidas pelo calor em modelos de epilepsia de mouse

A epilepsia, a quarta família mais comum de distúrbios neurológicos nos Estados ^Unidos1, é caracterizada por um desequilíbrio de excitação e inibição no SNC que leva a convulsões recorrentes. Convulsões febris (SF) ou febre associada podem ocorrer na população geral, na maioria das vezes em crianças de 3 meses a 6 a 7 anos de idade. No entanto, em alguns indivíduos com mutações genéticas, na maioria das vezes em um gene de canal de sódio, fs pode persistir além da idade de 7 anos até a idade adulta. Esta condição é referida como convulsões febris mais ou FS+. Avanços rápidos no sequenciamento do genoma identificaram mais de 1.300 mutações no gene do canal de íons de sódio humano SCN1A, tornando-se um ponto de acesso para mutações de epilepsia. As mutações SCN1A têm sido ligadas a um amplo espectro de distúrbios convulsivos, incluindo convulsões febris (SF), epilepsia genética com convulsões febris mais (GEFS+) e Síndrome de Dravet (DS)2,3,4,5,6. Cerca de 20% das mutações missenses SCN1A levam a GEFS+^5,7,8. A história pediátrica de FS complexo ou prolongado na infância pode, posteriormente, desenvolver-se em formas mais debilitantes de epilepsia, como a epilepsia do lobo temporal (TLE)^9,10,11. A Síndrome de Dravet surge devido a mutações de truncação ou perda de mutações de função no SCN1A e é uma forma grave de epilepsia intratável, com início infantil de convulsões febris que se desenvolvem em convulsões refratárias, e muitas vezes está associada a prejuízos cognitivos, de desenvolvimento e motores2,5,12 . Como muitos indivíduos com GEFS+ e/ou DS exibem convulsões febris, torna-se imperativo desenvolver novas terapias para combater melhor esses distúrbios convulsivos.

Modelos animais de epilepsia associada ao SCN1A têm se mostrado inestimáveis na caracterização de diferentes tipos de convulsões (febril versus generalizada) e dissecando o mecanismo neuronal da geração convulsão13,14,15,16,17,18. Embora o estudo de convulsões espontâneas via gravações de EEG/EMG em cérebros de roedores seja bem estabelecido e seja uma ferramenta muito útil, apenas alguns estudos tentaram imitar convulsões febris em modelos de camundongos14,16,19,20,21,22,23 . Estudos anteriores usaram um jato de ar seco aquecido, ou um cilindro de metacrilato equipado com um sistema térmico, ou lâmpadas de calor com um controlador de temperatura em arenas de teste fechadas9,16,21,22,23,24 para induzir convulsões via hipertermia. A fim de aumentar a temperatura corporal em um ambiente mais controlado, o protocolo descrito aqui usa uma câmara personalizada com um sistema de aquecimento controlado pela temperatura que permitiu taxas reprodutíveis de aumento da temperatura corporal de um rato dentro da câmara. A câmara de calor foi construída a partir de madeira (comprimento de 40 cm x largura 34 cm x altura 31 cm) e foi equipada com um controlador de temperatura digital com um termopar K. Um pequeno ventilador axial equipado com um aquecedor no painel traseiro da câmara direciona o ar aquecido para a câmara regulado por um controlador de temperatura digital. Este sistema de aquecimento de ar forçado permite controlar a taxa em que a temperatura da câmara aumenta. (Figura 1A,B). O termopar K localizado dentro da câmara de calor de madeira envia feedback ao controlador de temperatura digital, para manter temperaturas constantes dentro da caixa durante o ensaio. Definir a temperatura no controlador de temperatura digital, permite que o ventilador elétrico envie ar forçado aquecido através de aberturas para aquecer uniformemente a câmara (Figura 1A). O painel frontal da câmara de calor é uma folha clara de plexiglass para permitir a gravação de vídeo fácil dos ensaios.

Camundongos adultos (P30-P40), heterozigosos para uma mutação missense em SCN1A que faz com que gefs+ e um número igual de companheiros de lixo do tipo selvagem sirvam como o grupo controle, foram selecionados para cada experimento. Os animais, tanto machos quanto fêmeas, utilizados nestes estudos pesavam pelo menos 15 g, pois os camundongos do tipo selvagem que pesavam menos eram mais sensíveis a convulsões induzidas pelo calor do que animais mais pesados da mesma idade. No estudo piloto, tanto os camundongos mutantes quanto os selvagens foram observados para procurar os cantos mais frios da câmara na parte de trás e permaneceram lá por longos períodos de tempo. Para contornar isso, o tamanho efetivo do piso dentro da arena de teste da câmara de calor foi reduzido ao comprimento de 16,5 cm x largura 21,5 cm x altura 27,5 cm colocando um bloco de madeira B (dimensões 20 cm x 8cm x 7,2 cm) no lado direito da câmara (Figura 1A). A câmara de calor foi construída a partir de madeira compensada de 1,9 cm de espessura (comprimento de 40 cm x largura 34 cm x altura 31 cm) coberta com laminado branco e equipada com um controlador de temperatura digital com um termopar K. A superfície laminada das paredes da câmara é impermeável e pode ser facilmente higienizada entre os ensaios, eliminando-se com 70% de etanol. A temperatura da câmara de calor foi inicialmente fixada em 50 °C e pré-aquecido por pelo menos 1 h antes do início do experimento, para garantir o aquecimento uniforme dentro da câmara. Cada rato foi equipado com um termômetro retal para monitoramento contínuo da temperatura corporal durante todo o experimento. Um único rato foi colocado na câmara de cada vez e a temperatura foi mantida em 50 °C entre ^1º e ^10º minuto. A temperatura foi então elevada para 55 °C durante o 11º-20º minuto, e finalmente aumentou para 60 °C para 21-30 ^minutos. Isso resultou em uma taxa reprodutível de aumento na temperatura corporal do mouse (Figura 2A). Cada ensaio foi gravado em vídeo e a análise comportamental foi realizada offline.

O protocolo de aquecimento pode ser facilmente modificado para alterar a temperatura inicial da câmara de calor e a taxa que a câmara é aquecida, o que por sua vez muda a rapidez com que a temperatura corporal do mouse é elevada durante o ensaio. Assim, este método proporciona mais flexibilidade em relação aos métodos tradicionais na configuração das telas comportamentais envolvendo convulsões induzidas pelo calor. O protocolo de convulsão induzido pelo calor também pode ser usado para rastrear drogas antiepilépticas que tornam os camundongos mutantes mais resistentes a convulsões induzidas pelo calor ou aumentam a temperatura limiar na qual as convulsões são observadas. Da mesma forma, os efeitos benéficos de regimes alimentares restritivos, como a dieta ceto em convulsões induzidas pelo calor, podem ser examinados em camundongos alimentados com chow normal versus ceto.

Figura 1: Descrição da câmara de calor do mouse personalizada. (A) O painel frontal da câmara de calor do mouse de madeira mostra o painel de controle lateral contendo o interruptor Power ON/OFF que liga o controlador de temperatura digital, o termopar K, o interruptor ON/OFF do aquecedor do ventilador e o indicador de calor. As dimensões externas da caixa e da arena de teste interna são mostradas em cm. Um bloco de madeira B usado para reduzir efetivamente a superfície da arena de teste também é mostrado. A parte inferior da arena de teste é coberta com roupa de cama de espiga para evitar que os ratos entrem em contato diretamente com superfícies de madeira aquecidas. (B) O painel traseiro da câmara de calor mostra o ventilador montado na ventilação superior e o cabo de alimentação para fornecer eletricidade à câmara. Este valor é modificado da Figura 3 em Das et al., 2021, eNeuro14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Todos os procedimentos animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Califórnia, Irvine.

1. Preparação para o ensaio de convulsão induzido pelo calor

1. Ligue o botão Ligar na câmara de calor, seguido do botão "Aquecer" .
2. Coloque a temperatura da câmara de calor a 50 °C usando o teclado no controlador de temperatura digital.
3. Aguarde o mínimo de 1h para pré-aqueça a câmara a 50 °C antes de introduzir o primeiro mouse na câmara. O pré-aquecimento garante o aquecimento uniforme dentro da câmara.
4. Forque o chão da câmara de calor do rato com roupa de cama de espiga.
5. Monte uma câmera de gravação de vídeo na frente da câmara de calor para gravar cada ensaio de ensaio de convulsão induzido pelo calor.
6. Forra uma placa de Petri de 140 mm de diâmetro com camadas grossas de papel de tecido e coloque-a no gelo para servir como uma almofada de resfriamento.
   NOTA: No final do ensaio, o mouse individual será transferido na almofada de resfriamento pré-cichilled para ajudar a reduzir sua temperatura corporal elevada.

2. Preparando o mouse para ensaio de convulsão induzido pelo calor

1. Selecione 10 camundongos adultos (P30-P40), 5 que carregam a epilepsia causando mutação e 5 dos companheiros de ninhada do tipo selvagem para ensaio de triagem de convulsões induzida pelo calor.
   NOTA: Ratos do tipo selvagem, que não abrigam nenhuma mutação causadora de epilepsia, não apresentam convulsões induzidas pelo calor a temperaturas abaixo de 44 °C e servem como grupo controle.
2. Pesar cada rato para ser usado para o ensaio de triagem e registrar seu peso corporal. Apenas ratos pesando 15 g ou mais devem ser usados para o ensaio.
3. Tela um mouse de cada vez na câmara de calor do mouse.
4. Anestesia brevemente o mouse para 10-15 s usando algumas gotas de isoflurane no fundo de um frasco de sino.
5. Tire o animal do pote do sino e coloque-o em uma toalha de papel.
6. Certifique-se de que o mouse está completamente anestesiado verificando se o mouse não responde a uma pitada nociva do dedo do dedo.
7. Cubra a ponta metálica da sonda de temperatura retal com um lubrificante (como geleia de petróleo) e insira-a suavemente no mouse a uma profundidade inferior ou igual a 2 cm.
8. Fixar a sonda retal na cauda do mouse com fita adesiva, para que a sonda não saia durante o ensaio.
   NOTA: Alternativamente, coloque o animal em um cone de contenção do mouse e insira a sonda de temperatura retal. Fixá-lo gravando na cauda.
9. Certifique-se de que a sonda retal está conectada a um multimetro que exibe a temperatura interna do corpo do mouse.
10. Coloque o animal em uma gaiola fresca forrada com roupa de cama de espiga, ou seja, a gaiola de recuperação.
11. Inicie um temporizador e espere por 5 minutos. Observe o mouse até que ele tenha se recuperado completamente da anestesia e o rato esteja ativo e preparando.
    1. Simultaneamente, monitore a temperatura corporal do mouse até estabilizar a 35-36 °C.
12. No final de 5 min, note a temperatura corporal do mouse. Esta é a temperatura corporal inicial no momento "0" min.
    NOTA: Se a temperatura corporal do núcleo do camundongo estiver abaixo de 35 °C, aguarde mais tempo para o animal se recuperar da hipotermia induzida pela anestesia.
13. Transfira rapidamente o mouse individual para a câmara do mouse pré-aquecido. Isso marca o início do teste de experiência. Apenas um mouse é exibido em um determinado momento.

3. Ensaio de convulsão induzido pelo calor

1. Depois de colocar suavemente o mouse no chão da câmara de calor do mouse pré-aquecido, feche a porta do plexiglass e inicie a câmera para gravar o vídeo gravando o experimento.
2. Comece o cronômetro. Regissão do corpo do camundongo a partir do termômetro retal em intervalos de 1 min durante a duração do experimento.
3. Em intervalos regulares, aumente a temperatura da câmara de calor do rato de tal forma que a temperatura corporal do mouse aumente a uma taxa de 0,25-0,5 °C /min.
   NOTA: Aumentos rápidos na temperatura corporal podem levar a insolação ou morte e devem ser evitados.
4. Seguindo este protocolo, aumente a temperatura da câmara de calor do rato em 5 °C a cada 10 minutos, como mostrado na Figura 2A.
5. Em 9,5 min, coloque a temperatura da câmara de calor para 55 °C, para estabilizar a temperatura da câmara de calor para 55 °C até o ^10º minuto, como mostrado no visor de temperatura digital.
6. Da mesma forma, aumente a temperatura para 60 °C em 19,5 min para estabilizar a temperatura da câmara de calor para 60 °C até o ^20º minuto. Cada teste de triagem de convulsões dura 30 minutos.
7. Se o mouse tiver uma convulsão (vocaliza, mostra cabeça acenando, forelimb clonus, extensão hindlimb, cai de lado ou experimenta convulsões tônicas/clonic generalizadas), registou as seguintes informações.
   1. Regissão da temperatura corporal do camundongo durante a convulsão (temperatura do limiar da convulsão) do termômetro da temperatura retal.
   2. Regissos de comportamento de convulsão, como acenar para a cabeça, clonus de membro dianteiro, extensão do membro traseiro, queda na lateral e/ou convulsões tônicas/clonic generalizadas (GTCS) exibidas pelo mouse.
8. Pegue o mouse rapidamente, mas suavemente, da câmara e coloque-o na almofada de resfriamento preparada na etapa 1.6.
   NOTA: Se um rato está experimentando convulsões de escala racine 5 e exibindo saltos descontrolados, pode ser difícil pegar o animal da câmara de calor e transferido para a almofada de resfriamento do lado de fora. No entanto, uma convulsão típica induzida pelo calor dura entre 30 e 60 s.Assim, o mouse deve ser retirado da câmara de calor e colocado na almofada de resfriamento dentro de 60 s do início do episódio de convulsão induzido pelo calor.
9. Aguarde que a temperatura do corpo do rato desça para 36-37 °C, antes de transferi-lo para uma gaiola de recuperação. Apenas um rato é colocado em uma gaiola de recuperação de cada vez.
   NOTA: Não misture camundongos que ainda não foram usados para triagem induzida pelo calor com o mouse que já experimentou o teste de convulsão induzido pelo calor.
10. Com cuidado e cuidado, corte a fita entre a cauda do rato e o fio da sonda retal com um par de tesouras para remover a sonda retal do mouse.
11. Limpe a ponta metálica da sonda retal com 70% de álcool e lenços de tecido mole para mantê-la pronta para o próximo teste.
12. Continue observando o rato na gaiola de recuperação até que ele retome a atividade normal (caminhada, preparação, etc.), antes de devolver o rato para sua gaiola doméstica. Isso marca o fim do teste de experiência para este rato.
13. Registo o status do animal após o ensaio vivo e recuperado da sessão de teste ou morto. Convulsões de alta intensidade envolvendo saltos descontrolados e convulsões tônicas/clonic generalizadas podem, por vezes, resultar na morte do rato.
14. Se um rato não experimentar convulsões induzidas pelo calor dentro do período de observação de 30 minutos ou a temperatura corporal do mouse atingir 44 °C, remova o mouse da câmara de calor e coloque na almofada de resfriamento até que a temperatura do corpo do mouse volte a 36-37 °C.
15. Reinicie a temperatura da câmara de calor do mouse para 50 °C e deixe equilibrar até que a temperatura do display no controlador de temperatura digital mostre 50 °C.
16. Altere a cama de espiga entre ensaios individuais do mouse.
17. Prepare o próximo mouse para o teste de triagem, conforme descrito na seção 2 e repita os passos da seção 3.

4. Eutanásia dos animais

1. Embora a maioria dos animais recupere convulsões pós-induzidas pelo calor, em nossa experiência, alguns dos camundongos passam por SUDEP (Morte Súbita Inexplicável em EPilepsy) em sua gaiola doméstica dentro de 24-48 horas de convulsões induzidas pelo calor. Depois de concluir a triagem em todos os camundongos individualmente para convulsões induzidas pelo calor após o teste de 30 minutos, eutanize todos os camundongos de acordo com as diretrizes da IACUC da instituição.

5. Analisando os dados de convulsão induzidos pelo calor

1. Após completar a triagem de uma coorte de animais, calcule a porcentagem de camundongos em um determinado genótipo mostrando convulsões usando a seguinte fórmula:
   
2. Estime a temperatura média do limiar de apreensão dos camundongos dentro de um determinado genótipo, com uma média da temperatura do limiar de apreensão de todos os camundongos (anotado na etapa 3.7) nesse genótipo que exibe convulsões induzidas pelo calor.
3. Enquanto ainda estiver cego para a identidade e genótipo, reproduza as gravações de vídeo de cada um do mouse durante a triagem de ensaios de convulsão induzidos pelo calor em uma tela de computador para marcar a gravidade dos ataques de convulsão.
4. Dê pontuações a um camundongo individual que apresente comportamento de convulsão induzido pelo calor usando a escala de Racine ^modificada13, conforme descrito por estudos ^{anteriores13,14}. Consulte a Tabela 1 para obter detalhes.
5. Se um rato, enquanto experimenta convulsões induzidas pelo calor, só mostra a cabeça acenando, dê-lhe uma pontuação de 2. Se um rato iniciar um episódio de convulsão com cabeça acenando, mas também exibe o tímulo dianteiro clonus, caindo e/ou pulando dê-lhe uma pontuação de 5.
6. Registo o máximo para cada mouse usando a escala racine ^modificada13 como descrito acima.
7. Plote um gráfico de dispersão de pontuações máximas de Racine exibidas por todos os ratos em um determinado genótipo.
8. Comparar estatisticamente os escores máximos de Racine entre diferentes grupos de camundongos como um método para determinar a gravidade de convulsões comportamentais, como convulsões induzidas pelo calor.
   NOTA: Os escores de racine são úteis para comparar características de convulsão entre diferentes grupos de camundongos mutantes ou genótipos. Espera-se que os camundongos do tipo selvagem não se submetam a convulsões induzidas pelo calor e não teriam que ser considerados para comparações de pontuação racina.
9. Com base no design experimental, realize análises estatísticas apropriadas para determinar se a porcentagem de camundongos que exibem convulsões entre camundongos selvagens e mutantes, e seus valores médios de temperatura limiar de convulsão são significativamente diferentes entre si.

Tabela 1: Pontuação de Racine.

Espera-se que modelos animais com mutações de convulsão febril sejam submetidos a convulsões induzidas pelo calor a temperaturas corporais elevadas que não induzem convulsões nos companheiros de ninhada do tipo selvagem. As mutações SCN1A foram associadas a convulsões febris, incluindo pacientes K1270T GEFS+, que apresentam convulsões febris e afebril generalizadas7. Nós examinamos crispr gerou SCN1A K1270T GEFS+ camundongos mutantes recentemente descritos em um estudo14 para a ocorrência de apreensões de calor em dois antecedentes genéticos - resistente à convulsão 129X1/SvJ (129X1) e inconsumente c57BL/NJ (B6N). A idade corresponde aos companheiros de lixo do tipo selvagem na câmara de calor do rato que não abrigam nenhuma mutação GEFS+ e, portanto, não são esperados para exibir convulsões induzidas pelo calor, servindo como o grupo de controle. A taxa de mudança de temperatura corporal ao longo do tempo foi avaliada por plotagem da temperatura corporal média dos ratos registrada a cada minuto durante o ensaio. Não houve diferença na taxa de mudança da temperatura corporal entre camundongos mutantes heterozigos e companheiros de lixo do tipo selvagem testados em suas respectivas origens genéticas 129X1 e B6N (Figura 2B,C). Isso sugere que a termoregulação não é alterada em camundongos mutantes heterozigostos K1270T GEFS+.

Todos os camundongos mutantes heterozigos de 129X1 (n = 15) ou B6N (n = 9) apresentaram convulsões induzidas pelo calor (Figura 2D). Nenhum dos camundongos do tipo selvagem no fundo enriquecido 129X1 (n = 13) apresentou convulsões induzidas pelo calor (Figura 2D). Em contraste, um terço dos camundongos testados (n = 3 dos 9 camundongos) no fundo B6N sensível à convulsão exibiu convulsões induzidas pelo calor. A comparação estatística mostra que a porcentagem de camundongos mutantes heterozigos que exibem convulsões induzidas pelo calor foi significativamente maior do que seus respectivos camundongos de tipo selvagem nos níveis genéticos 129X1 e B6N (Figura 2D, teste exato de Fisher, 129X1 p < 0,0001; B6NJ p = 0,009). A temperatura média do limiar de convulsão entre os camundongos mutantes heterozigosos em 129X1 e B6N foi semelhante. Camundongos mutantes 129X1 têm uma temperatura média do limiar de convulsão de 42,6 ± 0,20 °C, o que não foi significativamente diferente da temperatura média do limiar de convulsão de 42,7 ± 0,06 °C visto em camundongos B6N (Figura 2E; teste t-teste não remunerado do estudante não remunerado de duas caudas, p = 0,782). É importante notar que a temperatura média do limiar de apreensão de três camundongos do tipo selvagem B6N que apresentaram convulsões induzidas pelo calor foi de 43,7 ± 0,08 °C e significativamente maior que o limiar médio de apreensão de 42,7 ± 0,06 °C exibido por camundongos mutantes heterozigos (Figura 2E, t-teste de aluno não pago de duas caudas, p < 0,0001).

A frente de plexiglass da câmara torna possível fazer gravações de vídeo contínuas durante o ensaio que pode ser usado mais tarde para marcar a gravidade da convulsão em cada rato em uma escala racina modificada, como descrito anteriormente14,20. Durante um ensaio típico, camundongos mutantes heterozigos exibiriam convulsões induzidas pelo calor com vocalização e/ou cabeça-acenando (pontuação racine 2), e transição rápida para clonus de forelho, caindo de lado, saltando, extensão de subida traseira e/ou convulsões tônicas/clonic generalizadas (racine scores 3-5) quando a temperatura corporal atingiu cerca de 42 °C. A pontuação máxima de Racine representa o comportamento de convulsão induzido pelo calor mais severo entre os camundongos mutantes. A pontuação máxima de Racine de camundongos mutantes heterozigosos em fundo enriquecido em 129X1 (n = 15) não é diferente dos camundongos mutantes heterozigos em B6N (n = 9) fundo genético (Figura 2F; Teste de Mann-Whitney, p > 0,9999). Isso sugere que as características de comportamento de convulsão induzidas pelo calor em camundongos mutantes K1270T GEFS+ são independentes do fundo da tensão.

Juntos, os dados demonstram que todos os camundongos mutantes exibem convulsões induzidas pelo calor com frequência semelhante, temperatura do limiar de convulsão e gravidade da convulsão comportamental de forma independente da tensão. A maioria dos companheiros de ninhada do tipo selvagem não exibe tais convulsões a menos de 44 °C. Cerca de um terço dos camundongos de controle do tipo selvagem em um fundo B6N sensível à convulsão apresentaram convulsões induzidas pelo calor (possivelmente devido a efeitos genéticos de fundo), mas a temperatura do limiar de convulsão foi significativamente maior em comparação com ratos mutantes no mesmo fundo. Esses resultados sugerem que camundongos mutantes em origem genética B6N são suscetíveis a convulsões induzidas pelo calor a limiares de temperatura mais baixos devido à mutação SCN1A GEFS+ que abrigam. Assim, usando este protocolo, pode-se avaliar convulsões induzidas pelo calor em camundongos mutantes de epilepsia e distinguir-se de camundongos companheiros de ninhada do tipo selvagem, que ou não sofrem convulsões induzidas pelo calor ou exibem convulsões de calor a temperaturas significativamente mais altas.

Figura 2: Camundongos mutantes exibem convulsões induzidas pelo calor. (A) O protocolo de aquecimento para triagem comportamental de convulsões induzidas pelo calor em camundongos. (B-C) Temperatura corporal média de camundongos através do tempo em camundongos do tipo selvagem (Scn1a+/+ - triângulos negros) e mutantes heterozigos (Scn1aKT/+ - círculos laranjas) em dois fundos genéticos 129X1 e B6N, respectivamente. (D) Percentual de camundongos que mostram convulsões induzidas pelo calor em ambos os antecedentes genéticos. Os ratos do tipo selvagem (Scn1a+/+) e heterozigos (Scn1aKT/+) são representados por barras pretas e laranjas, respectivamente. Mutantes heterozigos em fundos 129X1 e B6N são mostrados em barras laranja sólidas e barras laranjas com listras pretas, respectivamente. (E) Limiar de temperatura da convulsão para convulsões induzidas pelo calor em camundongos do tipo selvagem (Scn1a+/+) e mutantes heterozigos (Scn1aKT/+) em ambas as cepas. (F) Distribuição de dispersão de escores máximos de racine de convulsões induzidas pelo calor exibidas por camundongos heterozigos (Scn1aKT/+) em ambos os antecedentes genéticos. Cada ponto representa a pontuação máxima de Racine em um único mouse. O número de animais em cada genótipo é mostrado entre parênteses. Os dados mostrados nos painéis B-F são ± S.E.M. Este valor é modificado da Figura 3 em Das et al., 2021, eNeuro14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não declaram conflitos de interesse.