Ensaio de trifosfato hidrolases de nucleosídeo em Toxoplasma gondii e Neospora caninum para triagem de alto rendimento usando um braço robótico

Riho Kurata; Masamitsu Harada; Jun Nagai; Xiaofeng Cui; Takayuki Isagawa; Hiroaki Semba; Yasuhiro Yoshida; Norihiko Takeda; Koji Maemura; Tomo Yonezawa

doi:10.3791/62874

É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Ensaio de trifosfato hidrolases de nucleosídeo em Toxoplasma gondii e Neospora caninum para triagem de alto rendimento usando um braço robótico

831 visualizações

⸱

DOI:

10.3791/62874

⸱

22 de julho de 2022

Riho Kurata^*¹ , Masamitsu Harada^*² , Jun Nagai^*³ , Xiaofeng Cui^*⁴ , Takayuki Isagawa⁵ , Hiroaki Semba⁶ , Yasuhiro Yoshida⁷ , Norihiko Takeda⁸ , Koji Maemura⁹ , Tomo Yonezawa³

¹Education and Research Center for Pharmaceutical Sciences, Faculty of Pharmacy, Osaka Medical and Pharmaceutical University, ²Independent Scholar, Tokyo, Japan, ³Division of Functional Genomics and Therapeutic Innovation, Research Center for Advanced Genomics, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University, ⁴School of Chemistry, Chemical Engineering and Life Sciences, School of Materials and Engineering, Wuhan University of Technology, ⁵Data Science Center, Jichi Medical University, ⁶Department of Cardiovascular Medicine, The Cardiovascular Institute, ⁷Department of Immunology and Parasitology, University of Occupational and Environmental Health, ⁸Division of Cardiology and Metabolism, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, ⁹Department of Cardiovascular Medicine, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University Hospital

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

As infecções por Toxoplasma gondii e Neospora caninum são encontradas em humanos e animais e levam a sérios problemas de saúde. Os dois parasitas compartilham hidrolases de trifosfato de nucleosídeo semelhantes e desempenham papéis importantes na propagação e sobrevivência. Estabelecemos um ensaio de alto padrão das enzimas que requerem o uso do braço robótico.

Resumo

Os parasitas protozoários infectam humanos e muitos animais de sangue quente. O Toxoplasma gondii, um dos principais parasitas protozoários, é comumente encontrado em pacientes HIV-positivos, receptores de transplante de órgãos e mulheres grávidas, resultando na grave condição de saúde, Toxoplasmose. Outro protozoário importante, Neospora caninum, que tem muitas semelhanças com o Toxoplasma gondii, causa doenças graves em animais, assim como a encefalomielite e a miostite-polirradiculite em cães e vacas, resultando em bezerros natimortos. Todos estes exibiram nucleosídeos trifosfato hidrolases semelhantes (NTPase). Neospora caninum tem uma NcNTPase, enquanto Toxoplasma gondii tem uma TgNTPase-I. Acredita-se que as enzimas desempenhem papéis cruciais na propagação e sobrevivência. A fim de estabelecer compostos e/ou extratos que previnam a infecção por protozoários, direcionamos essas enzimas para a descoberta de medicamentos. O próximo passo foi estabelecer um ensaio novo, altamente sensível e altamente preciso, combinando um ensaio enzimático bioquímico convencional com um ensaio fluorescente para determinar o conteúdo de ADP. Também validamos que o novo ensaio preenche os critérios para realizar triagem de alto rendimento (HTS) nas duas enzimas protozoárias. Realizamos HTS, identificamos 19 compostos e seis extratos de duas bibliotecas de compostos sintéticos e uma biblioteca de extratos derivados de bactérias marinhas, respectivamente. Neste estudo, foi introduzida uma explicação detalhada sobre como realizar o HTS, incluindo informações sobre a preparação de reagentes, dispositivos, braço robótico, etc.

Introdução

A robótica foi estabelecida como ferramentas sofisticadas e poderosas para alcançar avanços significativos em vários campos além da indústria e da engenharia de fabricação, como bioquímica, biologia molecular e pesquisa clínica, e notadamente HTS ^1,2,3. O Toxoplasma gondii é um dos principais parasitas e um eucariota parasita unicelular⁴ que causa sérios problemas de saúde em humanos⁵ e muitos animais homeotérmicos⁴, resultando em infecções que levam à toxoplasmo....