Este protocolo para medição de alto rendimento da motilidade celular em queratinócitos HaCaT descreve métodos para coletar e processar imagens de núcleos celulares e realizar rastreamento de partículas usando o plug-in TrackMate do ImageJ.
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Artigo de método
Protocolo para Análise e Consolidação de Saídas TrackMate para Medição da Motilidade Celular Bidimensional usando Rastreamento Nuclear
Neste artigo
Resumo
Resumo
A migração celular coletiva desempenha um papel fundamental em muitos processos biológicos fundamentais, incluindo desenvolvimento, cicatrização de feridas e metástase do câncer. Para entender a regulação da motilidade celular, devemos ser capazes de medi-la de forma fácil e consistente em diferentes condições. Aqui descrevemos um método para medir e quantificar a motilidade unicelular e em massa de queratinócitos HaCaT usando uma coloração nuclear. Este método inclui um script MATLAB para analisar arquivos de saída do TrackMate para calcular deslocamentos, taxas de motilidade e ângulos de trajetória em células únicas e em massa para um local de imagem. Este script de análise de motilidade permite uma análise rápida, direta e escalável das taxas de motilidade celular a partir de dados do TrackMate e pode ser amplamente usado para identificar e estudar a regulação da motilidade em células epiteliais. Também fornecemos um script MATLAB para reorganizar vídeos de microscopia coletados em um microscópio e convertê-los em pilhas TIF, que podem ser analisadas usando o plug-in ImageJ TrackMate em massa. Usando esta metodologia para explorar os papéis das junções aderentes e da dinâmica do citoesqueleto de actina na regulação da motilidade celular em queratinócitos HaCaT, demonstramos evidências de que a atividade de Arp2/3 é necessária para a motilidade elevada observada após a depleção de α-catenina em queratinócitos HaCaT.
Introdução
A regulação precisa e responsiva da motilidade celular nas células epiteliais é crucial para a cicatrização de feridas e para o reabastecimento da camada epitelial. A falha em manter a motilidade pode levar a problemas com o desenvolvimento embrionário e a cicatrização de feridas1 e a sinalização de motilidade hiperativa é um dos principais contribuintes para a metástase do câncer2.
Compreender o controle celular da motilidade em queratinócitos HaCaT oferece informações importantes sobre esses processos. Os procedimentos descritos aqui fornecem medições e cálc....
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Protocolo
1. Cultura celular e preparação da placa de imagem
- Cultura de células HaCaT em meio de cultura celular (Dulbecco's Modified Eagle's Medium suplementado com 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina e 10% (v/v) de soro fetal bovino) a 37 °C e 5% de dióxido de carbono em uma incubadora umidificada.
- Semeie o número desejado de células por poço (usamos 5000 - 20.000 células/poço) em uma placa de imagem de 96 poços, como uma microplaca de poliestireno preto de 96 poços. Para três poços, adicione apenas meio (sem células).
- Descanse a placa em uma superfície completamente plan....
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Resultados
Para garantir que nosso roteiro de análise fosse confiável e consistente, medimos a motilidade dos queratinócitos HaCaT em três experimentos independentes. Descobrimos que, embora o desvio padrão das motilidades celulares fosse variável entre os experimentos (possivelmente devido à sensibilidade das células HaCaT à confluência e estímulos mecânicos), a motilidade média foi consistentemente replicada em vários experimentos sem diferenças estatisticamente significativas entre as réplicas de acordo com um teste t de Student.......
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Discussão
A metodologia e as ferramentas de análise descritas acima fornecem um meio direto e escalável para medir e quantificar a motilidade dos queratinócitos HaCaT que usam MATLAB e requerem experiência mínima em programação. Este protocolo exige que os núcleos das células sejam corados e fotografados ao longo de pelo menos 5 h. Embora a coleta de dados possa ser realizada em qualquer microscópio adequado, este protocolo fornece um script para processar imagens coletadas em um microscópio Image.......
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Divulgações
X.L. e a Universidade do Colorado Boulder têm interesse financeiro no desenvolvimento de inibidores de HDAC para terapêutica e possuem participação na OnKure. X.L. é cofundador e membro do conselho de administração da OnKure, que licenciou inibidores de HDAC proprietários da Universidade do Colorado em Boulder. A OnKure não tem envolvimento no projeto experimental nem no financiamento deste estudo.
Agradecimentos
Agradecemos a Daniel Messenger, Lewis Baker, Douglas Chapnick, Adrian Ramirez, Quanbin Xu e outros membros dos laboratórios Liu e Bortz por sua visão e conselhos. Agradecemos a Jian Tay por compartilhar sua experiência em MATLAB e por escrever a função para importação de XML. Agradecemos a Joseph Dragavon, do Núcleo de Microscopia de Luz Avançada BioFrontiers, por seu suporte à microscopia e imagem. Agradecemos a Theresa Nahreini e Nicole Kethley, do Cell Culture Core Facility, por seu apoio à cultura de células. Este trabalho foi apoiado por doações do Instituto Nacional do Câncer e do Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoe....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Microplacas tratadas com TC de poliestirina preta de fundo transparente de 96 poços, embaladas individualmente, com tampa, estéreis | Corning | 3603 | |
| Meio de águia modificado de Dulbecco (alto D-glicose) | Life Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific | 12800-082 | |
| Soro fetal bovino | Sigma-Aldrich Inc | F0926 | |
| Meio de águia modificado de Fluorobrite Dulbecco (alto D-glicose, 3,7 g/L de bicarbonato de sódio, sem L-glutamina, sem vermelho de fenol) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | A18967-01 | |
| GlutaminePlus | R& D Systems Inc. | R90210 | |
| Hoechst 33342, tricloridrato, trihidrato | Invitrogen/Thermo Fisher Scientific | H21492 | |
| Penicilina estreptomicina | Life Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Solução salina tamponada com fosfato | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 14190-144 |
Referências
- Li, L., He, Y., Zhao, M., Jiang, J. Collective cell migration: Implications for wound healing and cancer invasion. Burns & Trauma. 1 (1), 21-26 (2015).
- Stuelten, C. H., Parent, C. A., Montell, D. J. Cell motility in cancer invasion and me....
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Reimpressões e permissões
