Preparação de amostras por fresagem de feixe de íons com foco correlativo 3D para tomografia crioeletrônica de alta resolução

Resumo

Aqui, apresentamos um pipeline para fresagem de feixe de íons com foco correlativo 3D na orientação da preparação de amostras celulares para tomografia crio-eletrônica. A posição 3D das proteínas fluorescentemente marcadas de interesse é primeiramente determinada por microscopia de criofluorescência e, em seguida, direcionada para moagem. O protocolo é adequado para células de mamíferos, leveduras e bactérias.

Resumo

A tomografia crioeletrônica (crio-TE) tornou-se o método de escolha para investigar a ultraestrutura celular e complexos moleculares em seu estado nativo congelado-hidratado. No entanto, o crio-ET requer que as amostras sejam finas o suficiente para não espalhar ou bloquear o feixe de elétrons incidente. Para amostras celulares espessas, isso pode ser obtido por fresagem por feixe de íons criofocado (FIB). Este protocolo descreve como atingir sítios celulares específicos durante a fresagem de FIB usando uma abordagem correlativa 3D, que combina dados de microscopia de fluorescência tridimensional com informações do microscópio eletrônico de varredura de FIB. Usando esta técnica, eventos e estruturas celulares raras podem ser alvo com alta precisão e visualizados em resolução molecular usando microscopia eletrônica de criotransmissão (crio-TEM).

Introdução

A fresagem por feixe iônico focalizado permite a preparação de amostras biológicas finas a partir de corpos de prova criofixados sem os problemas comumente associados a cortes mecânicos, como marcas de faca e artefatos de compressão¹. Quando emparelhada com a tomografia crioeletrônica, a moagem FIB permite estudos biológicos de alta resolução da morfologia celular e determinação da estrutura de complexos macromoleculares diretamente do interior das células em resolução subnanométrica2,3,4. Enquanto espécies abundantes, como ribossomos, são facilmente encontradas em lamelas FIB cortadas aleatoriamente, muitos processos celulares dependem da colocalização de vários complexos ou estão localizados em locais específicos dentro da célula. Consequentemente, o direcionamento eficiente é necessário para não perder a característica biológica de interesse durante o processo de moagem e ser limitado a acertos aleatórios. Uma abordagem correlativa que combine dados do microscópio eletrônico de varredura (MEV)-FIB e um microscópio de luz criofluorescência (FLM) é, portanto, necessária. Embora seja possível omitir a correlação inicial e combinar dados de FLM e crio-ET somente após a aquisição de MET^5,6, a fresagem por feixe de íons focalizado guiada por fluorescência permite uma seleção precisa da área de moagem previamente^, resultando em uma aquisição de dados mais eficiente. Desde sua concepção⁷, a aplicação da moagem FIB correlacionada em 3D em estudos biológicos era limitada até recentemente relatarmos a identificação de um novo compartimento líquido-líquido separado por fase (LLPS) em leveduras usando esta técnica⁸.

Descrito aqui é um protocolo de microscopia de luz e eletrônica (CLEM) criocorrelacionada 3D generalizada, que pode ser usado para estudar uma ampla variedade de amostras que variam de bactérias a leveduras e células de mamíferos. Embora os experimentos tenham sido realizados com um determinado conjunto de instrumentos, os passos individuais não estão vinculados a hardware específico e podem ser facilmente transferidos para outros sistemas como uma extensão dos protocolos existentes ^3,5. Uma lista dos equipamentos testados e configurações sugeridas são fornecidas na Tabela de Materiais e na Tabela 1. As quatro etapas principais da tubulação são (1) preparação da amostra, (2) localização de características de interesse por microscopia de criofluorescência, (3) fresagem por feixe de íons focalizado correlacionado em 3D e (4) localização das estruturas alvo para aquisição de dados de crio-ET nas lamelas no microscópio eletrônico de criotransmissão (Figura 1).

Protocolo

Figura 1: Resumo do fluxo de trabalho com uma seleção de etapas críticas. Todo o protocolo é dividido em quatro etapas, de acordo com o equipamento utilizado: preparação da amostra, incluindo congelamento por imersão, microscopia de criofluorescência, fresagem por feixe de íons com foco criofocado e microscopia crioeletrônica. Para cada etapa, vários pontos-chave são destacados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Cultura celular e congelamento por imersão de grades

1. Cultivar células de escolha e otimizar estratégias de marcação e tratamento à temperatura ambiente antes de passar para crioexperimentos. Os alvos de interesse são marcados usando fusões de proteínas fluorescentes ou coloração viva (por exemplo, Halo-Tag, LysoTracker, BODIPY, coloração de anticorpos vivos, etc.). Se o tratamento com agentes químicos ou biológicos (pequenas moléculas, meios especiais, siRNA, etc.) for necessário para investigar o processo biológico de interesse, otimize as condições (por exemplo, tempo, concentração) usando imagens FLM de células vivas.
   1. Certifique-se de que os locais de interesse possam ser localizados com sucesso acima do plano de fundo em um número suficiente de células usando configurações de imagem que correspondam às condições criogênicas posteriores o mais próximo possível (ou seja, NA, tempo de exposição, etc.).
2. Seleção e preparação de grades
   1. Seleccione grelhas com tamanho e espaçamento adequados às células e aos marcadores fiduciais utilizados (ver passo 1.3.1). Não use filme contínuo sem furos, pois isso pode resultar em muito tampão residual após a mancha e, assim, reduzir a eficiência da vitrificação e dificultar a detecção de esferas fiduciais. Para um contacto prolongado das células com as grelhas, certifique-se de que o suporte da grelha e o material do filme são biocompatíveis.
   2. Limpe as grades crio-EM por plasma para torná-las mais hidrofílicas. Para uso em cultura de células aderentes, esterilizar as grades após a limpeza do plasma com radiação UV por 20 min em uma capela de fluxo laminar. Opcionalmente, as grades podem ser pré-tratadas com compostos que ajudam na adesão celular, como poli-L-lisina ou concanavalina A, conforme descrito abaixo.
      NOTA: Em geral, as seguintes combinações de grade/amostra foram usadas com sucesso no fluxo de trabalho crio-FIB correlativo: Levedura: ou Au, 200 mesh, R1/4 carbono ou filme SiO₂ , opcionalmente revestido com concanavalina A; Escherichia coli: ou Au, 200 mesh, R1/4 carbono ou filme SiO₂ ; Chlamydomonas reinhardtii: ou Au, 200 mesh, R1/2 ou R1/4 carbono ou filme SiO₂ ; HeLa: Au, 200 mesh, filme R1/4 SiO₂ , revestido com poli-L-lisina; HEK293: Au, 200 mesh, filme R1/4 SiO₂ , revestido com poli-L-lisina.
   3. Revestimento de concanavalina A para melhorar a fixação de células de levedura:
      • Preparar uma solução de revestimento de 1 mg/mL de concanavalina A em tampão HEPES 10 mM com CaCl₂ 100 μM, pH 8,5. Colocar uma gota (50 μL) da solução de revestimento e duas gotas de água destilada separadamente sobre um pedaço de filme de parafina.
      • Pegue a grade limpa a plasma com pinças de força reversa e insira-a cuidadosamente na gota da solução de revestimento, evitando movimentos perpendiculares à grade para evitar danos ao filme.
      • Após ~5 s de incubação, lave a grade duas vezes, inserindo-a nas gotas de água de maneira semelhante. Por fim, elimine o excesso de líquido aplicando um papel filtro na parte de trás da grade e deixe a grade secar completamente antes de liberá-la da pinça. Use as grades secas para congelamento por imersão.
   4. Revestimento de poli-L-lisina para cultura em suspensão e células aderentes:
      • Preparar uma solução de revestimento de 1 mg/mL de poli-L-lisina em tampão borato de sódio 0,1 M, pH 8,5.
      • Coloque grades limpas com plasma em um prato adequado para cultura de células e esterilize por 20 minutos por radiação UV.
      • Adicione suavemente solução de revestimento suficiente para cobrir todas as grades e incube a 37 °C durante, pelo menos, 2 horas. Aspirar o líquido e lavar suavemente as grades duas vezes com PBS antes de semear as células para a concentração desejada.
3. Preparação de células e contas fiduciais
   NOTA: Contas fiduciais são necessárias para o registro 3D dos dados de fluorescência com imagens tiradas no microscópio FIB/MEV para permitir a fresagem FIB correlativa 3D.
   1. Escolha contas reconhecíveis em todas as modalidades de imagem, ou seja, FLM, MEV e IB (diâmetro recomendado de 0,5-1 μm), mas certifique-se de que elas não ofusquem a estrutura do alvo celular durante a imagem de fluorescência para facilitar a diferenciação das esferas e da característica biológica de interesse. Remova conservantes citotóxicos em esferas fiduciais (por exemplo, NaN₃), conforme instruções do fabricante.
      NOTA: Para uma distinção mais fácil entre as características biológicas de interesse e as fiduciárias, é útil se os espectros de emissão de fluorescência se sobrepõem apenas parcialmente para que os sinais possam ser distinguidos com base nas diferenças de intensidade nos canais FLM.
   2. Se a cultura em suspensão for usada, cultive as células até uma densidade adequada (por exemplo, levedura OD 600 = 0,8, E. coli OD 600 = 0,8-1,0, C. reinhardtii ₁₅₀₀ células/μL) e realize tratamentos conforme necessário para o experimento, como mudança de meio, adição de produtos químicos, fome, etc. Fixe as grelhas limpas por plasma às pinças, conforme exigido para o método de imersão (manual/automático), e aplique 4 μL da suspensão celular misturada com ~1 x 10⁵ contas/μL de suspensão de esferas fiduciais no lado do filme das grades.
      NOTA: Determinar a diluição ideal de células e fiduciais em experimentos de titulação (por exemplo, verificando o crio-FLM ou FIB/SEM, veja abaixo). No entanto, para a maioria das células cultivadas em suspensão, uma concentração final de ~1 x 10⁵ contas/μL das esferas fiduciais de 1 μm (diluição de 1:20 do estoque; veja Tabela de Materiais para detalhes) provou ser um bom ponto de partida.
   3. Se for usada cultura aderente, limpe e esterilize as grades usando radiação UV para cultura asséptica. Se necessário, pré-revestir grades com compostos que ajudam a adesão celular (por exemplo, poli-L-lisina, fibronectina, laminina; ver passo 1.2.2). Seme e cresça células nas grades em pratos de cultura normais ou pratos com subdivisões para grades.
   4. Tratar as amostras conforme necessário para o experimento e manter as células em condições ideais apenas até o congelamento por imersão (por exemplo, 37 °C/5% CO₂ para HEK/HeLa). Retire cuidadosamente as grades do prato de cultura e fixe-as à pinça mergulhadora. Aplicar 4 μL do meio de cultura misturado com fiduciais (1 x 10⁵ contas/μL para fiduciais de 1 μm) no lado do suporte celular.
4. Mergulhe e congele as células usando um procedimento de congelamento manual ou automatizado. Se possível, apenas borrife a grade do lado oposto às células para evitar danos mecânicos às células (Figura 2A). Em sistemas de imersão automatizados de dois braços, consiga isso colocando uma folha de Politetrafluoretileno (por exemplo, Teflon) em vez de papel manchado na almofada voltada para as células. Transfira as grades para caixas de armazenamento e mantenha-as em nitrogênio líquido (lN₂) até o uso.
   CUIDADO: lN₂ e outros criogênios podem causar danos graves aos olhos e à pele. Use equipamentos de proteção individual (EPIs) e trabalhe apenas em um espaço bem ventilado para evitar o acúmulo de concentrações perigosas de N₂ .
   NOTA: Todas as etapas subsequentes devem ser melhor realizadas na fase líquida de lN₂ para evitar a contaminação das superfícies celulares e lamelas, pois isso pode complicar o processamento a jusante. Reduza o contato com cristais de gelo flutuantes sempre usando nitrogênio líquido limpo (por exemplo, filtro para remover gelo flutuante), eliminando etapas de transferência desnecessárias e, se possível, trabalhando em um ambiente com umidade controlada.
5. Monte e prenda as grades congeladas em AutoGrids com recorte e as células voltadas para cima (Figura 2A) para posterior imagem de criofluorescência e fresagem FIB. Para garantir o alinhamento adequado das amostras no MET, a direção de fresagem precisa ser ortogonal ao eixo de inclinação crio-ET. Assim, coloque as marcas de orientação (por exemplo, gravação a laser ou pontos de marcadores removíveis) em AutoGrids antes do recorte para ajudar nesse alinhamento (Figura 2A).
6. Filtre a qualidade da grade (Figura 2B) no crio-FLM e FIB/SEM. Otimize a densidade celular, o tempo de blotting e a força para obter uma distribuição uniforme de células e contas. Use imagens de luz refletida em um microscópio de criofluorescência ou use o crio-FIB-MEV para certificar-se de que ambas as células e contas fiduciais sejam claramente visíveis (Figura 2B, setas brancas).
7. Se necessário, repita o mergulho com melhores condições, por exemplo, variando a concentração celular e/ou o tempo de mancha. Uma vez que os parâmetros de mergulho adequados tenham sido encontrados, não repita a triagem de grade para cada nova rodada de experimentos.

Figura 2: Peneiramento de grades adequadas usando MEV e IB . (A) Marcas de orientação devem ser colocadas nas AutoGrids perpendiculares à direção de fresagem para simplificar o carregamento correto no MET. As células são montadas viradas para cima no AutoGrid montado. (B) Após o congelamento do mergulho, as grades são inspecionadas no MEV para avaliar e otimizar as condições de imersão: a) Não deve haver muitas células por grade. Para células HeLa, por exemplo, não use mais de 1-4 células/quadrado. Para células menores, como Saccharomyces cerevisiae (mostrado aqui), aglomerados de 4-6 células foram considerados úteis. b) As contas fiduciais (setas brancas) devem estar claramente visíveis, e não deve haver muito tampão ao redor das células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Microscopia de luz criofluorescência

1. Para cada grade, adquira uma visão geral em fluorescência (widefield) e contraste de interferência diferencial (DIC) ou modo refletido e selecione quadrados de grade adequados com sinal de fluorescência. Escolha campos de visão que contenham as células de interesse e um número suficiente de marcadores fiduciais (6-12).
   1. Certifique-se de que as células e contas estejam uniformemente distribuídas, não muito densas e em direção ao centro de cada quadrado. Escolha apenas quadrados acessíveis tanto ao instrumento FIB-MEV quanto ao MET, portanto, aqueles a pelo menos três quadrados de distância da borda da grade em 200 grades de malha (Figura 3A, dentro do círculo vermelho).
2. Em cada um dos quadrados de grade selecionados, adquira uma pilha fluorescente com um passo de foco apropriado para posterior deconvolução, ou seja, <1/2 do limite de resolução axial. Se possível, use objetivas de abertura numérica alta (NA) para aumentar a contagem de fótons e a precisão de localização.
   1. Em um microscópio confocal com objetiva NA 0,9, adquira pilhas com tamanho de passo de 300 nm, superamostrando o valor de Nyquist. Registre várias pilhas de cores, se necessário (Figura 2B). Armazene grades em lN₂ até nova utilização.
      NOTA: Para determinar o tamanho ideal do passo, escolha os valores calculados pelo software de controle do microscópio ou use ferramentas on-line⁹. Verifique se há sangria de sinal entre canais, uma vez que a sangria excessiva é prejudicial para experimentos de colocalização. No entanto, alguns podem ser vantajosos para corrigir aberrações cromáticas em pilhas multicoloridas.
3. Desconvolva pilhas usando o software apropriado^10,11 e fatie⁷ delas novamente se for necessário um tamanho de pixel isotrópico. A deconvolução — assim como à temperatura ambiente — limpa o sinal FLM e pode melhorar a precisão da localização (Figura 3C).

Figura 3: Seleção de quadrados para aquisição de pilha FLM e melhoria dos dados por deconvolução. (A) Visão geral de uma grade mergulhada com células de levedura expressando eGFP-Ede1 (verde) e mCherry-Atg8 (magenta). Escolha posições com uma boa distribuição de contas e células, mas evite as bordas da grade (vermelho sombreado). As caixas indicam posições com boas distribuições celulares onde as pilhas de fluorescência foram tomadas. (B) Projeção de intensidade máxima (MIP) da pilha multicolorida tomada no quadrado de caixa amarela (de A) após a deconvolução. A deconvolução das pilhas FLM limpa significativamente os sinais de fundo indesejados e ajuda a localizar contas em z com mais precisão, como aparente de ajustes gaussianos antes (C) e depois da deconvolução (D) (ajustes foram realizados em 3DCT e são mostrados para o talão marcado com 1). As imagens mostram visualizações MIP ampliadas do canal vermelho (excitação: 552 nm, emissão: 585-650 nm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Fresagem por feixe de íons focalizado

1. Coloque as grades no instrumento crio-FIB-MEV e use as marcas de recorte e/ou orientação para garantir a orientação adequada para posterior colocação no ETM (Figura 2A). Certifique-se de que a direção da fresagem seja perpendicular ao eixo de inclinação do MET.
2. Use um sistema de injeção de gás (GIS; CpMePtMe₃) nas posições de estágio pré-definidas pelo setup FIB-MEV para revestir as grades com uma camada organometálica protetora. Não aplique muito, pois isso pode interferir na localização do cordão fiducial no ETM posteriormente. Use um revestidor a plasma para aplicar platina metálica para reduzir o carregamento da amostra.
   NOTA: Se nenhuma configuração para revestimento GIS estiver disponível, elas podem ser facilmente encontradas realizando rodadas sucessivas de revestimento curto (~2 s), seguidas de fresagem FIB. Certifique-se de que a amostra ainda possa ser cortada com sucesso em correntes médias (~100 pA) sem fringing aparente da camada organometálica protetora ao redor das bordas da lamela. Tanto o tempo quanto a distância da agulha SIG (em relação à amostra) são parâmetros importantes a serem considerados. Não opere a agulha GIS em condições de temperatura ambiente (ou seja, 45 °C), mas o mais frio possível para ainda fornecer um revestimento uniforme (25-27 °C).
3. Registre uma visão geral da grade SEM e execute uma correlação 2D com visões gerais do FLM para localizar os quadrados de grade para os quais as pilhas fluorescentes foram registradas. Inspecione manualmente ambas as visualizações ou use vários pacotes de software 7,10,12 para encontrar os quadrados da grade. Aqui, o foco está na caixa de ferramentas de correlação 3D (3DCT)⁷, que usa transformação de corpo rígido 3D com escala isotrópica entre as visualizações. Um excelente passo a passo sobre as funções do 3DCTs está disponível on-line¹³.
   1. Selecione e marque pelo menos quatro posições correspondentes, por exemplo, pontos de referência, como barras de grade ou furos na película de suporte, na visão geral da grade FLM e SEM (clique com o botão direito do mouse) e calcule a transformação entre os pontos marcados (correlacionar).
   2. Em seguida, coloque os marcadores no centro dos quadrados de grade correspondentes para os quais as pilhas FLM foram adquiridas e preveja sua posição na visualização MEV (correlacionar; Figura 4A).
4. Para cada quadrado de grade correlacionado, pegue uma imagem de feixe de íons (IB) de baixa corrente (≤10 pA) no ângulo de fresagem FIB de escolha (10°-25° para o ônibus pré-inclinação de 45°). Selecione um campo de visão (ou seja, posição e ampliação) que corresponda aos dados de fluorescência. Para 200 malhas, adquira dados de fluorescência e FIB/SEM para conter quadrados de grade simples, incluindo as barras de grade (veja a Figura 3A e a Figura 4A).
   NOTA: A fresagem deve ser realizada em um ângulo tão raso quanto possível para evitar a perda de alcance angular significativo durante o crio-ET e para permitir a identificação de um número suficiente de contas fiduciais. Por exemplo: com uma inclinação do estágio de 17°, uma pré-inclinação do vaivém de 45° e uma inclinação do feixe FIB de 52° em relação à queda, a pré-inclinação da lamela é de 10°, que praticamente atende à faixa angular preferida de ±60° no TEM inclinando de -50° a +70°, o máximo de muitos crio-suportes TEM.
5. Pegue uma imagem de MEV do mesmo quadrado para ajudar na identificação de contas correspondentes na visão de fluorescência e feixe de íons.
6. Execute o registro da pilha FLM 3D desconvolvida e da visualização do feixe de íons 2D para cada posição com o 3DCT, conforme descrito nas etapas a seguir (Figura 4B).
   1. Carregue a pilha FLM 3D fatiada correspondente e a visualização do feixe de íons (IB) em 3DCT.
      NOTA: Os dados de fluorescência multicor podem ser carregados como até três arquivos de pilha de canal único separados.
   2. Selecione 4 esferas fiduciais nos dados de fluorescência e clique com o botão direito do mouse na lista de posições para determinar sua posição 3D por meio do ajuste gaussiano do sinal em x, y e z. Selecione as contas correspondentes na imagem IB e execute uma correlação 3D inicial (correlacionada).
   3. Iteratively adicionar mais contas na imagem de fluorescência, refinar sua posição 3D e prever sua posição na visualização IB para adicionar rapidamente mais contas ao registro e verificar a precisão da correlação. No TDC3, valores de erro raiz quadrática da média (RMSE) são fornecidos para avaliar a consistência da correlação⁷.
      1. Verifique se os valores RMSE são pequenos e na ordem da precisão de localização (~300 nm). Para determinar a precisão da correlação, deixe de fora algumas esferas fiduciais claramente identificáveis tanto na fluorescência quanto no feixe de íons deliberadamente durante a etapa de registro. Faça isso verificando sua localização prevista versus real na imagem do feixe de íons. Se a posição prevista diferir significativamente da real, repita a correlação inicial com um novo conjunto de fiduciários.
         NOTA: Correlacionar 6-8 contas provou ser suficiente para o registro preciso das pilhas FLM e das visualizações IB. No entanto, adicionar mais fiduciais (até 12-15) em uma ampla faixa de valores z (por exemplo, selecionando contas na barra de grade ou em quadrados vizinhos) pode melhorar a precisão da correlação.
   4. Selecione os sinais celulares de destino, ajuste sua posição 3D na pilha FLM e aplique a transformação para prever as posições de destino na visualização IB (Figura 4B).
      NOTA: Qualquer entrada na lista de posições FLM, que não tenha uma contrapartida na lista IB, será tratada como um sinal a ser previsto.
7. Para cada quadrado correlacionado, transfira as posições previstas das características de interesse para o instrumento FIB-MEV e coloque padrões de fresagem de lamelas (Figura 4C). Transfira posições manualmente (por exemplo, medindo a distância a pontos de referência visíveis, como células ou contas fiduciais) ou use automação e scripting como implementado, por exemplo, no SerialFIB¹⁴. Se houver vários sinais por célula, coloque os padrões para incluir o maior número possível de pontos de interesse (POIs) na mesma lamela para aumentar a taxa de transferência.
8. Primeiro moer as lamelas ásperas e depois finas até uma espessura final de 150-250 nm. Evite etapas (por exemplo, cortes de alívio de tensão¹⁵) que causem flacidez da lamela e, assim, resultem em movimento da característica real de interesse em relação às pilhas FLM adquiridas anteriormente. Utilize procedimentos de fresagem manual³ ou automatizado^14,16,17,18 FIB. Com qualquer um dos métodos, certifique-se de que a característica de interesse permaneça no centro da lamela, afinando-a simetricamente de cima e de baixo.
9. Para avaliar a exatidão da moagem para cada lamela, realizar o mesmo registro da etapa 3.4. No entanto, desta vez, use a imagem IB final após a fresagem FIB e verifique se as posições previstas das características de interesse estão contidas na lamela final. Alternativamente, sobreponha as projeções rotacionadas das pilhas FLM, obtidas a partir da saída do 3DCT e scripts personalizados¹⁹, com a imagem IB final (Figura 4C, inserção pequena).

Figura 4: Procedimento de fresagem FIB correlativo 3D . (A) A correlação 2D-2D das visões gerais FLM (esquerda) e MEV (direita) da grade é usada para localizar os quadrados da grade nos quais as pilhas fluorescentes foram tomadas anteriormente. (B) Para cada quadrado selecionado, após o registro 3D-2D das posições fiduciais correspondentes em 3DCT (caixas coloridas), as posições das características biológicas de interesse são selecionadas nos dados FLM. Com base na predição das posições correspondentes na imagem do feixe de íons (círculos vermelhos), os locais para a preparação das lamelas são selecionados. (C) Imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV) e feixe de íons (IB) são usadas para manter o alvo centrado durante a fresagem. Espessuras finais de 150-250 nm foram consideradas adequadas para posterior processamento a jusante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. ETM correlativo

1. Coloque as grades no MET, certificando-se de que a orientação da lamela (como aparente a partir de marcas de recorte ou orientação) seja perpendicular ao eixo de inclinação.
   NOTA: Microscópios de diferentes fabricantes podem ser controlados usando vários softwares, por exemplo, Tomo5, TOM ou SerialEM²⁰. Aqui, o foco está no último.
2. Adquira montagem de grade e visões gerais para cada quadrado de grade contendo lamelas. Certifique-se de que o tempo de ampliação e exposição seja adequado para visualizar as esferas fiduciais nas imagens de MET sem aumentar significativamente a dose total de elétrons. Adquira mapas TEM de alta resolução (montagens) de cada lamela.
3. Registre e 3D-2D correlacione a pilha FLM com o quadrado da grade TEM e as visões gerais da lamela em 3DCT. Use o mesmo procedimento descrito na etapa 3.6, selecionando as posições correspondentes do talão nas imagens de fluorescência (x, y, z - ajuste gaussiano) e do microscópio eletrônico de transmissão. Em seguida, selecione as posições de interesse nos canais FLM e transfira-as para as visões gerais do TEM. Se necessário, utilizar um procedimento em duas etapas, compreendendo uma primeira correlação entre a MFL e a ETM de baixa magnificação, e a segunda correlação entre a ETM de baixa a alta magnificação (Figura 5).
4. Transfira posições manualmente (medindo distâncias até pontos de referência), as ferramentas de registro e mapa disponíveis no SerialEM²⁰ ou softwares externos, como o CorRelator²¹.
5. Configure e execute séries de inclinação em posições correlacionadas. Use uma ampliação apropriada, desfocagem e dose total (consulte Tabela de Materiais e Tabela 1 para obter detalhes). Iniciar a aquisição na pré-inclinação determinada pela lamela (ver também a nota no passo 3.4) e utilizar um esquema de inclinação dose-simétrica²². Use aquisição manual ou em lote.

Figura 5: Localização das posições correlacionadas no ETM. Após a fresagem FIB correlativa 3D bem-sucedida e transferência para o microscópio eletrônico de transmissão, o registro 3D-2D é realizado para cada quadrado fresado entre contas fiduciais (caixas coloridas) em pilhas FLM e visões gerais de TEM para localizar locais potenciais para crio-ET (círculos vermelhos). Visões gerais de lamelas de maior ampliação (zoom-in) podem então ser adquiridas para configurar tomogramas com mais precisão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

O protocolo fornece um passo a passo do pipeline usado para descobrir o depósito endocítico dependente de proteína endocítica (END) dependente da proteína 1 (Ede1) contendo o domínio EH e sua degradação e aprisionamento em corpos autofágicos⁸. O END é um compartimento líquido-líquido separado por fase em S. cerevisiae, que tampona uma variedade de proteínas envolvidas na endocitose mediada por clatrina (CME) após eventos endocíticos malsucedidos. Um de seus principais componentes é o Ede1, que funciona como componente da EMC e como receptor seletivo de autofagia para a degradação desse novo compartimento de LLPS. Assim, uma fusão EGFP de Ede1 (EGFP-Ede1) sob o controle do promotor da álcool desidrogenase (ADH) foi usada para visualizar ENDs, uma vez que a superexpressão de Ede1 interfere nos estágios iniciais da endocitose e, portanto, induz constitutivamente LLPS.

Em uma grade congelada por imersão com células de levedura superexpressando EGFP-Ede1 e marcadores fiduciais de 1 μm, cinco posições foram selecionadas para aquisição da pilha FLM no canal GFP (Figura 6A; TFS Corrsight; modo confocal, tamanho do passo de foco de 300 nm, faixa de 10 μm). A grade foi transferida para o instrumento FIB (Quanta 3D FEG), e os quadrados de grade para os quais as pilhas FLM foram adquiridas foram identificados realizando uma correlação 2D-2D das visões gerais da fluorescência e da grade de MEV (compare o passo 3.2).

Para cada um dos quadrados escolhidos, imagens de feixe de íons foram obtidas em baixa corrente (10 pA, aumento de 1200x), e as posições fiduciais correspondentes foram registradas em 3DCT. Após a seleção das posições com a característica biológica de interesse e ajuste de sua posição 3D dentro da pilha FLM, a transformação encontrada foi aplicada às posições END putativas, e os locais para preparação da lamela foram selecionados (Figura 6B). Uma viga FIB inclinada de 11° em relação à superfície da grade foi usada nos exemplos mostrados aqui (45° FIB shuttle pré-tilt; 18° stage tilt). As posições de interesse foram transferidas, e os padrões de FIB foram desenhados manualmente (Figura 6D) medindo a distância das posições previstas em relação aos pontos proeminentes na imagem FIB (por exemplo, furos, contaminações por gelo, contas fiduciais). A precisão do registro foi avaliada deixando deliberadamente de fora esferas que pudessem ser claramente identificadas na imagem FLM e IB e, em seguida, comparando suas posições reais e previstas na visão do feixe de íons (por exemplo, diamante na Figura 6B,C). A correlação para o quadrado mostrado na Figura 6C mostrou-se precisa (ou seja, a posição prevista das posições das contas FLM coincidiu perfeitamente com sua localização IB correspondente e os valores RMSE subpixel relatados pelo 3DCT para o registro). Assim, as lamelas foram cortadas nas posições preditas (Sítio B) e moídas finamente até uma espessura de ~200 nm (deslocamento padrão final).

Figura 6: Resultados representativos para direcionamento correlativo 3D de depósitos de proteínas endocíticas (END) em leveduras. (A) Visão geral da rede antes da fresagem. As caixas coloridas indicam quadrados de grade para os quais as pilhas de fluorescência foram tomadas de antemão. (B-C) Correlação 3D em um quadrado de grade. Após o registro de várias esferas fiduciais correspondentes (caixas coloridas) nos dados de FLM (B, mostrado aqui como projeção de intensidade máxima) e na imagem do feixe de íons (C), a precisão do registro 3D foi verificada prevendo a posição do talão indicado com o diamante. Em seguida, as posições do sinal alvo (círculos vermelhos) foram previstas no corte do feixe de íons para dois potenciais locais de fresagem. (D) Zoom do Sítio B mostrando as posições previstas de três pontos alvo (círculos vermelhos) e os padrões iniciais de fresagem (caixas amarelas). Um quarto ponto de fluorescência foi previsto para ser muito mais baixo do que o outro ponto e, portanto, não visado durante a fresagem (círculo cinza). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Após a moagem FIB bem sucedida e a transferência da grade para o microscópio eletrônico de criotransmissão (Titan Krios operado a 300 kV e equipado com um detector de elétrons direto Gatan K2 e filtro de energia Bioquantum), uma visão geral da grade foi registrada no SerialEM e usada para localizar quadrados com lamelas. Para cada lamela, imagens panorâmicas foram adquiridas, e os dados de FLM foram registrados em 3DCT (3D-2D) usando esferas fiduciais correspondentes. As posições das características biológicas de interesse (Figura 7A) foram então previstas usando a transformação calculada a partir das esferas fiduciais. Visões gerais de lamelas registradas em maior ampliação foram costuradas, e locais de interesse correlacionados usando pontos de referência claramente visíveis (por exemplo, contas fiduciais). Alternativamente, visões clássicas do CLEM podem ser produzidas em vários softwares^10,12.

Com base na correlação, foram encontrados quatro sítios potenciais para aquisição do tomograma para a lamela mostrada na Figura 7A. No entanto, isso também inclui uma posição que não foi alvo durante a moagem FIB correlacionada em 3D (compare a Figura 6D; círculo cinza) e uma posição bloqueada por contaminação por gelo (Figura 7; caixas cinzas). Assim, os tomogramas só puderam ser registrados para duas posições (Figura 7B). No geral, obteve-se um sucesso de correlação de ~75%, ou seja, lamelas que sobreviveram à transferência para as estruturas TEM e END nos locais previstos, foi alcançado (12 sítios correlacionados). Após a reconstrução do tomograma, segmentação e correspondência de moldes, estruturas END individuais podem ser visualizadas dentro de seu contexto nativo (Figura 7C,D). Isso inclui o retículo endoplasmático (RE) fenestracionado ao redor da END, gotículas lipídicas ocasionalmente fazendo contato e ribossomos, que são excluídos do compartimento LLPS. Em conjunto, isso mostra como a moagem de FIB correlativo 3D pode fornecer informações em nível molecular de processos biológicos raros de células intactas.

Figura 7: Resultados representativos para visualização da END com crio-TE. (A) A visão geral do ETM de baixa magnificação do local de moagem mostrada na Figura 6 pode ser prontamente correlacionada com a projeção de intensidade máxima da FLM (Figura 6B) para localizar características biológicas de interesse (cruzes vermelhas). (B) Em uma segunda etapa, pode-se correlacionar uma visão de maior ampliação (costurada) e configurar posições para aquisição do tomograma (caixas amarelas). Os locais resultantes do sinal fora do plano (caixa cinza, compare a Figura 6D) foram ignorados. (C-D) Usando esta abordagem FIB correlativa 3D, o depósito de proteína endocítica (END) pode ser visualizado em seu ambiente nativo. Estruturas como retículo endoplasmático (RE), ribossomos, membranas e gotículas lipídicas podem ser identificadas e visualizadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Configurações do Plasma Cleaner
Harrick Plasma Cleaner PDG-3XG :	Seleção de radiofrequência: "HI", 30 s; Plasma N2
Configurações do êmbolo
TFS Vitrobot Mk IV:	100% de umidade; força de mancha = 8; blottime = 10 s; tempo de espera 0 s; (isso deve funcionar para a maioria das células de suspensão e aderentes)
Posições e Timings SIG FIB
Quanta 3D FEG:	Inclinação = 0, Rotação = -180, Posição Z = 13,5, Setpoint de temperatura = 26,15° , Tempo = 8 s
TFS Scios:	Inclinação = 0, Rotação = -180, Posição Z = 9,8, Setpoint de temperatura = 28° C, Tempo = 7 s
TFS Aquilos 1:	Posição pré-definida pelo software, Setpoint de temperatura = 28°, Tempo = 7 s
TFS Aquilos 2:	Posição pré-definida pelo software, Setpoint de temperatura = 28°, Tempo = 7 s
FIB Sputter Coater Configurações
Sistema de quorum:	Na câmara de preparação do quorum: 10 mA, 40 s
TFS Scios:	10 W, 500 V, 250 mA, 0,2 mbar, 15 s
TFS Aquilos 1:	1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s
TFS Aquilos 2:	1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s
Aquisição da Tomogram
Titã Krios Gi2	Câmera K2, filtro de energia Gatan Bioquantum
	20 eV de fenda; esquema de inclinação simétrica da dose (Hagen) com passos de 2°; Comece em +10° (pré-inclinação da lamela!) até +70° e -50°
Titã Krios Gi4	Falcão 4; Filtro de energia Selectris X
	10 eV de fenda; esquema de inclinação simétrica da dose (Hagen) com passos de 2°; Comece em +10° (pré-inclinação da lamela!) até +70° e -50°
Aquisição da FLM
Corrsight (Modo Confocal)	Objetivo: Zeiss EC Plan-Neofluar 40×/0,9 NA Pol; Parâmetros de aquisição da pilha: tamanho do pixel x-y = 161,25 nm, tamanho do passo z = 300 nm.
Leica SP8 Crio-Confocal	Objetivo: Leica HCX PL APO 50x / 0,90 CLEM; Parâmetros de aquisição da pilha: tamanho do pixel x-y = 84 nm, tamanho do passo z = 300 nm.

Tabela 1: Lista de equipamentos testados e configurações sugeridas.

Discussão

1. Etapas críticas do protocolo

A otimização da cultura de células e dos parâmetros de imersão da grade é fundamental para esse fluxo de trabalho. No início de um projeto, vale a pena investir tempo para otimizar as estratégias de marcação, a distribuição de células e contas fiduciais e testar diferentes parâmetros de preparação de grade e blotting. Trabalhar com uma amostra congelada por imersão ideal facilitará significativamente o processamento a jusante.

Como para qualquer experimento de MET, amostras vítreas são necessárias. Para células de mamíferos de grande porte, como HeLa, 1-2 células por quadrado de grade são preferíveis, mas as células ainda podem ser vítreas em maior densidade. Opcionalmente, a vitrificação pode ser melhorada em células de mamíferos (por exemplo, HEK293, HeLa) incubando-as com glicerol a 2,5-10% (v/v) adicionado ao meio de cultura 10 minutos antes de mergulhar²³. Se disponível, a padronização em grade pode ser usada para garantir o perfeito posicionamento e distribuição das células, melhorando assim a vitrificação e posterior correlação²⁴.

Embora células específicas possam ser selecionadas durante o fluxo de trabalho, poucas células que mostram a característica biológica de interesse reduzirão significativamente a taxa de transferência geral. Para melhorar a correlação em células positivas para POI, fluoróforos suficientemente brilhantes devem ser usados. Isto é especialmente importante a níveis de expressão endógena. Descobrimos que, sob condições criocômicas, o mVenus frequentemente teve um desempenho melhor do que o EGFP devido ao seu maior brilho²⁵ e ao deslocamento hipsocrômico, que o mantém adequado para configurações de filtro GFP padrão sob condições criocômicas²⁶. Para estruturas alvo não pontuais, o trade-off entre comprimento de onda e precisão de localização (limite de difração de Abbe) também deve ser considerado.

A correlação 3D eficiente também requer que as grades sejam mecanicamente estáveis e sejam manuseadas com muito cuidado. Enquanto grades padrão de ouro ou cobre com suporte de carbono podem ser usadas, a taxa de sucesso pode ser significativamente aumentada usando filmes SiO₂ mais rígidos, dependendo do projeto. No entanto, ainda não foi conclusivamente determinado se (a) estabilidade mecânica ou (b) coeficientes de expansão térmica compatíveis (substrato vs. filme) para reduzir o crioenrugamento²⁷, é o fator mais crucial para o sucesso da correlação 3D. Além disso, para pegar grades de Au frágeis, podem ser usados pratos revestidos de polidimetilsiloxano⁵.

Além de garantir a estabilidade da amostra, uma escolha cuidadosa dos parâmetros de imagem FLM é necessária para obter pilhas de fluorescência de alta qualidade que sejam adequadas para o direcionamento ideal durante a fresagem FIB. A este respeito, o teste de diferentes técnicas de denoização²⁸ ou deconvolução nos dados FLM também é aconselhado, pois pode melhorar consideravelmente a localização de fiduciais e sinais celulares. Ao correlacionar o sinal de fluorescência com imagens FIB-MEV, uma boa amostragem de esferas fiduciais é importante. Eles devem estar bem distribuídos ao redor das células e, possivelmente, em diferentes alturas z. Também é uma boa prática validar a consistência da correlação, verificando as posições previstas versus reais de contas que foram deliberadamente deixadas de fora do modelo fiducial, mas podem ser claramente correlacionadas a olho nu. Os valores RMSE da 3DCT também devem ser sempre considerados para verificar a consistência do registro.

Como a deposição de material moído e água residual da câmara de MEV-FIB (isto é, recontaminação) aumenta a espessura efetiva da lamela pela adição de material amorfo a ambos os lados dela, manter lamelas moídas finas no microscópio por um tempo prolongado geralmente reduz a qualidade dos dados de MET devido a eventos adicionais de espalhamento de elétrons. Assim, a fresagem é mais frequentemente realizada em duas etapas: primeiro, todas as posições são fresadas aproximadamente (ou seja, para cerca de 800 nm), e depois finamente (para ~150-250 nm), e a grade é imediatamente descarregada após a última lamela ter sido concluída. Um melhor sucesso de correlação pode, no entanto, ser alcançado processando as posições de interesse de maneira local, realizando assim a fresagem áspera e fina na mesma lamela diretamente após a outra, uma vez que isso não deixa tempo para flexão ou deformação. Isso, no entanto, reduz o número máximo de lamelas que podem ser produzidas por rede, dependendo da taxa de recontaminação do sistema. Para uma taxa de 20 nm/h, 4-6 lamelas são produzidas dentro de 1-1,5 h.

O movimento de toda a grade ou das lamelas rugosas >300 nm resultará em correlação fraca ou malsucedida (veja também as limitações discutidas abaixo). Portanto, deve ser verificado regularmente, por exemplo, comparando imagens IB antes, durante e após a fresagem FIB. Sítios que apresentem movimentação significativa (>300 nm) devem ser descartados. Otimize a preparação da amostra (ou seja, escolha do tipo de grade, densidade celular e parâmetros de imersão; ver protocolo seção 1) e estratégia de fresagem para evitar esses movimentos. A flexão da lamela pode ser significativamente reduzida pela fresagem local, conforme descrito na etapa 3.6, e pela redução da largura da lamela. Como mencionado anteriormente, embora os cortes de alívio de tensão¹⁵ tenham sido projetados para reduzir a flexão da lamela, eles geralmente resultam em um movimento concertado da lamela desacoplada, impedindo assim efetivamente a correlação. Sistemas FLM integrados podem ser usados para resolver esse problema.

2. Modificações e resolução de problemas do método

É altamente recomendável realizar uma caracterização completa da amostra em imagens de células vivas antes de ir para criocondições. Otimizar as amostras celulares, esquemas de tratamento e saber que tipo de sinal esperar antes de entrar no criofluxo de trabalho pode melhorar substancialmente sua taxa de sucesso.

No fluxo de trabalho aqui apresentado, um microscópio de fluorescência autônomo com um estágio criogênico é usado para obter imagens das amostras, seguido por uma transferência das grades para o microscópio de feixe de íons focalizado. Entretanto, tem sido testado em sistemas em que um microscópio de fluorescência é integrado à câmara de MEV-FIB e, portanto, não é necessária transferência de amostra para a aquisição de imagens de fluorescência 29,30,31. Usando tais sistemas integrados, as posições de interesse podem ser fotografadas durante e após a fresagem FIB para verificar a presença do sinal de fluorescência alvo sem aumentar o risco de contaminação das lamelas finais. No entanto, é importante ter em mente os parâmetros ópticos dos microscópios utilizados, pois, por exemplo, uma objetiva de NA baixa limitará a precisão com que esferas fiduciais e sinais alvo podem ser localizados. No entanto, as configurações FLM integradas ajudarão a lidar melhor também com pequenas deformações de grades e lamelas, já que as pilhas FLM podem ser continuamente atualizadas e comparadas com visualizações SEM e IB atualizadas.

Como alternativa à imagem de fluorescência da lamela entre a fresagem de FIB e a aquisição de dados de MET, a correlação pós-MET pode ser usada para verificar o correto posicionamento e moagem das lamelas ^5,6.

Durante todas as etapas do fluxo de trabalho correlativo, mas especialmente durante o MET, recomenda-se criar uma sobreposição dos dados de fluorescência projetados nas imagens de MEV/FIB. Essas visões clássicas do CLEM ajudam a entender de forma mais intuitiva qual parte das células está contida dentro das lamelas. Isso também serve como uma verificação de sanidade útil para verificar a precisão da correlação.

3. Limitações do método

A abordagem FIB correlativa 3D requer amostras que podem ser fornecidas com esferas fiduciais. Assim, este método é atualmente restrito a grades congeladas por imersão. Para amostras congeladas (tecido) de alta pressão (HPF), atualmente, apenas correlações 2D-2D podem ser realizadas. Potencialmente, marcadores fiduciais internos (por exemplo, organelas, gotículas lipídicas coradas) poderiam ser uma solução para esse problema^32,33. A taxa de sucesso da correlação final depende de muitos fatores, incluindo a qualidade da amostra, a configuração da microscopia de fluorescência, a espessura da lamela e o tamanho da estrutura alvo. Estima-se que a precisão de correlação usando a abordagem de registro 3D descrita esteja na faixa de 200-300 nm na imagem IB final, correspondendo aproximadamente à espessura típica das lamelas fresadas com FIB⁷. Assim, estruturas celulares muito menores do que isso serão difíceis de atingir no momento. Além disso, o movimento excessivo no local de fresagem (>300 nm) também reduz a precisão da correlação, um problema que pode ser potencialmente resolvido com configurações FLM integradas em instrumentos FIB/MEV. Lamelas que apresentem forte deformação ou flexão durante a fresagem devem, em qualquer caso, ser excluídas do fluxo de trabalho a jusante.

Em geral, a criofluorescência é atualmente limitada pelo critério de difração de Abbe. Com a aplicação mais rotineira (e comercialização) de métodos crio-FLM super-resolvidos, o direcionamento mais preciso de estruturas celulares pode se tornar possível, especialmente quando integrado ao FIB/MEV para operação em tempo real.

4. Importância do método

Especialmente em comparação com técnicas não direcionadas e pós-correlação, a abordagem de fresagem FIB correlacionada em 3D permite a seleção de posições adequadas antes da etapa de ETM que consome tempo e recursos. Com isso, possibilita uma coleta de dados e um planejamento de projetos mais eficientes. Além disso, os dados de fluorescência correlacionados adicionam uma camada de informação que pode ser crucial para interpretar os tomogramas e integrar os resultados do crio-ET em projetos multiescala, especialmente quando se trata de conjuntos de proteínas não estruturadas ou muito pequenas para correspondência de modelos e média de subtomograma.

5. Importância e potenciais aplicações futuras

Em combinação com fluxos de trabalho avançados, como crio-lift de amostras de HPF 34,35, crio-FIB-SEM volume 36 e imagem de fluorescência de super-resolução^26,37,38,39, a preparação de lamela direcionada em ^3D oferece a perspectiva de não apenas dissecar processos biológicos em células isoladas^, mas também tornar amostras de tecidos e pacientes acessíveis à fresagem de FIB e à tomografia crio-eletrônica. Como tal, permitirá a dissecção de processos patológicos em alta resolução e, portanto, será um bloco de construção integral para uma biópsia na nanoescala.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Autogrids	Thermo Fisher Scientific / Homemade	1036173 (sem recorte), 1205101 (com recorte)
C-rings	Thermo Fisher Scientific	1036171
Corrsight com módulo criogênico	Thermo Fisher Scientific		FLM Alternative 1
Dynabeads MyOne COOH	Thermo Fisher Scientific	65011	recomendado 1 µ m grânulos fiduciais
EM Grids R1/4 SiO2	Quantifoil	N1-S13nAu20-01
Falcon 4 câmera c. filtro de energia pós-coluna Selectris X	Thermo Fisher Scientific		Camera/Filter Alternative 1
FIB Aquilos 1	Thermo Fisher Scientific		FIB Alternative 1
FIB Aquilos 2	Thermo Fisher Scientific		FIB Alternative 2
FIB Quanta 3D FEG	Thermo Fisher Scientific		FIB Alternative 3
FIB Scios	Thermo Fisher Scientific		FIB Alternative 4
K2 câmera de cúpula com filtro de energia pós-coluna 968 Quantum K2	Gatan		Camera/Filter Alternative 2
Leica TCS SP8 com módulo criogênico	Thermo Fisher Scientific		FLM Alternative 2
Plasma Cleaner PDC-3XG
(0,25 mm)	plastx24.de	11645	Corte nas mesmas dimensões do papel de filtro
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2	Thermo Fisher Scientific		TEM Alternative 1
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4	Thermo Fisher Scientific		TEM Alternative 2
THUNDER Imager  EM Cryo CLEM	Thermo Fisher Scientific		FLM Alternative 3
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific		alternativamente, use êmbolo manaual
Papel de filtro Whatman	Sigma Aldrich	10311807	55 mm de diâmetro; precisa ser cortado para caber no Vitrobot