Síntese e Caracterização de nanopartículas poli-carregadas de mRNA (Beta Aminoesters) para fins de vacinação

Resumo

Aqui, um protocolo simples é apresentado para a produção de nanopartículas mRNA baseadas em polímeros poli (beta aminoester), fáceis de serem adaptados alterando o mRNA encapsulado. O fluxo de trabalho para sintetizar os polímeros, as nanopartículas e sua caracterização essencial in vitro também são descritos. Também é acrescentada uma prova de conceito em relação à imunização.

Resumo

A vacinação tem sido um dos maiores sucessos da sociedade moderna e é indispensável no controle e prevenção de doenças. As vacinas tradicionais eram compostas de inteira ou frações do agente infeccioso. No entanto, os desafios permanecem, e novas tecnologias de vacinação são obrigatórias. Nesse contexto, o uso do mRNA para fins de imunização mostrou um desempenho aprimorado, como demonstrado pela aprovação rápida de duas vacinas de mRNA que previnem a infecção pelo SARS-CoV-2. Além do sucesso na prevenção de infecções virais, as vacinas mRNA também podem ser usadas para aplicações terapêuticas de câncer.

No entanto, a instabilidade do mRNA e sua rápida liberação do corpo devido à presença de núcleos torna sua entrega nua não possível. Neste contexto, as nanomedicinas, e especificamente as nanopartículas poliméricas, são sistemas críticos de entrega de mRNA. Assim, o objetivo deste artigo é descrever o protocolo de formulação e teste de um candidato à vacina mRNA com base nas nanopartículas poliméricas proprietárias. A síntese e caracterização química dos polímeros poli(beta aminoesters) utilizados, sua complexidade com mRNA para formar nanopartículas, e sua metodologia de liofilização serão discutidas aqui. Este é um passo crucial para diminuir os custos de armazenamento e distribuição. Finalmente, serão indicados os testes necessários para demonstrar sua capacidade de transfetál de in vitro e células dendríticas de modelo maduros. Este protocolo beneficiará a comunidade científica que trabalha na vacinação devido à sua alta versatilidade que permite que essas vacinas previnem ou curem uma grande variedade de doenças.

Introdução

As doenças infecciosas têm representado uma grave ameaça a milhões de seres humanos em todo o mundo e ainda são uma das principais causas de morte em alguns países em desenvolvimento. A vacinação profilática tem sido uma das intervenções mais eficazes da sociedade moderna para prevenir e controlar doenças infecciosas^1,2. Esses marcos críticos da ciênciana relevância do século 20 foram observados pela recente pandemia covid-19 mundial causada pelo vírus SARS-CoV-2³. Reconhecendo a importância de ter vacinas eficientes para reduzir a disseminação da doença, os esforços cooperativos de todas as comunidades biomédicas resultaram com sucesso em muitas vacinas profiláticas no mercado em menos de um ano⁴.

Tradicionalmente, as vacinas eram compostas de vírus atenuados (virulência viva, reduzida) ou inativados (partículas de morte). No entanto, para algumas doenças sem margem para erros de segurança, partículas virais não são possíveis, e subunidades proteicas são usadas em vez disso. No entanto, as subunidades geralmente não permitem a combinação de mais de um epítope/antígeno, e os adjuvantes são necessários para aumentar a potência vacinal^5,6. Portanto, a necessidade de novos tipos de vacinas é clara.

Como demonstrado durante a pandemia atual, novos candidatos à vacina com base em ácidos nucleicos podem ser vantajosos em termos de evitar processos longos de desenvolvimento e fornecer alta versatilidade ao produzir, ao mesmo tempo, uma imunização vital do paciente. É o caso das vacinas mRNA, que foram inicialmente projetadas como vacinas experimentais contra o câncer. Graças à sua capacidade natural de produzir respostas de células T específicas de antígeno^3,5,6,7. Sendo mRNA a molécula que codifica a proteína antigênica, apenas mudando a mesma, a vacina pode ser rapidamente adaptada para imunizar outras variantes do mesmo microrganismo, cepas diferentes, outros microrganismos infecciosos, ou até mesmo se tornar um tratamento imunoterapêutico de câncer. Além disso, são vantajosos em termos de custos de produção em larga escala. No entanto, o mRNA tem um obstáculo significativo que dificulta sua administração nua: sua estabilidade e integridade estão comprometidas na mídia fisiológica, cheia de núcleos. Por essa razão, é necessário o uso de um portador nanométrico que o proteja e vetorize o mRNA para as células que apresentem antígeno^2,8.

Neste contexto, os poli(aminoesters beta) (pBAE) são uma classe de polímeros biocompatíveis e biodegradáveis que demonstraram uma notável capacidade de complexo mRNA em partículas nanométricas, graças às suas cargas cationicas^9,10,11. Estes polímeros são compostos de laços éster, o que facilita sua degradação por esterases em condições fisiológicas. Entre os candidatos à biblioteca do PBAE, aqueles funcionalizados com oligopeptídeos cáticos finais apresentaram maior capacidade de formar pequenas nanopartículas para penetrar eficientemente as células através da endocitose e transfectar o material genético encapsulado. Além disso, graças à sua capacidade de tampão, a acidificação do compartimento endosomo permite a fuga endossomal^12,13. Ou seja, um tipo específico de pBAE, incluindo moieties hidrofóbicos em sua espinha dorsal (o chamado C6 pBAE) para aumentar sua estabilidade e combinação de oligopeptídeo final (60% de polímero modificado com uma tri-lysina e 40% do polímero com uma tri-histidina) que transfecta seletivamente células que apresentam antígenos após administração parenteral e produzem a apresentação de antígeno de encode mRNA seguido de imunização de camundongos foi publicado recentemente¹⁴ . Além disso, também foi demonstrado que essas formulações poderiam contornar uma das principais etapas de gargalo das formulações de nanomedicina: a possibilidade de congelá-las sem perder sua funcionalidade, o que permite a estabilidade a longo prazo em ambientes secos suaves¹⁵.

Nesse contexto, o objetivo do protocolo atual é disponibilizar o procedimento para a formação das nanopartículas de mRNA à comunidade científica, dando uma descrição das etapas críticas do protocolo e possibilitando a produção de vacinas eficientes para aplicações de prevenção de doenças infecciosas e tratamento de tumores.

O protocolo a seguir descreve o exercício completo para sintetizar poli (aminoestores beta) modificados por oligopeptídeos - polímeros OM-pBAE que serão usados ainda para síntese de nanopartículas. No protocolo, a formulação de nanopartículas também está incluída. Além disso, etapas críticas para o sucesso do procedimento e resultados representativos também são fornecidas para garantir que as formulações resultantes realizem os recursos de caracterização de controle de qualidade necessários para definir um resultado positivo ou negativo. Este protocolo é resumido na Figura 1.

Protocolo

1. Síntese de polímero pBAE com oligopeptídeos finais (OM-pBAE)

1. Polimerização de C6-pBAE
   1. Adicionar 5-amino-1-pentanol (38 mmol; MW = 103,16 Da) 1-hexilamina (38 mmol; MW = 101,19 Da) em frasco de vidro de fundo redondo (100 mL). Em seguida, adicione 1,4-butanediol diacrilato (82 mmol; MW = 198,22 Da).
   2. Pré-aqueça o banho de óleo de silicone a 90 °C, coloque o frasco de fundo redondo no banho de óleo e mexa a mistura com o auxílio de uma barra de agitação magnética durante a noite (~18 h). Em seguida, retire o produto do frasco de fundo redondo e coloque-o no congelador a -20 °C.
      NOTA: O produto é na forma de um pó pegajoso e é retirado do frasco com a ajuda de uma espátula. É essencial validar a estrutura do polímero obtido através de ¹H-NMR. Os espectros NMR foram registrados em um instrumento de 400 MHz (ver Tabela de Materiais) utilizando clorofórmio-d e D₂O como solventes. Cerca de 10 mg de cada poli (β-amino ester) foram tomados e dissolvidos em 1 mL do solvente deuterado.
2. Reação com peptídeos para obter OM-pBAE
   1. Adicione 25 mL de 0,1 M HCl aos peptídeos selecionados, por exemplo, peptídeo Cys-His-His-His com ácido trifluoroacético (TFA, 200 mgs), em um tubo de centrífuga de 50 mL anteriormente pesado que pode suportar a secagem congelante e mexer manualmente durante a noite para obter uma solução clara.
   2. Congele a solução a -80 °C por 1 h e seque o cloridrato de peptídeo resultante.
      NOTA: Verifique se o peso final corresponde ao valor teórico.
   3. Faça uma solução de C6-pBAE (0,031 mmol) em sulfóxido de dimetil. Além disso, faça uma solução do cloridrato de peptídeo (0,078 mmol) em sulfóxido de dimetil.
   4. Misture as duas soluções em um tubo de tampa de parafuso e aparafusar a tampa. Mexa a solução da mistura em um banho de água com uma temperatura controlada de 25 °C por 20 h com uma barra de agitação magnética.
   5. Adicione a mistura a 7:3 (v/v) ether/acetona. Centrifugar a suspensão resultante a 25.000 x g a 4 °C para remover o solvente. Em seguida, lave o sólido com 7:3 (v/v) éter/acetona diethyl/acetona duas vezes. Em seguida, seque o produto sob um vácuo (<0,2 atm).
   6. Faça uma solução de 100 mg/mL do produto em sulfóxido de dimetila. O produto resultante é chamado C6-peptídeo-pBAE. É essencial validar a estrutura do polímero obtido através de ¹H-NMR para confirmar o desaparecimento dos sinais olefinas associados aos acrilatos terminais. Se não for usado, o polímero pode ser congelado a -20 °C.

2. Formação de poliplexes

NOTA: Todos os procedimentos devem ser realizados dentro de uma sala condicionada para manter uma temperatura constante.

1. Descongele os polímeros C6-peptídeo-pBAE e o vórtice da solução.
2. Pipeta o polímero misturar para cima e para baixo e preparar uma solução de 12,5 mM (V₁) em acetato de sódio (NaAc). Em seguida, vórtice da mistura e esperar por 10 min.
3. Prepare o mRNA a 0,5 mg/mL e misture por pipetação (V₂).
   NOTA: É crucial evitar o vórtice do mRNA.
4. Vórtice a mistura de polímero na concentração final para obter uma solução homogênea entre o estoque de polímero em DMSO e o tampão de acetato.
   NOTA: A concentração final do polímero depende da razão N/P (nitrogênio para grupos fosfato) selecionada. A razão N/P depende de cada mRNA específico a ser utilizado. Para encapsulamento eGFP, por exemplo, foi utilizada uma razão de 25:1, conforme relatado anteriormente¹⁴.
5. Misture a solução de material genético e a solução C6-peptidepBAE (25x da concentração de mRNA) em uma razão de 1:1 (V_i = V₁ + V₂).
   NOTA: C6-peptídeo-pBAE é carregado em um tubo de microcentrifuuge onde o mRNA é adicionado por pipetação para cima e para baixo para mistura. Uma vez preparado, as concentrações de poliplex, ácido nucleico e C6-peptídeo-pBAE são meio diluídas.
6. Incubar a 25 °C por 30 min em um termbloco. Precipitar com 1:2 RNase água livre adicionando a amostra a um tubo de microcentrifus de microcentruagem pré-carregado com água.
7. Inclua os excipientes. Adicione o mesmo volume que a mistura de mRNA e pBAE (V_i) em HEPES 20 mM e sacarose 4% por pipetação para cima e para baixo. Neste ponto, a amostra foi diluída 3x.

3. Lyofilização de poliplexes

1. Instantaneamente, congele a -80 °C congelador da solução poliplex anterior por 1 h.
2. Realizar a secagem primária seguindo as etapas: (1) 1 h a -60 °C e 0,001 hPa; (2) 1h a -40 °C e 0,0001 hPa; (3) 4h a -20 °C e 0,0001 hPa; (4) 12 h a 5 °C e 0,0001 hPa.
3. Armazene a -20 °C imediatamente para evitar a reidratação até o uso.

4. Ressuspensão poliplexa

NOTA: Este protocolo descreve o processo utilizado para reconstruir as nanopartículas lioofilizadas C6-peptídeo-pBAE para seu uso posterior, seja para caracterização, in vitro ou análise in vivo.

1. Pegue as nanopartículas liofphilizadas a partir de -20 °C apenas no momento do uso e adicione rapidamente a quantidade correspondente de água despirada (DEPC) para redispersar o sólido para alcançar a concentração desejada.
   NOTA: O volume será o mesmo que o volume inicial das nanopartículas se a mesma concentração for prevista, mas será indicado para cada experimento.
2. Pipeta suavemente até a ressuspensão total, acompanhando o líquido com a pipeta.
   NOTA: Certifique-se de que não há material na parede do frasco.
3. Uma vez dissolvida, pipeta para cima e para baixo vigorosamente, evitando bolhas.
   NOTA: A amostra deve ter um aspecto transparente a translúcido, que é mais evidente em concentrações mais altas
4. Armazene as amostras no gelo ou a 4 °C por um período máximo de 24 h, uma vez reconstituída. Evite congelar.

5. Caracterização de poliplex

1. Dispersão dinâmica de luz
   NOTA: O diâmetro hidrodinâmico (nm), o índice de polidispersidade (PDI) e a carga superficial de nanopartículas foram medidos a 25 °C, comprimento de onda laser de 633 nm e detector de sinal de 173°, utilizando um analisador potencial Zeta (ver Tabela de Materiais).
   1. Diâmetro hidrodinâmico (nm)
      1. Prepare as nanopartículas que misturam mRNA e pBAE completamente, canalizando o material genético para a fração do polímero para uma concentração final de mRNA de 0,25 mg/mL como descrito anteriormente acima (passo 2).
      2. Pré-enxágue uma microcuvette com mídia de diluição filtrada para limpá-la completamente das impurezas. Em seguida, encha a cuvette com pelo menos 50 μL da solução amostral e tampe-a. Em seguida, introduza a amostra dentro do instrumento DLS, certifique-se de que a célula está corretamente inserida.
         NOTA: A mídia de diluição é filtrada usando um filtro de seringa de 0,22 μm.
      3. Abra o arquivo SOP (Standard Operation Procedure, procedimento de operação padrão) criado e introduza o nome da amostradesejado . Selecione a medição de tamanho.
         NOTA: Todos os parâmetros para criar um SOP para medições de tamanho são fornecidos na Tabela 1.
      4. Execute a medição do tamanho da partícula usando DLS clicando em Reproduzir.
         NOTA: Após o sinal de bipe triplo, a análise é completa.
      5. Selecione os resultados correspondentes à amostra na folha de medição para obter o tamanho médio da partícula, O IDB médio, desvio padrão e gráficos. Uma vez feito, remova a célula do equipamento DLS.
      6. Remova a amostra, guarde-a para análise potencial de zeta e limpe e enxágue a célula com água deionizada. Finalmente, seque a cuvette limpa sob um fluxo de gás de ar comprimido.
   2. Carga de superfície (mV)
      1. Prepare as nanopartículas que misturam mRNA e pBAE completamente, canalizando o material genético para a fração de polímero para uma concentração final de mRNA de 0,25 mg/mL como descrito anteriormente (passo 2, formação de poliplex). Em seguida, congele e seque a solução.
         NOTA: Neste caso, para a medição da carga superficial, a secagem congelante da amostra é fortemente recomendada antes de realizar as medidas para redisperse a amostra no buffer apropriado, simulando condições corporais de pH e concentração de eletrólitos.
      2. Resuspense a amostra liofilizada usando água. Diluir a amostra 1/10 em água (concentração final 0,025 mg/mL).
      3. Pré-enxágue uma célula capilar dobrada descartável (zeta potencial cuvette) com mídia de diluição filtrada para limpá-la completamente das impurezas. Em seguida, encha a cuvette com nanopartículas diluídas, usando uma seringa de 1 mL, e tampa ambos os lados dos enchimentos.
         NOTA: A dispersão de nanopartículas deve preencher o volume disponível no cuvette (~1 mL), tendo especial atenção à formação da bolha, o que pode perturbar as medidas.
      4. Introduzir a amostra dentro do DLS; certifique-se de que a célula está corretamente inserida.
      5. Abra o arquivo SOP criado para análise potencial zeta e introduza o nome da amostradesejado . Selecione a medição do potencial zeta.
         NOTA: Parâmetros para criar um SOP para medidas potenciais de zeta são dados na Tabela 2.
      6. Execute a medição potencial zeta usando DLS clicando em Reproduzir.
         NOTA: Após o som do bipe triplo, a análise é completa.
      7. Selecione os resultados correspondentes à amostra na folha de medição para obter o potencial zeta médio, desvio padrão e gráficos. Uma vez feito, remova a célula do equipamento DLS.
      8. Remova a amostra e guarde-a se for necessário. Em seguida, limpe e enxague a célula de cuvette com água deionizada, seguida de etanol e água novamente. Finalmente, seque a cuvette limpa sob um fluxo de gás de ar comprimido.
         NOTA: Para analisar os dados, use o software recomendado.
2. Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)
   NOTA: O diâmetro hidrodinâmico (nm) e a concentração de nanopartículas foram medidos a 25 °C, comprimento de onda laser de 488 nm usando um Analisador de Rastreamento de Nanopartículas (ver Tabela de Materiais).
   1. NTA e preparação de amostras
      1. Ligue o computador e o equipamento. Primeiro, verifique se todos os componentes estão conectados corretamente. Em seguida, abra o software recomendado. O software verificará se todos os acessórios estão conectados corretamente.
      2. Conecte a placa superior, aqui, a célula o-ring, no módulo laser.
         NOTA: Não esvai essa peça.
      3. Primeiro carregue a câmara com tampão e/ou água deionizada com uma seringa de 1 mL. Repita o procedimento pelo menos duas vezes. Evite introduzir bolhas na câmara.
      4. Prepare a amostra diluindo 1/1000 em água deionizada a partir da concentração utilizada na medição do tamanho do DLS. Prepare pelo menos 1 mL e carregue-o em uma seringa de 1 mL, evitando a introdução de bolhas.
      5. Coloque as amostras na câmara usando uma seringa. Em seguida, conecte o módulo laser na câmara grande da NTA.
         NOTA: Câmara grande denota o espaço onde a câmara é colocada para a medição.
   2. Otimização de imagem
      1. Primeiro, no Hardware,verifique se a câmera e o laser adequado estão selecionados.
         NOTA: Aqui, há apenas uma câmera e o Laser Azul 488 nm.
      2. Comece com o nível da câmera em 0 e pressione a Câmera iniciar na janela Capturar.
         NOTA: Neste ponto, ajuste os seguintes parâmetros. Posição do feixe (pode ser movido para cima e para baixo na tela). Nível da câmera: evite pixels supersaturados. Foco (roda lateral): tente se concentrar o melhor possível. É melhor ter partículas com um halo em vez de partículas desfocadas. Concentração: Ajuste a concentração para ter entre 10 a 100 partículas por campo.
   3. Gravação de vídeo
      1. No software, vá para a seleção de medição- janela SOP (à esquerda) e selecione Medição Padrão.
         NOTA: Programa para executar três medidas de 30 s cada (para permitir que o software realize cálculos de média e desvio padrão). Forneça um nome e um caminho de pasta (no nome do arquivo base) para salvar os registros da amostra. Quando os parâmetros SOP estiverem configurados corretamente, pressione Criar e Executar script. Uma vez que a primeira réplica seja medida, o programa pedirá para adicionar uma nova amostra. Em seguida, outra fração da amostra deve ser introduzida na câmara empurrando o êmbolo da seringa. Por fim, repita uma terceira vez para analisar a terceira réplica.
   4. Processamento de vídeo
      1. Reajuste o limite de ganho e detecção da tela assim que as três medidas forem concluídas para analisar as partículas medidas. Neste momento, cerca de 100 partículas devem aparecer em cada quadro para realizar a análise (altas cruzes vermelhas e cruzes azuis baixas são esperadas).
      2. Exporte os resultados em um arquivo pdf após a análise ser concluída. Além disso, é possível exportar como vídeos e arquivos excel.
   5. Limpeza da NTA
      NOTA: Feche todas as medidas abertas antes de estudar a seguinte amostra; uma vez que os arquivos gerados são enormes e dependendo do computador, não é fácil manter mais de um aberto.
      1. Limpe a câmara NTA lavando água repetidamente antes de realizar a medição subsequente até que nenhuma partícula seja observada; posteriormente, limpe o tampão utilizado (PBS) para continuar com as medidas.
      2. Lave o ar dentro da câmara e seque-o com papel de grau microscópico assim que a última medição do dia estiver concluída.
      3. Caracterizar o tamanho e a forma por Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM). Prepare as amostras. 30 μL do volume final é suficiente para caracterização TEM.
         NOTA: Podem ser medidas tanto frescas quanto liofilizadas - após a ressuspensão- nanopartículas.
      4. Solte 10 μL de amostra em uma rede de cobre revestida de carbono. Deixe secar por 10 minutos. Remova o excesso de líquido, se necessário, tocando suavemente no papel do filtro.
      5. Queda de 10 μL de acetato de util (2% c/v) solução para coloração negativa. Deixe secar por 1 min. Remova o excesso de líquido, se necessário, tocando suavemente no papel do filtro.
      6. Introduza a amostra no microscópio e scan (operação de tensão de 80 kV).
         NOTA: O software apropriado pode ser usado para análise posterior das imagens.
3. Eficiência de encapsulamento
   1. Preparação da amostra
      1. Prepare as nanopartículas na concentração desejada e congele-as e seque-as. Em seguida, resuspenque as nanopartículas e dilui-as em uma concentração final de 6 μg/mL.
      2. Prepare o buffer 1x TE da solução de estoque de 20x.
         NOTA: Vt (Volume total) = (número de amostras x 100 μL x 4) (número de amostras x 290 μL) + 2 mL.
      3. Prepare o buffer TE com 3 μg/μL de Heparina a partir do estoque de 100 μg/μL.
         NOTA: Vt = Número de amostras x 50 μL x 2.
      4. Prepare os padrões
      5. Prepare um padrão RNA que varia de 0,2 μg/mL a 0,025 μg/mL no tampão 1x Tris-EDTA (TE)(Tabela S1A).
         NOTA: Use mRNA no padrão RNA no caso de diferencie do RNA ribossômico.
      6. Prepare o padrão RNA:pBAE com Heparin(Tabela S1B). Preparar o padrão Heparin(Tabela S1C).
      7. Prepare uma placa de 96 poços da seguinte forma.
         1. Carregar 295 μL de tampão de TE na primeira pista de uma placa de 96 poços (como muitos poços como amostras para analisar). Em seguida, carregue 50 μL de tampão 1x TE nas faixas B e C (duplicatas para cada amostra).
         2. Carregar 50 μL de tampão 1x TBE com 3 μg/μL de Heparina nas faixas D e E (duplicatas para cada amostra). Em seguida, carregue 100 μL de cada padrão nas faixas F, G e H (duplicatas para cada padrão).
         3. Carga 5 μL de cada amostra na faixa A (a concentração em cada poço é de 0,1 μg/mL). Misture corretamente por pipetação e carregue 50 μL de cada amostra nos quatro poços abaixo (dois deles contendo 50 μL de tampão 1x TE e mais dois contendo 1x te buffer com 3 μg/μL de Heparina).
      8. Incubar a amostra por 30 min a 37 °C. Prepare o reagente RiboGreen de acordo com o protocolo do fabricante (ver Tabela de Materiais) em 1x de buffer TE.
         NOTA: Diluir 1:200 e vórtice. Proteja-se contra a luz. Vt = Número de poços completos x 100 μL.
      9. Carregue 100 μL de solução RiboGreen em cada poço. Detecte fluorescência usando o leitor de microplaca com um comprimento de onda de excitação de 500 nm e um comprimento de onda de emissão de 525 nm.
   2. Análise de resultados
      1. Prepare as três curvas de calibração
         NOTA: Primeiro, padrão RNA ribossômico. Interpolar nesta curva de calibração as amostras que não contêm Heparina. Segundo, mRNA:pBAE com Heparin. Interpolar nesta curva de calibração a amostra que tem Heparina. Terceiro, Heparin. Usado para garantir que a concentração de trabalho esteja na faixa linear.
      2. Calcular a eficiência de encapsulamento (EE%) da seguinte forma:
         

6. Caracterização in vitro

1. Microscopia de fluorescência para avaliação qualitativa
   1. Coloque a placa de 96 poços no microscópio após 24 horas de transfecção. Comece a visualizar células com o objetivo de 10x.
      NOTA: As células HeLa são usadas neste caso. As células são localizadas usando o modo de transmissão (campo brilhante), e o foco deve ser ajustado neste momento.
      1. Primeiro, aplique um balanço de branco para referenciar o software sobre o fundo das amostras. Em seguida, adquira uma imagem para sobrepor-a com a imagem de fluorescência durante a análise.
   2. Altere o modo microscópio para o modo de reflexão (fluorescência) e mova a roda do filtro para o laser azul (488 nm) para visualizar o eGFP.
      NOTA: Neste ponto, o tempo de exposição e ganho deve ser ajustado. O ganho deve ser ajustado em valores entre 3 e 5 para evitar artefatos e excesso no sinal de fundo. O ajuste do tempo de exposição depende da eficiência de transfecção (de ms para 1 s).
   3. Adquira imagens para todas as condições ou poços que empregam o mesmo tempo de exposição para comparar todas as amostras.
2. Citometria de fluxo (FC) para avaliação quantitativa
   1. Use uma pipeta multicanal para preparar a placa de 96 poços para o experimento de citometria de fluxo.
      NOTA: Ao trabalhar com células semi-aderentes, como na linha celular JAWSII, recupere todo o volume de mídia e armazene-o em outra placa de 96 poços. Não aspire a esta mídia, pois pode conter um número significativo de células transfeinadas.
   2. Limpe as células (as células HeLa são usadas aqui) com 100 μL/well de 1x PBS e aspire-a. Em seguida, adicione 25 μL/bem de trippsina e incuba-o a 37 °C por 5 min.
   3. Uma vez que as células são separadas, adicione mídia recuperada anteriormente para parar a ação de trippsina e corrigir as células, adicionando 31,25 μL/bem de formalina 10% para 20 min (concentração final 2,5%).
      NOTA: Neste ponto, é crucial visualizar o estado das células por microscopia para garantir o descolamento das células. É altamente recomendado para pipeta para cima e para baixo várias vezes para ajudar as células a se desprender e evitar sua aglomeração. Isso produzirá um resultado confiável.
   4. Ligue o citômetro de fluxo e o software. No software, configure as condições adequadas para o experimento (tipo de placa, volume de amostra e outros parâmetros, como agitação, lavagem entre amostras.
      NOTA: Para a etapa 6.2.5, a vazão deve ser de 120 μL/min. Misture um ciclo a cada 1 minuto e enxágue um ciclo a cada um bem. A mistura é essencial para manter as células dispersas na mídia e permitir uma melhor análise das células individuais. Além disso, a lavagem é necessária para limpar os microfluidos do citómetro entre as amostras. Finalmente, verifique se há buffers suficientes e se todos os componentes estão conectados corretamente.
   5. Configure os parâmetros apropriados para quantificar a porcentagem de células positivamente transfeinadas.
      1. Primeiro, visualize os dados de fluxo sobre (Luz dispersa dianteira) FSC versus SCC (Luz dispersa lateral) para distinguir as células dos detritos. Em seguida, outro gráfico de dispersão comparando a amplitude (FSC-A) versus altura (FSC-H) é plotado para gate e discriminar células individuais.
         NOTA: A população não tratada permite fechar as populações correspondentes a células transfectadas positivamente. Em seguida, a quantificação das células positivamente transfectadas é realizada no canal adequado em uma trama de histograma. Portanto, as células positivamente transfectadas devem ser representadas como um contínuo dos eventos no histograma.

7. Testes de funcionalidade in vitro: capacidade de ativar células imunes modelo usando ovalbumina (OVA) como modelo antigênico mRNA

1. Placa 10.000 células/poço (as células JAWSII são usadas aqui) em uma placa de 96 poços um dia antes da transfecção.
   NOTA: Placa tantos poços quanto necessário para ter triplicados para cada condição. Deixe as células anexarem à placa pelo menos por 12 h (recomenda-se uma incubação durante a noite).
2. Prepare os NPs pBAEs, conforme descrito na NOTA abaixo para transfetá-lo 0,6 μg mRNA por poço.
   NOTA: Como um controle positivo, transfete as células usando um reagente de transfecção. Aqui, utilizamos 0,1 μg mRNA por poço e 0,25 μL do reagente de transfecção por poço. foi adquirido o codificador de mRNA para OVA (ver Tabela de Materiais). É poliadenylated, modificado com 5-metoxiuridina, e otimizado para sistemas mamíferos, e é protegido através de um capping final com estrutura Cap1, um método proprietário do fornecedor.
3. Incubar a placa de 96 poços por 24 h em uma incubadora de ar seco a 37 °C e 5% de CO₂.
   NOTA: Após este tempo, não aspire a mídia, pois pode conter um certo número de células. Recupere as células e salve-as em outro poço ou placa.
4. Lave as células remanescentes no poço com 25 μL de 1x PBS. Em seguida, aspire e adicione 25 μL de trippsina e incubar a placa por 5 min a 37 °C para desprender as células. Pare a reação de trypsin adicionando a mídia recuperada anteriormente no correspondente bem.
5. Centrifugar a placa a 400 x g por 5 min a 4 °C. Aspirar a mídia. Adicione 50 μL/poço de um PBS 1x e 2,5% de formalina. Incuba-o a 4 °C por 20 min para fixar as células.
6. Repetir as etapas 7.5 e 7.5.1. Em seguida, adicione 50 μL/well de 1x PBS e 3% BSA (Tampão de bloqueio) e incubar por 30 min a 4 °C. Novamente, repita as etapas 7.5 e 7.5.1, e depois adicione 50 μL/bem do anticorpo primário (mouse α-OVA) em 1x PBS e 3% BSA e incubar por 30 min a 4 °C.
7. Repita as etapas 7.5 e 7.5.1, e depois lave as células com 50 μL/bem de 1x PBS. Aspire mídia e, em seguida, adicione a solução de anticorpos secundários (α-mouse-AlexaFluor488/PerCP e Cy5.5-CD11b/APC-CD86) em 1x PBS e 3% BSA. Incubar por 1h a 4 °C.
8. Centrifugar a placa a 400 x g por 5 min. Em seguida, lave as células com 50 μL/bem de 1x PBS. Em seguida, centrífuga (400 x g por 5 min), aspira e, em seguida, resuspensa as células em 100 μL/well de 1x PBS e 2,5% Formalina.
9. Analise-o por citometria de fluxo, conforme descrito acima (passo 6.2).

Resultados

Síntese e caracterização do polímero
O procedimento de síntese OM-pBAE é dado na Figura 2. Como mostra a Figura 2A, o primeiro passo para obter o OM-pBAE é sintetizar o C6-pBAE adicionando as aminas (1-hexilamina e 5-amino-1-pentanol, razão 1:1) ao diacrilato (1,4-diacrilate butanediol). Esta reação é realizada a 90 °C por 20 h e com agitação constante. Posteriormente, uma solução de oligopeptídeos é adicionada a uma solução de polímero C6 ob...

Discussão

Após o surto da pandemia Covid-19 no ano passado, a importância das vacinas em termos de controle de doenças infecciosas tem se manifestado como um componente crítico⁸. Os esforços de cientistas em todo o mundo permitiram a liberação para o mercado de muitas vacinas. Pela primeira vez na história, as vacinas mRNA demonstraram seu sucesso anteriormente hipótese, graças ao seu rápido design devido à sua capacidade de se adaptar a qualquer novo antígeno dentro de alguns^{meses 5,}

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Diacrilato de 1,4-butanodiol	Sigma Aldrich	123048
1-hexilamina	Sigma Aldrich	219703
5-amino-1-pentanol	Sigma Aldrich	411744
Acetona	Panreac	141007
anticorpo CD11b	BD	550993
anticorpo CD86	Bioligend	105007
Hidroxído de cloro	Panreac	181023
Clorofórmio-d	Sigma Aldrich	151823
Cys-His-His-His peptídeo	Ontores	Peptídeo
	Ontores	Custom
D2O	Sigma Aldrich	151882
reagente DEPC para água livre de Rnase	Sigma Aldrich	D5758	Este reagente é importante para tratar a água MilliQ para remover quaisquer RNases dos tampões
Dietyl eter	Panreac	212770
dimetilsulfóxido	Sigma Aldrich	276855
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
mRNA EGFP	TriLink Technologies	L-7601
mRNA OVA	TriLink Tecnologias	L-7610
RiboGreen kit	ThermoFisher	R11490
acetato de sódio	Sigma Aldrich	71196
sacarose	Sigma Aldrich	S0389
Ácido trifluoroacético	Sigma Aldrich	302031
Tripsina-EDTA	Fisher Scientific	11570626
α- camundongo AlexaFluor488 anticorpo	Abcam	Ab450105
EquipmentAnalisador de rastreamento de
nanopartículas	Malvern Panalytical	NanoSight NS300
Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear	Varian	400 MHz
ZetaSizer	Malvern Panalytical	Nano ZS	Para potencial zeta e determinação de tamanho hidrodinâmico
Software
NanoSight Software NTA	Malvern Panalytical	MAN0515-02-PT-00
NovoExpress Software	Agilent	Não especificado
Software ZetaSizer	Malvern Panalytical	DTS Aplicação	Para analisar a carga superficial e os tamanhos hidrodinâmicos