Produção de camundongo humanizado por meio de enxerto de cápsula renal tímica, injeção de células CD34+ e entrega de citocinas

Resumo

Modelos de camundongos humanizados fornecem uma representação mais precisa do microambiente imunológico humano. Este manuscrito descreve o processo no qual esses modelos são criados por meio de um enxerto renal de timo humano, injeção de células CD34⁺ humanas e a entrega direcionada de transgenes de citocinas humanas para promover a proliferação e diferenciação de células CD34⁺ .

Resumo

Os modelos animais fornecem uma tradução vital entre a pesquisa biomédica in vitro e in vivo . Modelos de camundongos humanizados fornecem uma ponte na representação de sistemas humanos, permitindo assim um estudo mais preciso da patogênese, biomarcadores e muitas outras consultas científicas. Neste método descrito, camundongos IL2Rγnull (NSG) com NOD-scid imunodeficiente são implantados com timo autólogo, injetados com células CD34⁺ derivadas do fígado, seguidas por uma série de entregas de citocinas injetadas. Em contraste com outros modelos de natureza semelhante, o modelo descrito aqui promove uma reconstituição aprimorada das células imunes, fornecendo citocinas e fatores de crescimento por meio de transgenes codificados em vetores baseados em DNA AAV8 ou pMV101. Além disso, oferece estabilidade a longo prazo com camundongos reconstituídos com uma vida útil média de 30 semanas após as injeções de CD34⁺ . Por meio desse modelo, esperamos fornecer um método estável e impactante de estudo de imunoterapia e doenças humanas em um modelo murino, demonstrando assim a necessidade de modelos pré-clínicos preditivos.

Introdução

Embora os modelos animais tenham criado uma compreensão mais profunda dos sistemas celulares e moleculares, o desafio permanece em elucidar as complexidades dos sistemas específicos da espécie, como imunidade, fisiologia e outras áreas da patologia. Primatas não humanos (NHP), como chimpanzés, têm sido historicamente usados para compensar as lacunas na pesquisa de modelos; no entanto, o modelo de PNH pode ser bastante caro e inacessível, principalmente porque seu uso foi proibido na Europa¹.

Após um procedimento de enxerto bem-sucedido, o sistema murino replica o sistema imunológico humano, conforme demonstrado pelo repovoamento dos órgãos linfoides. O desenvolvimento de camundongos com sistema imunológico humano funcional oferece a oportunidade de realizar pesquisas translacionais sobre imunidade humana em uma variedade de contextos. Camundongos imunodeficientes enxertados com células e tecidos humanos que podem replicar com sucesso um sistema imunológico humano operativo facilitam o estudo da hematopoiese, imunidade, terapia gênica², doenças infecciosas³, câncer⁴ e medicina regenerativa⁵. Nosso grupo e alguns de nossos colaboradores publicaram resultados usando esse modelo que demonstra modelos pré-clínicos de melanoma cutâneo⁶. Este modelo é versátil o suficiente para ser aplicado a inúmeros campos além do contexto da pesquisa em melanoma e imunoterapia.

As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) são comumente usadas para humanização, pois resultam em reconstituição robusta das células T, que estabeleceram papéis na tolerância imunológica; no entanto, devido à sua baixa taxa de auto-renovação e sua alta taxa de células maduras comprometidas com a linhagem, as PBMCs são frequentemente substituídas por produtos à base de células-tronco humanas (HSC), que podem ser derivados do fígado fetal⁷. Em combinação com esses produtos HSC derivados, a adição do implante do timo humano sob as cápsulas renais de camundongos NSG cria um sistema capaz de apoiar o desenvolvimento de células T humanas. Esse modelo, conhecido como medula óssea-fígado-timo (BLT), é altamente vantajoso porque permite hematopoiese multilinhagem, educação de células T no timo autólogo e restrição de HLA⁸.

O modelo proposto neste manuscrito é um modelo BLT modificado com entrega adicional de citocinas. As citocinas pró-inflamatórias demonstraram reforçar as habilidades das células imunes efetoras, especificamente por meio de imunoterapias baseadas em IL-15⁹. Os linfócitos CD45⁺ são observados no sangue periférico de camundongos humanizados (camundongos Hu) aproximadamente 8-12 semanas após a injeção de células CD34⁺ humanas, exibindo um aumento evidente na reconstituição em comparação com o sangue circulante de camundongos NSG regulares. Usando o vetor adeno-associado para fornecer IL-3, IL-7 e GM-CSF humanas, os níveis de células CD45 ⁺ humanas aumentaram em circulação em comparação com os camundongos que não receberam as citocinas. A adição das citocinas DNA Combo II (SCF, FLT3, CKIT e THPO) melhora as células T e a diferenciação das células mielóides¹⁰. A adição de entrega de citocinas distingue este método entre os outros modelos de camundongos Hu, conforme apoiado por dados publicados¹⁰.

O desenvolvimento desse modelo com uma resposta imune humana inata e adaptativa permitiu a publicação de dados sobre a resistência à terapia e o microambiente^{tumoral 10}. Os laboratórios fornecidos podem acessar amostras de tecido para utilizar este método; este modelo de camundongos Hu tem grande potencial para outros laboratórios estudarem campos semelhantes, bem como se expandirem para outras áreas de imunoterapia e estudos pré-clínicos.

Protocolo

Todos os protocolos que envolvem o uso de animais são monitorados de perto pelo Comitê Institucional de Cuidados e Usuários de Animais (IACUC) do Instituto Wistar. O laboratório segue as diretrizes estabelecidas por este comitê e pelo veterinário assistente para garantir a saúde, segurança e bem-estar dos animais envolvidos. Antes de seguir este protocolo, é necessária a aprovação do veterinário e da IACUC, e os indivíduos podem ter variações nas técnicas cirúrgicas específicas e no manejo dos animais em comparação com o protocolo, de acordo com o conselho das partes envolvidas no bem-estar animal.

NOTA: As amostras de tecido podem ser congeladas até que estejam prontas para uso. Além disso, o isolamento de CD34⁺ pode ser realizado no mesmo dia ou no dia seguinte à cirurgia de enxerto renal. Esta informação informará quando o Bussulfano será injetado: se pretende realizar a cirurgia no mesmo dia do isolamento, o Bussulfano deve ser injetado preventivamente na preparação do tecido receptor. Tratar trinta camundongos NSG fêmeas de 5 a 7 semanas de idade com 30 mg / kg (100 μL, PBS 1x) de um medicamento recém-esgotado do mielo; O bussulfano injetou IP 24 h antes da cirurgia.

1. Isolamento de células CD34⁺

1. Prepare a solução de digestão dissolvendo 100 mg de colagenase / dispase em 50 mL de RPMI1640. Use um filtro de vácuo de 0.22 μm para esterilizar a solução de digestão.
2. O fígado fetal (>20 semanas de idade) é fornecido em 50 mL de RPMI1640 meio. Aspire e descarte o meio, deixando 10 mL dentro do tubo que contém o fígado.
3. Lave o tecido com 45 mL de RPMI1640 + 100 μg/mL do antibiótico Primocin duas vezes em um tubo cônico de 50 mL, aspirando o meio entre cada lavagem. Certifique-se de deixar o tecido assentar no fundo do tubo antes de aspirar a mídia.
4. Colocar um peneiro de tecido estéril num copo esterilizado de 200 ml.
5. Despeje o fígado fetal pela peneira e use a ponta de uma seringa plástica estéril de 10 mL para triturar o tecido.
6. Lave as células hepáticas restantes na peneira usando 50 mL de RPMI1640 + 100 μg / mL do antibiótico Primocin seguido de 50 mL de RPMI1640 meio de colagenase / dispase (2 mg / mL). O béquer de 200 mL agora contém o RPMI1640 com Primocin, colagenase / dispase RPMI1640 e fígado homogeneizado.
7. Alicotar a mistura em quatro tubos cónicos de 50 ml e incubá-los em banho-maria (37 °C) durante 1 h. Agite os tubos cônicos a cada 15 min.
8. Adicione 15 mL de Ficoll em quatro tubos cônicos de 50 mL.
9. Coloque cuidadosamente a solução hepática homogeneizada por cima, distribuindo aproximadamente 35 mL entre cada tubo. Não perturbe a interface.
10. Coloque os tubos na centrífuga e gire a 800 x g por 1 h com o mínimo de aceleração/freio.
11. Remova os tubos da centrífuga e colete as células da interface (10-15 mL) em dois tubos cônicos de 50 mL.
12. Adicione PBS 1x até 50 mL para lavar o pellet e centrifugue a 300 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante.
13. Ressuspenda o pellet em 10 mL de tampão de lise ACK (cloreto de amônio-potássio) e incube por 5-10 min. Encha o tubo com 1x PBS.
14. Conte manualmente as células ao microscópio usando azul de tripano e um hemocitômetro. Centrifugue as células a 300 x g por 5 min.
    NOTA: As células mononucleares do fígado podem ser injetadas diretamente daqui, se desejado, por exemplo, se a contagem de células for inferior a 50 milhões de células.
15. Aspire o PBS e ressuspenda o pellet celular em 300 μL do tampão de separação (2 mM EDTA, 5 μg/mL de BSA em 1x PBS) para 100 x 10⁶ células ou menos. Para mais de 100 x 10⁶ células, use uma proporção baseada na quantidade de células acima para determinar a quantidade de buffer (ou seja, dobre as células, dobre o buffer).
16. Adicione 100 μL de reagente bloqueador de FcR e incube por 2-5 min.
17. Adicione 100 μL de anticorpos de microesferas CD34, misture bem e incube no gelo por 30 min; agite mecanicamente com a mão após 15 min.
18. Adicione 7-10 mL do tampão de separação e filtre através de filtros de células de 100 μm, 70 μm e 40 μm nessa ordem.
19. Coloque um separador de células baseado em coluna em um separador magnético. Coloque um tubo cônico de 15 mL embaixo do separador para coletar o fluxo e o tampão.
20. Encher a coluna com 500 μL do tampão de separação.
21. Despeje a suspensão celular através da coluna.
22. Encha a coluna com o fluxo e o tampão que foram coletados no tubo cônico.
23. Lave a coluna 3 vezes com 500 μL do tampão de separação.
24. Descarte o fluxo e substitua o tubo por um tubo de poliestireno de 15 mL.
25. Encha a coluna com 1 mL do tampão de separação, remova a coluna do ímã e lave o êmbolo com um toque.
26. Conte as células e ressuspenda em 1x PBS para injeção. Coloque no gelo até usar.

2. Processamento tímico

1. Lave o timo autólogo (>20 semanas de idade) adicionando 5-8 mL de RPMI1640, deixe o tecido assentar. Remova cuidadosamente o meio por vácuo, evitando o contato com o timo. Repita isso mais uma vez.
2. Suspenda em 10 mL de RPMI1640 em temperatura ambiente com Primocin (100 μg / mL).
3. Transfira o timo para uma placa de Petri tratada com tecido. Certifique-se de que o timo esteja totalmente revestido com Primocin-media.
4. Incube por 30-45 min em temperatura ambiente.
5. Aspire o meio Primocin. Lave o timo com 5-8 mL de RPMI1640, remova o meio a vácuo e repita mais uma vez.
6. Suspenda o timo em 5-8 mL de RPMI1640.
7. Preparar o timo incubado para enxertia cortando segmentos de 1 mm x 2 mm com dois bisturis.
   NOTA: Isso será enxertado nos camundongos; portanto, certifique-se de que as fatias de timo possam ser aspiradas para dentro e para fora da seringa e da agulha Hamilton 22 G anexada com relativa facilidade.

3. Enxerto de cápsula sub-renal e injeção de células CD34

1. Examine os ratos quanto à sua saúde geral antes da cirurgia. Raspe os mouses para expor uma área (aproximadamente 3 "x 2") no corpo lateral esquerdo.
2. Anestesiar os camundongos via isoflurano (indução 5%, manutenção 2%-3%) na câmara e, em seguida, transferir camundongos individuais da câmara para um estágio cirúrgico com um cone nasal.
3. Higienize a área raspada com clorohexidina e cotonetes de preparação com álcool. Garanta a anestesia individual por meio do teste de pinça.
4. Faça uma grande incisão (5-7 mm) posterior, lateral à coluna do camundongo, e dobre a pele para trás.
5. Certifique-se de que, neste ponto, o baço esteja visível abaixo da fáscia. Faça uma incisão menor de ~ 2 mm na fáscia. Certifique-se de que a incisão seja a menor possível, permitindo que o rim fique totalmente exposto.
6. Determine a localização dessa incisão, identificando visualmente o baço e usando-o como marcador para o rim, que não é visível.
   NOTA: O rim murino está localizado atrás de um agrupamento de gordura no quadrante nordeste do baço.
7. A partir daqui, posicione a mão (cirurgião) sob o lado do mouse oposto à incisão e empurre para expor o rim. Reposicione qualquer gordura para expor totalmente o rim.
8. Utilize os dedos da mesma mão para estabilizar o rim exposto. Se necessário, use PBS 1x estéril para lubrificar o rim exposto.
   NOTA: É importante observar que o cirurgião deve usar dedos diferentes daqueles que manusearam o lado do camundongo para segurar o rim e manter a esterilidade. Consulte o veterinário do instituto sobre a manutenção adequada da esterilidade.
9. Simultaneamente, deixe o assistente preparar uma seringa romba com o tecido do timo fetal. Sugue suavemente 2-3 pedaços de timo de tamanho médio (1 mm x 2 mm) com o mínimo de meio até a ponta da agulha e, em seguida, entregue-o ao cirurgião para realizar o procedimento.
   NOTA: O número de pedaços de timo depende do tamanho do tecido, geralmente 2 pedaços são suficientes para obter camundongos humanizados.
10. Deixe o cirurgião inserir a agulha através da extremidade caudal da cápsula renal até que a extremidade distal seja alcançada (~ 2 mm), até o ponto em que a agulha seja visível, mas não rompa o lado cranial da cápsula renal. Deixe o assistente mergulhar a seringa.
11. Coloque o rim, junto com qualquer gordura exposta, de volta no peritônio. Coloque uma sutura absorvível (tamanho 4) e feche a incisão superficial com uma cola veterinária.
12. No pós-operatório, administrar uma dose do analgésico, 25 μL de buprenorfina de liberação sustentada (1 mg/mL) por injeção subcutânea (1 mg/kg).
13. Verifique se os camundongos começam a se recuperar dentro de 5 minutos após a operação.
14. Entre as gaiolas, troque as luvas e esterilize os instrumentos em um esterilizador de esferas de vidro.
15. De 1 a 3 h após a cirurgia, injete 100 μL de células CD34 ⁺ humanas (aproximadamente 100.000 células) no camundongo por injeção intravenosa (IV).
16. Realize uma verificação geral de saúde nos camundongos após concluir a cirurgia (geralmente 2 h após a primeira gaiola), depois 24 h e 48 h depois.
17. Se houver alguma anormalidade na disposição ou nos sinais vitais, monitore ainda mais os camundongos. Depois de limpar esses pontos de verificação, monitore os ratos com menos rigor (2x-3x por semana).
18. Uma semana após a cirurgia, injetar (IV) nos camundongos 100 μL de citocina humana AAV8 (IL-3, IL-7 e GM-CSF; 2 x 10⁹ cópias do genoma / mL).
19. Duas semanas após a cirurgia, realizar injeções IM do plasmídeo DNA Combo II.
    1. Use uma máquina de eletroporação para realizar injeções IM de DNA de plasmídeo Combo II: SCF, FLT3, CKIT e THPO. Para cada camundongo, combine 25 μL de SCF (2 mg / mL), 25 μL de THPO (2 mg / mL), 25 μL de FLT3 (2 mg / mL) e 25 μL de CKIT (10 mg / mL).
    2. Execute uma injeção por perna traseira, ou seja, duas no total, com 50 μL por perna, seguida de eletroporação em cada local de injeção.

Resultados

Após cirurgia bem-sucedida e injeções pós-operatórias apropriadas, a diferenciação de CD34⁺ pode ser confirmada por citometria de fluxo. Aproximadamente 8 semanas após a cirurgia, os camundongos são sangrados em preparação para FACS, recorrendo a cada 2 semanas até que um limite específico de células imunes humanas seja atingido, conforme descrito anteriormente¹⁰. Resumidamente, 100 mL de sangue foram coletados em tubos de coleta de sangue revestidos com lítio e heparina. Após a lise do...

Discussão

Este manuscrito descreveu a geração de camundongos humanizados por meio de timo fetal humano enxertado sob a cápsula renal e subsequente injeção de CD34⁺ para recriar um sistema imunológico humano.

Embora o protocolo funcione para criar o melhor modelo possível, certas etapas são essenciais para a viabilidade. Por exemplo, durante o isolamento CD34⁺ , é essencial que alguém olhando ao microscópio possa identificar células CD34⁺...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de coleta de sangue	Microcontainer	BD
	Life Technologies Corporation
Life	Technologies Sigma	B2635-25g	Medicamento irradiante; kit de
Miltenyi Biotec	130-046-702	CD34	armazenado a 4 ° C
CKIT	Aldevron	citocina personalizada	; armazenada a -20 ° C
Colagenase / Dispersão	Roche Diagnostics 11097113001		Armazenado a 4 > C
FcR Reagente de bloqueio	Miltenyi Biotec	130-046-702	kit de grânulos de anticorpos; armazenado a 4 ° C
Tecido fetal (fígado e timo)	Recursos		Entregue no mesmo dia ou durante a noite
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03	Armazenado em temperatura ambiente
FLT3	Aldevron	125964	citocina; armazenado a -20 ° C
Fórceps	Vários	Vários Agulha
de seringa Hamilton	Vários	Vários 22	G; 3 pontos; 2" de comprimento
Hemostáticos	Vários	Várias
colunas MS	Miltenyi Biotec	130-042-201	separador magnético
PBS	Gibco	14190-136	Armazenado à temperatura ambiente
Primocin	Antibiótico Invivogen	amt-pm1	; armazenado a 4 & C
RPMI	Corning	10-040-CM	Armazenado a 4 ° C
SCF	Aldevron	125962	citocina; armazenado a -20 ° C
Tesoura cirúrgica	Vários	Vários
THPO	Aldevron	125963	citocina; armazenado a -20 ° C
Placa de Petri tratada com tecido	Corning	430167
cola VetBond	cola 3M	1469SB	cola
Viseira sutura	Stoelting Co	5046	sutura absorvível, tamanho 4, corte de 19 mm

BD da esferas de anticorpo sensível à luz; avançados de biociência