Reprogramação Direta de Fibroblastos de Rato em Melanócitos

Resumo

Aqui, descrevemos um sistema de reprogramação direta otimizado para melanócitos e um sistema de embalagem de vírus concentrado de alta eficiência que garante uma reprogramação direta suave.

Resumo

A perda da função dos melanócitos leva ao vitiligo, que afeta seriamente a saúde física e mental dos indivíduos afetados. Atualmente, não há tratamento eficaz a longo prazo para o vitiligo. Portanto, é imprescindível desenvolver um tratamento conveniente e eficaz para o vitiligo. A tecnologia de medicina regenerativa para reprogramação direta de células da pele em melanócitos parece ser um novo tratamento promissor do vitiligo. Isso envolve a reprogramação direta das células da pele do paciente em melanócitos funcionais para ajudar a amenizar a perda de melanócitos em pacientes com vitiligo. No entanto, este método precisa ser testado primeiro em camundongos. Embora a reprogramação direta seja amplamente utilizada, não há um protocolo claro para reprogramação direta em melanócitos. Além disso, o número de fatores de transcrição disponíveis é esmagador.

Aqui, um protocolo concentrado do sistema de embalagem de lentivírus é apresentado para produzir fatores de transcrição selecionados para reprogramação de células da pele para melanócitos, incluindo Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 e Snai2. Os fibroblastos embrionários do camundongo (MEFs) foram infectados com o lentivírus concentrado para todos esses fatores de transcrição para a reprogramação direta dos MEFs em melanócitos induzidos (iMels) in vitro. Além disso, esses fatores de transcrição foram examinados, e o sistema foi otimizado para reprogramação direta aos melanócitos. A expressão dos marcadores característicos da melanina em iMels no nível genético ou proteico foi significativamente aumentada. Esses resultados sugerem que a reprogramação direta de fibroblastos para melanócitos pode ser uma nova estratégia terapêutica bem sucedida para o vitiligo e confirmar o mecanismo de desenvolvimento de melanócitos, o que fornecerá a base para uma reprogramação direta de fibroblastos em melanócitos in vivo.

Introdução

O vitiligo é uma doença de pele que afeta seriamente a saúde física e mental dos indivíduos afetados. Por várias razões, incluindo anormalidades metabólicas, estresse oxidativo, geração de mediadores inflamatórios, descolamento celular e resposta autoimune, os melanócitos funcionais são perdidos, e a secreção da melanina é interrompida, levando ao desenvolvimento do vitiligo ^1,2. Esta condição ocorre amplamente e é particularmente problemática no rosto. O principal tratamento é o uso sistêmico de corticosteroides e imunomoduladores. A fototerapia pode ser usada para doenças sistêmicas ou locais, e há tratament....

Protocolo

Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Gestão e Uso de Animais laboratoriais da Universidade de Jiangsu (UJS-IACUC-AP-20190305010). Os experimentos foram realizados em estrita conformidade com as normas estabelecidas pela Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care International (AAALAC International). Não houve experimentos envolvendo humanos, por isso este trabalho não precisava de aprovação do comitê de ética em pesquisa humana. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre os reagentes.

1. Construção de um sistema concentrado de embalagem de lentivírus para fatores de transcrição

Resultados

Este artigo inclui os protocolos de um sistema concentrado de embalagem de lentivírus para produzir lentivírus de fatores de transcrição para reprogramação direta de fibroblastos para melanócitos e protocolos para triagem de fatores de transcrição e reprogramação direta de melanócitos de MEFs.

O sucesso da produção concentrada de lentivírus foi avaliado observando a intensidade de fluorescência de GFP (Figura 1A) ou por citometria de fluxo (Fi.......

Discussão

A qualidade do vírus é crucial para o sucesso da reprogramação direta aos melanócitos neste protocolo. O método de embalar e concentrar vírus neste protocolo é simples e fácil de repetir e não conta com nenhum outro reagente concentrado auxiliar. Este protocolo pode ser seguido com sucesso na maioria dos laboratórios. Para garantir a qualidade do vírus concentrado, os seguintes pontos precisam de atenção especial. Um deles é o estado celular do HEK-293T. Embora as células HEK-293T sejam células imortalizadas, as células .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,05% Tripsina-EDTA	Gibco	25300-062	Armazenado a -20 ° C
0,45 μ Filtro	M Millipore	SLHVR33RB
5 mL de tubo de fundo redondo de poliestireno	Falcon	352052
95%/100% etanol	LANBAO	210106	Armazenado em RT
Adenina	Sigma	A2786	Concentração de estoque 40 mg/mL Concentração final 24 µ g/mL
Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a	Invitrogen	A21137	Diluição de 1:500 para usar
Antibióticos(Pen/Strep)	Gibco	15140-122	Armazenado a -20 ° C
Anti-TRP1/TYRP1	Anticorpo Millipore	MABC592	Hospedeiro/Isotipo: Camundongo IgG2a Reatividade da espécie: Camundongo/Humano Diluição de 1:200 para usar
Anticorpo Anti-TRP2/DCT	Abcam	ab74073	Hospedeiro/Isotipo: Coelho IgG Reatividade da espécie: Camundongo/Humano Diluição de 1:200 para uso
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Concentração de estoque 10 mM Final concentração 3 μ
M Toxina da cólera	Sigma	C8052	Concentração de estoque 0,3 mg/mL Concentração final 20 pM
Cy3 IgG anti-coelho de cabra (H+L)	Jackson Immunoresearch	111-165-144	Diluição de 1:500 para usar
DMEM (glicose alta)	HyClone	SH30243,01	Armazenado a 4 &graus; C
DMSO	Sigma	D2650	Armazenado em RT
FBS	Gibco	10270-106	Armazenado em -20 ° C Inativado por calor antes do uso
Gelatina	Sigma	G9391	Armazenada em plasmídeos
RT GFP-PURO (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 e Snai2)	Hanheng Biological Technology Co., Ltd.	pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325	Armazenado em -20 ° C
Hematoxilina	Abcam	ab220365	Armazenado em RT
EDN3 Humano	American-Peptide	88-5-10A	Concentração de estoque 100 μ M Concentração final 0,1 μ
M Hidrocortisona	Sigma	H0888	Concentração de estoque 100 µ g/mL Concentração final 0,5 µ g/mL
L-DOPA	Sigma	D9628	Armazenado em RT
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Reagente de transfecção, armazenado a 4 &graus; C
Kit de coloração Masson-Fontana	Solarbio	G2032	Armazenado a 4 & C
Bálsamo neutro	Solarbio	G8590	Armazenado a 4 &graus; C
Paraformaldeído	Sigma	P6148	Armazenado em RT
PBS (-)	Gibco	C10010500BT	Armazenado em RT
Phorbol 12-miristato 13-acetato (TPA)	Sigma	P8139	Concentração de estoque 1 mM Concentração final 200 nM
Polybrene	Sigma	H9268	reagente de transfecção polimérica catiônica; Concentração de estoque 8 μ g/µ L Concentração final 4 ng/µ L
Puromicina	Gibco	A11138-03	Armazenado a -20 &graus; C
Humano recombinante bFGF	Invitrogen	13256-029	Concentração de estoque 4 μ g/mL Concentração final 10 ng/mL
Insulina humana recombinante	Sigma	I3536	Concentração de estoque 10 mg/mL Concentração final 5 µ g/mL
SCF humano recombinante	R& D	255-SC-010	Concentração de estoque 200 μ g/mL Concentração final 100 ng/mL
RPMI-1640	Gibco	11875-093	Armazenado a 4 ° C
Xylene	Sigma	1330-20-7	armazenado em RT