Os protocolos de ensaio baseados em células de ressonância Förster são descritos para a quantificação simples, específica, sensível e robusta do transdutor de sinal endogenso e ativador de transcrição (STAT) 1/3/4/5/6 em lises celulares em um formato de 384 poços.
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Artigo de método
Ensaios de transferência de energia de ressonância de Förster para medição de proteínas STAT fosforilatos endogensas em células humanas
Neste artigo
Resumo
Resumo
O caminho de sinalização Janus kinase (JAK)/sinal e ativador da via de sinalização de transcrição (STAT) desempenha um papel crucial na mediação de respostas celulares às citocinas e fatores de crescimento. As proteínas STAT são ativadas por fosforilação de tirasina mediada principalmente por JAKs. A ativação anormal das vias de sinalização STAT está implicada em muitas doenças humanas, especialmente câncer e condições imunológicas. Portanto, a capacidade de monitorar a fosforilação da proteína STAT dentro do ambiente de sinalização celular nativa é importante tanto para a pesquisa acadêmica quanto para a descoberta de drogas. Os formatos tradicionais de ensaio disponíveis para quantificar proteínas STAT fosforiladas incluem manchas ocidentais e o ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA). Estes métodos heterogêneos são intensivos em mão-de-obra, de baixa produtividade e, muitas vezes, não são confiáveis (específicos) no caso da mancha ocidental. Métodos homogêneos (sem lavagem) estão disponíveis, mas permanecem caros.
Aqui, protocolos detalhados são fornecidos para os sensíveis, robustos, e medição econômica em um formato 384-well de níveis endógenos de STAT1 fosforilato (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) e STAT6 (Y641) em células de células aderentes ou suspensas usando a nova plataforma de transferência de energia de ressonância Förster (TR-FRET) resolvida pelo tempo THUNDER. O fluxo de trabalho para o ensaio celular é simples, rápido e projetado para triagem de alto rendimento (HTS). O protocolo de ensaio é flexível, usa uma amostra de baixo volume (15 μL), requer apenas uma etapa de adição de reagentes e pode ser adaptado a aplicações de baixo rendimento e alto rendimento. Cada imunoensaio sanduíche phospho-STAT é validado em condições otimizadas com agonistas e inibidores conhecidos e gera os valores esperados de farmacologia e fator Z'-factor. Como os ensaios TR-FRET são ratiométricos e não requerem etapas de lavagem, eles fornecem uma reprodutibilidade muito melhor do que as abordagens tradicionais. Juntos, este conjunto de ensaios fornece novas ferramentas econômicas para uma análise mais abrangente das proteínas STAT fosfoiladas específicas após o tratamento celular e a triagem e caracterização de moduladores específicos e seletivos da via de sinalização JAK/STAT.
Introdução
A via de sinalização JAK/STAT desempenha um papel fundamental na mediação de respostas celulares a diversas citocinas, interferons, fatores de crescimento e moléculas relacionadas1,2. A ligação desses ligantes a receptores específicos de superfície celular resulta na ativação de JAKs, que por sua vez ativam proteínas STAT por fosforilação de resíduos específicos de tyrosina. A fosforilação STAT resulta em sua dimerização e translocação para o núcleo, onde exercem seu efeito sobre a transcrição de genes-alvo regulados. A família STAT é composta por sete membros: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b e STAT....
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Protocolo
1. Cultura celular
- Manter as células em uma incubadora e cultura de CO2 umidificados de 37 °C/5% com DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) (células HeLa e A431) ou RPMI suplementado com 15% de FBS (células U266B1). Cultuize as células até atingirem 70-80% de confluência, depois tentem e os façam para os ensaios.
NOTA: A mídia cultural continha fenol vermelho. Nenhuma fome de soro foi conduzida para qualquer linha celular antes de conduzir os ensaios.
2. Estimulador ou titulação inibidora utilizando o protocolo de ensaio de duas placas com células aderentes
NOTA: Este pro....
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Resultados
Cada ensaio THUNDER TR-FRET foi validado farmacologicamente pelo tratamento de células de suspensão (HeLa ou A431) ou células de suspensão (U266B1) com ativadores ou inibidores específicos da via JAK/STAT e, em seguida, medindo os níveis de STATs fosforylatados e totais específicos, quando aplicável. Os ensaios foram realizados em formato de 384 poços utilizando o protocolo de transferência de duas placas e condições de ensaio pré-otimizadas. Figura 3, Figura 4,.......
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Discussão
Comparado aos métodos convencionais para análise de fosfoproteína, como a mancha ocidental e os métodos baseados em ELISA, o fluxo de trabalho para um ensaio celular THUNDER TR-FRET é simples e rápido, usa uma amostra de baixo volume (15 μL), é projetado para HTS em um formato de 384 poços, e é altamente favorável à automação. O protocolo de ensaio é flexível e pode ser facilmente adaptado a aplicações de médio e alto rendimento. Os ensaios podem ser executados usando um protocolo de transferência de duas placas ou um pr.......
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Divulgações
Interesses Concorrentes: Jaime Padros, Mireille Caron e Geneviève Chatel são funcionários da BioAuxilium Research, que fabrica os kits de ensaio THUNDER TR-FRET utilizados neste estudo. Além disso, Jaime Padros e Mireille Caron são acionistas da BioAuxilium Research. Isso não altera a adesão dos autores a todas as políticas do JoVE sobre o compartilhamento de dados e materiais.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Microplaca de 96 poços, transparente, fundo plano, poliestireno, tratada com cultura de tecidos, estéril | Corning | 3595 | Esta é a placa para cultura de células ao usar o protocolo de ensaio de duas placas. Outras placas de cultura de células de 96 poços podem ser usadas |
| Microplaca de 384 poços, branca, de baixo volume | PerkinElmer | 6007290 | Esta é a placa para detecção de TR-FRET ao usar os protocolos de ensaio de duas ou uma placa. Outras placas brancas de 384 poços de baixo volume podem ser usadas |
| Linha celular A431 | ATCC | CRL-1555 | |
| Vedação de microplaca adesiva | PerkinElmer | 6050185 | |
| DMSO | Fisher | D159-4 | |
| Dulbecco' s meio Eagle modificado (DMEM) | Wisent | 319-005-CL | THUNDER TR-FRET é compatível com meio de cultura contendo vermelho de fenol |
| EnVision Xcite Leitor de placas multirótulo | PerkinElmer | 2104-0020A | Os ensaios podem ser realizados em uma variedade de leitores de placas equipados com a opção TR-FRET |
| Cloridrato de erlotinibe | Frascos tratados com | CDS022564 | |
| Falcon | Fisher | 13-680-65 | |
| Soro bovino fetal (FBS) | Wisent | 098-150 | |
| Linha celular HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| JAK Inibidor 1 | Cayman Chemical | 15146 | |
| Agitador de placa orbital | Muitas opções disponíveis | Não aplicável | |
| EGF humano recombinante | PeproTech | AF-100-15 | |
| IFN&alfa humano recombinante; 2b | ProSpec | CYT-460 | |
| IL-4 humano recombinante | R& D Systems | 204-IL | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) | Wisent | 350-007-CL | THUNDER TR-FRET é compatível com meio de cultura contendo vermelho de fenol |
| THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Kit de Ensaio de Sinalização Celular | BioAuxilium Research | KIT-STAT1PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Kit de Ensaio de Sinalização Celular | BioAuxilium Research | KIT-STAT3PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) Kit de ensaio de sinalização celular TR-FRET | BioAuxilium Research | KIT-STAT4P-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Kit de ensaio de sinalização celular STAT5 TR-FRET total | BioAuxilium Research | KIT-STAT5PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Kit de ensaio de sinalização celular TR-FRET total STAT6 | BioAuxilium Research | KIT-STAT6PT-500 | |
| Tripsina / EDTA 0,05% | Wisent | 325-542-CL | |
| U266B1 linha celular | ATCC | TIB-196 | |
| Água ultrapura | NA | NA | Use água de grau Milli-Q (18 M Ω. cm) para diluir o tampão de lise e o tampão de detecção |
Referências
- Villarino, A., Kanno, Y., O'Shea, J. Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system. Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).
- Hammarén, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. The regulation of JAKs in cytokine signaling and its brea....
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Reimpressões e permissões
