Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הקלטת פעילות רשת במעגלים נוסיקפטיים בעמוד השדרה באמצעות מערכי מיקרו-אלקטרוניקה

Published: February 9, 2022 doi: 10.3791/62920
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1, 1, 2, 1
1School of Biomedical Sciences and Pharmacy, University of Newcastle, 2School of Electrical Engineering, University of Newcastle

Summary

מתואר השימוש המשולב בטכנולוגיית מערך מיקרו-אלקטרודים ובגירוי כימי המושרה על-ידי 4-אמינו-פירידין לחקר פעילות נוציצפטיבית ברמת הרשת בקרן הגבית של חוט השדרה.

Abstract

התפקידים והקישוריות של סוגים ספציפיים של נוירונים בתוך הקרן הגבית של חוט השדרה (DH) מתוחמים בקצב מהיר כדי לספק תצוגה מפורטת יותר ויותר של המעגלים העומדים בבסיס עיבוד הכאב בעמוד השדרה. עם זאת, ההשפעות של קשרים אלה על פעילות רשת רחבה יותר ב-DH נותרות פחות מובנות מכיוון שרוב המחקרים מתמקדים בפעילות של נוירונים בודדים ומיקרו-מעגלים קטנים. לחלופין, השימוש במערכי מיקרו-אלקטרוניקה (MEAs), שיכולים לנטר את הפעילות החשמלית על פני תאים רבים, מספק רזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה של פעילות עצבית. כאן מתואר השימוש ב-MEAs עם פרוסות חוט השדרה של העכבר כדי לחקור את פעילות ה-DH המושרה על-ידי מעגלי DH מגרים כימית עם 4-אמינופירידין (4-AP). הפעילות הקצבית המתקבלת מוגבלת ל-DH השטחי, יציב לאורך זמן, נחסם על ידי טטרודוטוקסין, וניתן לחקור אותה בכיווני פרוסות שונים. יחד, הכנה זו מספקת פלטפורמה לחקור את פעילות מעגלי ה-DH ברקמות מבעלי חיים תמימים, מודלים של בעלי חיים של כאב כרוני ועכברים עם תפקוד נוסיספטיבי שהשתנה גנטית. יתר על כן, הקלטות MEA בפרוסות חוט שדרה מגורות 4-AP יכולות לשמש ככלי סינון מהיר להערכת היכולת של תרכובות אנטי-נוציפטיביות חדשניות לשבש את הפעילות בחוט השדרה DH.

Introduction

התפקידים של סוגים ספציפיים של אינטרנורונים מעכבים ומעוררים בתוך חוט השדרה DH נחשפים בקצב מהיר 1,2,3,4. יחד, אינטרנורונים מהווים יותר מ-95% מהנוירונים ב-DH ומעורבים בעיבוד חושי, כולל nociception. יתר על כן, מעגלי אינטרנורון אלה חשובים כדי לקבוע אם אותות היקפיים עולים על הנוירואקסיס כדי להגיע למוח ולתרום לתפיסת הכאב 5,6,7. עד כה, רוב המחקרים חקרו את תפקידם של נוירוני DH ברמת הניתוח של תא יחיד או שלם באמצעות שילובים של אלקטרופיזיולוגיה תוך-תאית במבחנה, תיוג נוירואנטומי וניתוח התנהגותי in vivo 1,3,8,9,10,11,12,13,14 . גישות אלה קידמו באופן משמעותי את ההבנה של תפקידן של אוכלוסיות נוירונים ספציפיות בעיבוד כאב. עם זאת, נותר פער בהבנת האופן שבו סוגי תאים ספציפיים ומעגלי מאקרו קטנים משפיעים על אוכלוסיות גדולות של תאי עצב ברמת מיקרו-מעגל כדי לעצב לאחר מכן את התפוקה של ה-DH, את התגובות ההתנהגותיות ואת חוויית הכאב.

טכנולוגיה אחת שיכולה לחקור תפקוד מאקרו-מעגלי או רב-תאי ברמה התאית היא מערך המיקרו-אלקטרוניקה (MEA)15,16. MEAs שימשו לחקר תפקוד מערכת העצבים במשך כמה עשורים17,18. במוח, הם סייעו בחקר ההתפתחות העצבית, הפלסטיות הסינפטית, הסינון הפרמקולוגי ובדיקת הרעילות17,18. הם יכולים לשמש הן ליישומי in vitro והן ליישומי in vivo, בהתאם לסוג ה- MEA. יתר על כן, הפיתוח של MEAs התפתח במהירות, עם מספרי אלקטרודות ותצורות שונות הזמינים כעת19. יתרון מרכזי של MEAs הוא היכולת שלהם להעריך בו זמנית את הפעילות החשמלית בתאי עצב רבים עם דיוק מרחבי וטמפורלי גבוה באמצעות אלקטרודות מרובות15,16. זה מספק קריאה רחבה יותר של האופן שבו נוירונים מתקשרים במעגלים וברשתות, בתנאי בקרה ובנוכחות של תרכובות המיושמות באופן מקומי.

אחד האתגרים של ההכנות ל-DH במבחנה הוא שרמות הפעילות השוטפות בדרך כלל נמוכות. כאן, אתגר זה מטופל במעגלי DH של חוט השדרה באמצעות חוסם תעלות K+ המגודר במתח, 4-aminopryidine (4-AP), כדי לעורר כימית מעגלי DH. תרופה זו שימשה בעבר לביסוס פעילות חשמלית סינכרונית קצבית ב- DH של פרוסות חוט שדרה חריפות ובתנאים in vivo חריפים 20,21,22,23,24. ניסויים אלה השתמשו במדבקה חד-תאית ובהקלטה חוץ-תאית או בהדמיית סידן כדי לאפיין פעילות המושרה על-ידי 4-AP 20,21,22,23,24,25. יחד, עבודה זו הדגימה את הדרישה של העברה סינפטית מעוררת ומעכבת וסינפסות חשמליות לפעילות קצבית המושרה על ידי 4-AP. לפיכך, תגובת 4-AP נתפסה כגישה החושפת מעגלי DH פוליסינפטיים מקומיים בעלי רלוונטיות ביולוגית ולא כאפיפנומנון המושרה על ידי תרופה. יתר על כן, פעילות המושרה על ידי 4-AP מציגה פרופיל תגובה דומה לתרופות משככי כאבים ואנטי-אפילפטיות כמצבי כאב נוירופתיים ומשמשת להצעת מטרות חדשות של תרופות משככי כאבים המבוססות על עמוד השדרה כגון קונקסינים 20,21,22.

כאן מתוארת הכנה המשלבת MEAs והפעלה כימית של DH עמוד השדרה עם 4-AP כדי לחקור את המעגלים הנוסיקפטיים האלה במקרו-מעגל, או ברמת האנליזה של הרשת. גישה זו מספקת פלטפורמה יציבה וניתנת לשחזור לחקר מעגלים נוסיקפטיים במצבים 'דמויי כאב' נאיביים ונוירופתיים. הכנה זו ישימה בקלות גם לבדיקת הפעולה ברמת המעגל של משככי כאבים ידועים ולסינון משככי כאבים חדשניים בחוט השדרה ההיפראקטיבי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקרים נערכו על עכברי c57Bl/6 זכרים ונקבות בגילאי 3-12 חודשים. כל ההליכים הניסוייים בוצעו בהתאם לוועדת הטיפול והאתיקה בבעלי חיים של אוניברסיטת ניוקאסל (פרוטוקולים A-2013-312, ו- A-2020-002).

1. אלקטרופיזיולוגיה במבחנה

  1. הכנת פתרונות להכנת ורישום פרוסת חוט השדרה
    1. נוזל מוחי מלאכותי
      הערה: נוזל מוחי מלאכותי (aCSF) משמש בתא דגירה של ממשק, שבו מאוחסנות פרוסות עד לתחילת ההקלטה ובמהלך הניסויים הן כמתפשטות והן כמדוללות לתרופות. ראו טבלה 1 להרכב המפורט.
כימי aCSF (mM) aCSF (g/100 מ"ל) ACSF בתחליף סוכרוז (mM) ACSF בתחליף סוכרוז (g/100 מ"ל) ACSF עתיר אשלגן (mM) ACSF עתיר אשלגן (g/100 מ"ל)
נתרן כלורי (NaCl) 118 0.690 - - 118 0.690
נתרן מימן פחמתי (NaHCO3) 25 0.210 25 0.210 25 0.210
גלוקוז 10 0.180 10 0.180 10 0.180
פוטסיום כלוריד (KCl) 2.5 0.019 2.5 0.019 4.5 0.034
נתרן דיהידרוגן פוספט (NaH2PO4) 1 0.012 1 0.012 1 0.012
מגנזיום קלורייד (MgCl2) 1 0.01 1 0.01 1 0.01
סידן כלוריד (CaCl2) 2.5 0.028 2.5 0.028 2.5 0.028
סוכרוז - - 250 8.558 - -

טבלה 1: הרכבי נוזל מוחי מלאכותי. קיצור: aCSF = נוזל מוחי מלאכותי.

  1. הכן aCSF המכיל (ב- mM) 118 NaCl, 25 NaHCO3, 10 גלוקוז, 2.5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 ו- 2.5 CaCl2 על ידי הוספת הכמויות הנדרשות של האמור לעיל, למעט CaCl2, ל- 2 ליטר של מים מזוקקים.
  2. מקציפים את התמיסה הנ"ל עם קרבוגן (95% O2, 5% CO2) למשך 5 דקות ומוסיפים CaCl2.
    הערה: שלב זה מונע משקעי CaCl2 , כלומר, הפתרון לא אמור להפוך לעכור. ליישום תרופות במהלך ניסויים, דיללו את פתרונות מלאי התרופות ב-aCSF לריכוזים הסופיים הרצויים.
  1. נוזל מוחי מלאכותי בתחליף סוכרוז
    הערה: aCSF בתחליף סוכרוז משמש במהלך דיסקציה וחיתוך חוט השדרה. כפי שצוין על ידי השם, סוכרוז מוחלף על ידי NaCl כדי להפחית את העירור העצבי במהלך הליכים אלה תוך שמירה על osmolarity. ראו טבלה 1 להרכב המפורט.
    1. הכינו aCSF בתחליף סוכרוז המכיל (ב-mM) 250 סוכרוז, 25 NaHCO3, 10 גלוקוז, 2.5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 ו-2.5 CaCl2 על ידי הוספת הכמויות הנדרשות של כל האמור לעיל, למעט CaCl2, ל-300 מ"ל של מים מזוקקים.
    2. מבעבעים את התמיסה עם קרבוגן למשך 5 דקות ולאחר מכן מוסיפים CaCl2.
    3. אחסנו את התמיסה במקפיא של -80 מעלות צלזיוס למשך כ-40 דקות או עד שהתמיסה תיצור תמיסה. הימנעו מהקפאת מוצקים ושימוש בזמן שאתם במרקם עילג.
  1. הכנת מערך מיקרואלקטרודה
    הערה: משטח המגע של ה- MEA דורש טיפול מקדים כדי להפוך אותו להידרופילי.
    1. לפני הניסוי, מלאו את ה-MEA היטב בסרום בקר עוברי (FBS) או בסרום סוסים (HS) למשך 30 דקות.
    2. הסירו את ה-FBS או ה-HS ושטפו היטב את MEA עם כחמש שטיפות של מים מזוקקים עד שהמים המזוקקים כבר לא יהיו מוקצפים. מלא את הבאר ב- aCSF, מוכן לשימוש.
  2. הכנת פרוסת חוט שדרה חריפה
    הערה: הכנת פרוסת חוט השדרה של העכבר היא כפי שתואר בעבר על ידי Smith et al.2. באופן אידיאלי, הסרת ההרחבה הלומבוסקרלית צריכה להימשך לא יותר מ 8-10 דקות (צעדים 1.3.2-1.3.11 להלן).
    1. מרדימים עמוקות את העכבר עם 100 מ"ג/ק"ג קטמין (כלומר) ואז ערפים אותו באמצעות מספריים כירורגיים גדולים.
    2. הסר את העור מעל אזור הבטן על ידי ביצוע חתך קטן בעור ברמת הירכיים. משכו את העור משני צדי החתך באופן רוסטרלי עד להסרת כל העור, כלומר מהחלק העליון של כלוב הצלעות לחלק העליון של האגן (הן בגחון והן בגב).
    3. הניחו את הגוף על קרח והשתמשו בגישה גחונית כדי לחשוף את עמוד השדרה על ידי הסרת כל הקרביים וחיתוך דרך הצלעות לרוחב עצם החזה.
    4. הסר את כלוב הצלעות הגחוני, הן את עצם השכמה (שנחתכה בערך ב-T2), והן את הגפיים התחתונות ואת האגן (שנחתכו בערך בחלק העליון של העצה).
    5. העבירו את עמוד החוליות ואת הכנת הצלעות לאמבטיה מנתקת המכילה סוכרוז קר כקרח aCSF. הצמד את כל ארבע פינות ההכנה (משטח הגחון כלפי מעלה) על ידי הנחת סיכות דרך שרירי הגב התחתון והצלעות העליונות המחוברות.
    6. הסר את כל רקמות השרירים והחיבור שמעל פני השטח הגחוניים של החוליות בעזרת רונג'ורים וזיהה את אזור החוליות מעל ההגדלה הלומבוסקרלית, הנמצאת בערך מתחת לגופי החוליות T12 עד L2.
    7. הסר גוף חוליה שהוא קאודלי לאזור ההרחבה הלומבוסקרלית כדי לספק גישה לחוט השדרה כשהוא יושב בתעלת החוליות.
    8. באמצעות מספריים קפיציים מעוקלים, חותכים דרך פדיקלים חוליות באופן דו-צדדי תוך כדי הרמה ומשיכה של גוף החוליות באופן רוסטרלי כדי להפריד בין ההיבט הגחוני והגבי של החוליות ולחשוף את חוט השדרה.
    9. לאחר הסרת גופי החוליות כדי לחשוף את ההגדלה הלומבוסקרלית, יש לנקות בזהירות את השורשים הנותרים המעגנים את חוט השדרה במספריים קפיציים עד שהחוט צף חופשי.
    10. בודדו את חוט השדרה עם חתכים רוסטרליים וקאודלים הרבה מעל ומתחת להגדלה הלומבוסקרלית, מה שמאפשר לאזור המטרה של החוט 'לצוף חופשי'.
      הערה: כיוון הפרוסה המועדף יקבע כיצד הכבל יורכב לאחר מכן לצורך חתך (איור 1).
    11. עבור פרוסות רוחביות, הרימו את המקטע הלומבוסקרלי על ידי שורש מחובר והניחו אותו על גוש פוליסטירן (קלקר) חתוך מראש (1 ס"מ x 1 ס"מ x 1 ס"מ) עם תעלה רדודה שנחתכה במרכז. השתמשו בדבק ציאנואקרילט (ראו טבלת החומרים) כדי לחבר את הבלוק והכבל לרציף החתך ולמקם אותו באמבט החיתוך המכיל סוכרוז קר כקרח aCSF (slurry).
      הערה: התעלה הרדודה מסייעת לאבטח ולכוון את חוט השדרה, כאשר הצד הגבי חשוף וקצה החזה של החוט בתחתית הבלוק.
    12. עבור פרוסות sagittal, הניחו קו דק של דבק ציאנואקרילט על פלטפורמת החתך, הרימו את ההגדלה הלומבוסקרלית על ידי שורש מחובר, והניחו את הכבל לאורך קו הדבק, תוך הבטחה שמשטח רוחבי אחד נמצא בדבק והשני פונה כלפי מעלה. מניחים אותו באמבט החיתוך המכיל סוכרוז קר כקרח aCSF (slurry).
    13. עבור פרוסות אופקיות, שים קו דק של דבק ציאנואקרילט על פלטפורמת החתך. הרימו את ההגדלה הלומבוסקרלית על ידי שורש מחובר, והניחו את ההגדלה הלומבוסקרלית לאורך קו הדבק, כדי להבטיח שהמשטח הגחוני נמצא בדבק והמשטח הגבי פונה כלפי מעלה. השתמש בשורשים מחוברים כדי למקם את הכבל. מניחים אותו באמבט החיתוך המכיל סוכרוז קר כקרח aCSF (slurry).

Figure 1
איור 1: כיווני פרוסות של חוט השדרה, שיטות הרכבה וחיתוך. (A) פרוסות רוחביות דורשות גוש חיתוך קלקר עם חריץ תומך שנחתך לתוכו. חוט השדרה מונח על הבלוק בחריץ התמיכה, הצד הגבי של החוט פונה הרחק מהגוש. הבלוק והחוט מודבקים על במת חיתוך עם דבק ציאנואקרילט. (B) פרוסות Sagittal מוכנות על ידי הנחת קו דק של דבק ציאנואקרילט על שלב החיתוך ולאחר מכן מיקום חוט השדרה על צדו על גבי הדבק. (C) פרוסות אופקיות מוכנות על ידי הנחת קו דק של דבק ציאנואקרילט על שלב החיתוך ולאחר מכן מיקום הצד הגחוני של חוט השדרה על גבי הדבק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. קבל פרוסות בעובי 300 מיקרומטר (L1-L5, עובי זהה ללא קשר לכיוון) באמצעות מיקרוטום רוטט עם ההגדרות הבאות: מהירות 0.06 מ"מ לשנייה, משרעת 2.50 מ"מ, ומכוילת לסטיית משרעת גובה של ±0.02.
  2. העבירו את הפרוסות לתא דגירה של ממשק אוויר המכיל aCSF מחומצן.
  3. לפני ההקלטה, אפשרו לפרוסות להתאזן במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (20-24 מעלות צלזיוס).
  1. הקלטות מערך מיקרואלקטרודה
    הערה: השלבים הבאים מפרטים כיצד להשתמש בנתוני רשומות מניסויים מבוססי MEA על פרוסות חוט השדרה. ניתן להשתמש במספר עיצובי MEA בהתאם לניסוי. פרטי תכנון עבור MEAs ששימשו בניסויים אלה מוצגים ב טבלה 2 ו תרשים 2. מידע מפורט על העיצוב פורסם על ידי Egert et al.26 ות'יבאו ואחרים.27 עבור MEAs מישוריים ותלת-ממדיים (3D), בהתאמה. שני סוגי ה-MEA מורכבים מ-60 אלקטרודות טיטניום ניטריד, עם שכבת בידוד סיליקון ניטריד ופסי ניטריד טיטניום ומשטחי מגע.
    1. מערך ניסיוני
      1. הפעל את המחשב ואת לוח הממשק, והפעל את תוכנת ההקלטה.
      2. טען את תבנית ההקלטה שהורכבה מראש (איור 3A). תן שם לקבצים עבור היום בכרטיסיית המקליט.
      3. בועה רציפה aCSF עם קרבוגן (5% CO2, 95% O2) למשך הניסוי.
      4. הפעל את מערכת הזלוף, הנשלטת על ידי משאבה פריסטלטית. מקם את קו הכניסה לתוך aCSF ואת קצה הכניסה בכוס פסולת. השלם את קווי הזלוף עם aCSF.
      5. הכן 4-AP וכל פתרון תרופה אחר על ידי דילול מלאי ב-50 מ"ל של aCSF לריכוז הסופי הנדרש (למשל, 200 μM עבור 4-AP).
      6. מניחים את תמיסות התרופות בסירי התרופות ומבעבעים אותן בקרבוגן.
    2. פעילות 4-AP
      1. לאחר הדגירה, מעבירים פרוסה בודדת מהאינקובטור באמצעות פיפטת פסטר בעלת קצה גדול במילוי aCSF.
      2. מקם את הפרוסה היטב ב- MEA והוסף aCSF נוסף.
      3. מקם את הפרוסה מעל מערך ההקלטה של 60 אלקטרודות באמצעות מברשת שיער קצרה ועדינה. הימנעו ממגע עם האלקטרודות עם המכחול או מגרירת הרקמה על פני האלקטרודות, במיוחד אם אתם משתמשים במערכים תלת-ממדיים.
        הערה: בהתאם לפריסת MEA, ניתן לעשות זאת עם או בלי סיוע של מיקרוסקופ למיקום מדויק.
      4. לאחר מיקום הפרוסה, הניחו רשת משוקללת מעל הרקמה כדי להחזיק אותה במקומה ולקדם מגע טוב עם אלקטרודות MEA.
        הערה: ייתכן שיהיה צורך למקם מחדש את הפרוסה לאחר מיקום נטו.
      5. מקם את ה-MEA בראש הבמה של ההקלטה (איור 2A,B).
      6. בדוק את מיקום הרקמה מעל האלקטרודות באמצעות מיקרוסקופ הפוך (הגדלה של פי 2) כדי לאשר שכמה שיותר אלקטרודות נמצאות תחת ה-DH השטחי (SDH). ודאו שלפחות 2-6 אלקטרודות לא ייצרו קשר עם הפרוסה, שכן האלקטרודות האלה חשובות לחיסור רעש ולהקלטת חפצים במהלך האנליזה (איור 2E).
      7. הפעל את המצלמה, חבר אותה למכשיר וקח תמונת ייחוס של הפרוסה ביחס ל- MEA לשימוש במהלך הניתוח.
      8. לחץ על התחל DAQ בתוכנת ההקלטה, ואשר שכל האלקטרודות מקבלות אות ברור.
        הערה: אם האות רועש, פתחו את הבמה ונקו גם את רפידות המגע של MEA וגם את המגעים עם קפיץ הזהב עם 70% אתנול (השתמשו במגבון מעבדה כדי לוודא שהפדים והמגעים יבשים לאחר הניקוי). אם האות עדיין רועש, כבה את האלקטרודות הלא תקינות בתוכנת ההקלטה או רשום להדרה מאוחר יותר במהלך הניתוח.
      9. חברו את קווי הכניסה והיציאה של ה-perfusion ל-MEA-well (שבעבר היה מלא ב-aCSF) והפעילו את מערכת הזלוף. בדקו את קצב הזרימה, באופן אידיאלי 4-6 נפחי אמבטיה לדקה, וודאו שהזרימה מספיקה כדי למנוע הצפה של ה-superfusate.
      10. אפשר לרקמה להתאזן במשך 5 דקות ולאחר מכן להקליט 5 דקות של נתוני בסיס גולמיים ולא מסוננים.
      11. הזז את קו הכניסה של פרפוזיה מ-aCSF לתמיסת 4-AP והמתן 12 דקות עד שהפעילות הקצבית המושרה על-ידי 4-AP תגיע למצב יציב (2 דקות עד שהתרופות יגיעו לאמבטיה ו-10 דקות עד שהפעילות תגיע לשיא ואז תיפול).
      12. רשמו 5 דקות של פעילות המושרה על ידי 4-AP. היו מוכנים להקלטות הבאות כדי לבדוק את התרופות או כדי לבדוק את היציבות של 4-AP.
פריסות מערך מיקרואלקטרודה
מודל מערך מיקרואלקטרודה 60MEA 200/30iR-Ti 60-3DMEA 100/12/40iR-Ti 60-3DMEA 200/12/50iR-Ti 60MEA 500/30iR-Ti
מישורי או תלת-ממדי (תלת-ממדי) מישורי 3D 3D מישורי
רשת אלקטרודות 8 x 8 8 x 8 8 x 8 6 x 10
מרווח אלקטרודות 200 מיקרומטר 100 מיקרומטר 200 מיקרומטר 500 מיקרומטר
קוטר אלקטרודה 30 מיקרומטר 12 מיקרומטר 12 מיקרומטר 30 מיקרומטר
גובה אלקטרודה (3D) N/A 40 מיקרומטר 50 מיקרומטר N/A
ניסויים פרוסה רוחבית פרוסה רוחבית סגיטל + אופקי סגיטל + אופקי

טבלה 2: פריסות מערך מיקרו-אלקטרוניקה.

Figure 2
איור 2: מיקום רקמות על מערך המיקרו-אלקטרוניקה. (A) התמונה מציגה ראש MEA פתוח עם MEA הממוקם במקומו. (B) זהה ל-A עם ראש MEA סגור לצורך הקלטות ומערכת זלוף רקמות במקום. (C) התמונה מציגה MEA כפי שסופק על-ידי היצרן. מוצגות רפידות מגע, המתממשקות עם קפיצי הזהב של הבמה הראשית, ואמבט הרקמות MEA המחזיק את תמיסת הרחצה ברקמות ואת פרוסת הרקמות. השטח המודגש על ידי הריבוע האדום במרכז הוא המיקום של מערך האלקטרודות. (D) סכמות מציגות את שתי תצורות האלקטרודות של MEA ששימשו במחקר זה, עם פרטים נוספים המוצגים בטבלה 2. אלקטרודת הייחוס מסומנת על ידי הטרפז הכחול. פריסת האלקטרודות השמאלית של MEA מציגה תצורה מרובעת של 60 אלקטרודות, המשמשת בעיקר במודלי העבודה המוצגים 60MEA200/30iR-Ti עם אלקטרודות בקוטר 30 מיקרומטר במרווחים של 200 מיקרומטר זה מזה, או 200 μm מרווחים ו- 100 μm מרווחים 3-ממדיים MEAs (60MEA200/12/50iR-Ti ו- 60MEA100/12/40iR-Ti) עם אלקטרודות בקוטר 12 מיקרומטר ו-50 מיקרומטר או 40 מיקרומטר גובה, בהתאמה. פריסת אלקטרודות MEA השמאלית מציגה פריסה מלבנית של 6 x 10 אלקטרודות-60MEA500/30iR-Ti. (E) תמונה בהגדלה גבוהה של MEA מרובע 60MEA100/12/40iR-Ti עם פרוסת חוט שדרה רוחבית הממוקמת להקלטה. הפרוסה יושבת על שורות אלקטרודות 3-8. השורה העליונה של האלקטרודות, שאינן נוגעות בשום רקמה, משמשות כאלקטרודות ייחוס. אזור ה-SDH מופיע כלהקה חצי-שקופה. במקרה זה, ה-SDH מכסה את האלקטרודות בשורות 4, 5 ו-6 ואת העמודות 2, 3, 4, 5 ו-7 של ה-MEA. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. קיצורים: MEA = מערך מיקרואלקטרודה; SDH = קרן גב שטחית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. שינוי פרוסות
    1. לאחר כל סשן הקלטה, שטפו את השורות עם aCSF.
    2. הסר את ה- MEA מהבמה הראשית.
    3. הסר את הרשת ואת הרקמה מבאר ה- MEA, שטפו אותם היטב עם aCSF, וחזור על השלבים לעיל עם פרוסה חדשה.

2. עיבוד וניתוח נתונים

הערה: השלבים הבאים מפרטים כיצד להשתמש בתוכנת הניתוח עבור ניסויי MEA על פרוסות חוט השדרה. אחת מ-60 האלקטרודות משמשת כיחוס פנימי (מסומן על ידי טרפז באיור 2 C,D), בעוד שבין ארבע ל-25 מתוך 59 הנותרות ממוקמות מתחת ל-SDH בפרוסת חוט השדרה של עכבר בוגר. ניתוח מאוחר יותר מזהה צורות גל של פוטנציאל פעולה חוץ-תאי (EAP) ופוטנציאל שדה מקומי (LFP) (ראו איור 3B לדוגמה) מהאות הגולמי באזור זה.

  1. עיבוד נתונים גולמי
    1. פתחו את תוכנת הניתוח וטענו את פריסת הניתוח המוכנה מראש (איור 3B).
    2. פתח את הקובץ המעניין ובטל את הבחירה באלקטרודת הייחוס (אלקטרודה 15 ב- 8 x 8 MEA - או אלקטרודה E1 בתצורת 6 x 10 MEA) וכל אלקטרודות הנחשבות רועשות יתר על המידה.
    3. הגדר את חלון הזמן לניתוח (0:00 → 5:00 דקות).
    4. מעבר לכרטיסיה מסנן חוצה ערוצים . בחר הפניה מורכבת ובחר את אלקטרודות הייחוס על סמך התמונה שצולמה וההערות שנעשו במהלך הניסוי (כלומר, אלקטרודות שאינן מתחת לרקמה). כדי להחיל ולבדוק זאת, הקש על גלה לפני שתמשיך.
    5. עבור לכרטיסיית המסנן EAP והחיל מסנן Butterworth בעל מעברגבוה מסדר שני (200 הרץ מנותק) כדי להסיר פעילות LFP.
    6. עבור לכרטיסיית המסנן LFP והחל מסנן פס מסדרשני במסנן Butterworth (תדרי דלתא של 0.5-4 הרץ) כדי להסיר פעילות EAP.
    7. עבור לכרטיסיה גלאי EAP ובחר סף אוטומטי. סמן תיבות קצה עולות ויורדות והגדר את זמן המת ל- 0.5 אלפיות השנייה.
    8. הגדר ערכי סף חיוביים ושליליים בהתבסס על הנתונים. בדוק את הנתונים על-ידי חזרה למסך מנתח הנתונים Raw, הזזת סמן הזמן ולאחר מכן חזרה לכרטיסיית גלאי EAP והקשה על Explore. חזרו על הפעולה עד שתשביעות רצון מכך שסף הזיהוי המוגדר הוא לכידת EAPs מבלי ללכוד רעש/פעילות לא פיזיולוגית. השתמש באלקטרודות הייחוס כדי לזהות רעש/ פעילות לא פיזיולוגית.
      הערה: יש צורך להבטיח מספר מינימלי של EAPs מזוהים באלקטרודות ייחוס שבהן פעילות פיזיולוגית לא תתרחש. עם זאת, סטיות קלות למדי בנקודת ההתחלה עשויות להיות מזוהות באופן שגוי כ- EAPs. זאת, תוך כדי שאיפה למקסם את מספר האירועים הממשיים שזוהו באלקטרודות הפעילות.
    9. עבור לכרטיסיה גלאי LFP, בחר את הסף הידני, סמן את התיבות קצה עולה ויורד והגדיר את זמן המת ל- 3 אלפיות השנייה.
    10. חזור על שלב 2.1.8 עבור אלקטרודה אחת על ידי בחירת אלקטרודה עם פעילות LFP. לאחר ההשבעה, בחר החל על כולם , שכן ערכי סף יוחלו רק על אלקטרודה אחת בעת ביצוע סף ידני.
    11. בעת בחינת נתוני LFP בכרטיסייה גלאי , שים לב למספר המרבי של מעברי סף עבור צורת הגל LFP אחת ולהפרדת זמן מקסימלית של מעברי סף עבור צורת הגל LFP אחת לשימוש בניתוח מאוחר יותר.
    12. לחץ על התחל ניתוח.
    13. כאשר הניתוח הושלם, עבור לכרטיסיה מנתח EAP וייצא את הנתונים. בצע את אותו הדבר בכרטיסיית מנתח LFP .
    14. חזור על תהליך זה עבור כל הקבצים האחרים מאותה פרוסה.
    15. לאחר ייצוא נתונים, המר את הקבצים לתבנית xlsx כך שניתן יהיה לקרוא אותם על-ידי סקריפט התכנות שבו נעשה שימוש. תן שם לקבצים על פי המוסכמה הבאה עבור הסקריפט שסופק כדי לקרוא אותם: שם הניסוי (למשל, נתוני דגימה) - מספר פרוסה (למשל, S1) - מספר הקלטה (למשל, R1) - סוג פעילות (למשל, קוצים או SPs, המתאימים ל- EAPs או LFPs, בהתאמה).
      הערה: ניתוח ה-EAP המתואר כאן מתייחס לעלייה חדה מהתעלות הבודדות כאל אוכלוסייה אחת, אף על פי שפעילות זו תנבע בדרך כלל ממספר תאי עצב בסמיכות לאלקטרודת ההקלטה. אם יש צורך במספר הנוירונים התורמים ל-EAPs בתעלה, ניתן ליישם טכניקות מיון מרובות-חלקיקים המתוארות במקומות אחרים כדי להבחין בין אוכלוסיות נפרדות של קוצים בהתבסס על מאפייני צורת גל28.

Figure 3
איור 3: פריסות כלי הקלטה וניתוח נתונים ורישומי מערך מיקרו-אלקטרוניקה לדוגמה המציגים פוטנציאל פעולה חוץ-תאי וצורות גל פוטנציאליות של שדה מקומי. קישור ה-MEA2100 וכלי ההקלטה (headstage/amplifier) מאפשר לתת לנתונים שם ולשמור אותם. ארבע עקבות לדוגמה של נתונים גולמיים (מימין, תקופות של 5 דקות) נאספו על ידי ערוץ MEA אחד המציג פעילות בנקודת ההתחלה, 12 דקות לאחר יישום 4-AP, 15 דקות נוספות לאחר פעילות 4-AP מבוססת, ובעקבות יישום אמבטיה של TTX (1 μM). שים לב, התוספת של 4-AP (עקבות שניים) מייצרת עלייה ברורה ברעשי הרקע ובפעילות EAP/LFP. חשוב לציין שהפעילות נשארת יציבה יחסית במשך 15 דקות לפחות לאחר שנקבעה פעילות המושרה על ידי 4-AP (עקבות שלישיים). תוספת של TTX (1 μM) מבטלת את כל הפעילות (עקבות תחתונים). (B) סכמטי (משמאל) מציג תצורת תוכנת מנתח לניתוח נתונים. כלי סייר הנתונים הגולמי משמש לייבוא הקלטות שנאספו על ידי תוכנת הקלטה. נתונים אלה מריצים לאחר מכן באמצעות כלי סינון חוצה ערוצים שמחסיר את אותות האלקטרודות הייחוס שנבחרו מאלקטרודות אחרות כדי להסיר רעשי רקע. הנתונים עוברים דרך מסנן EAP וכלי הסינון של LFP כדי למטב את יחסי האות לרעש עבור כל צורת גל. לאחר שלב זה, נתוני נתיב ה- EAP נכנסים לכלי גלאי EAP, שבו מוגדרים ערכי סף. EAPs מזוהים ולאחר מכן נשלחים לכלי ניתוח EAP שבו העיכובים של כל אירוע נרשמים ומיוצאים כ- txt. קובץ. זרימת עבודה זהה מתרחשת עבור נתוני LFP באמצעות ערכת כלים תואמת של LFP. עקבות ימניים מראים נתונים מערוץ MEA יחיד המכיל צורות גל חוץ-תאיות שונות. המיקום של אותות EAP ו-LFP מודגשים ב'ספירת רסטרים' לעיל. עקבות תחתונים הם תקופות מהקלטה עליונה (המסומנות בפסים אדומים) המציגות צורות גל על ציר זמן מורחב, כולל אותות LFP שונים (שימו לב למגוון ההופעות) ו-EAPs חוץ-תאיים בודדים (עיגולים אדומים). שימו לב, צורת הגל והקוטביות של LFP/EAP משתנות ביחס למספר הנוירונים שמייצרים את האותות האלה, לקרבתם לאלקטרודת ההקלטה ולמיקומה ביחס לאלקטרודות הסמוכות. קיצורים: MEA = מערך מיקרואלקטרודה; EAP = פוטנציאל פעולה חוץ-תאי; LFP = פוטנציאל שדה מקומי; 4-AP = 4-אמינופירידין; TTX = טטרודוטוקסין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. ניתוח סינכרוניזציה
    הערה: סינכרוניות, או מספר האירועים ה'מקריים' בין שתי אלקטרודות, נקבעה באמצעות קריטריון צירוף המקרים בשיטת הסינכרון A-SPIKE המתוארת על ידי Satuvuori et al. 29. הכתב המשמש כאן משווה רק אלקטרודות הסמוכות זו לזו לצורך יעילות (כלומר, שכנים אופקיים, אנכיים ואלכסוניים); עם זאת, ניתן היה לשכתב את התסריט כדי להשוות את כל האלקטרודות במידת הצורך.
    1. בצע ניתוח נתונים באמצעות סקריפט תכנות מותאם אישית, אשר מחלץ חותמות זמן השהיה עבור כל אלקטרודה מקבצי .xlsx.
      הערה: ניתן לעשות זאת באופן ידני.
    2. בשלב 2.1.11, רשום את המספר המרבי של מעברי סף והפרדת זמן מקסימלית של מעברי סף עבור צורת הגל LFP אחת. שנה את קובץ ה- Script להזנת פרמטרים אלה המגדירים LFP עבור כל פרוסה לפני הפעלת קובץ ה- Script.
      הערה: בדיקת סף שבוצעה בעבר בתוכנת ניתוח לוכדת בבירור EAPs כאירוע יחיד. עם זאת, LFPs מורכבים ממספר משתנה של פסגות בהתאם לצורת צורת הגל ולמספר מעברי הסף הבאים על ידי האירוע האחד.
    3. שנה את התסריט כדי להזין את האלקטרודות המעניינות לפני הניתוח.
    4. כדי לקבוע סינכרוניות (המוגדרת בכתב-Script על-ידי מסגרות זמן ניתנות לשינוי כדי שפעילות סינכרונית תתרחש בתוכה), הפרד ונתח את ההפסקות שחולצו כדי לזהות אירועים מקריים.
      הערה: הסקריפט מאפשר להגדיר את הזמן המרבי בין אירועים מקריים. אלה מוגדרים על 20 אלפיות השנייה עבור EAPs ו-200 אלפיות השנייה עבור LFPs.
    5. הפעל את קובץ ה- Script כדי לחלץ חותמות זמן של השהיה.
      הערה: קובץ הפלט .xlsx מכיל את הפרשנויות של נתוני השהיה, שהם ספירות EAP ו- LFP, תדרים וספירת אירועים מקריים עבור אלקטרודות בודדות ופרוסות שלמות. נתונים אלה משמשים להערכת התדירות, ספירות EAP/LFP, מספר האלקטרודות הפעילות, מספר האירועים המקריים, מספר האלקטרודות המקושרות והעוצמה הממוצעת של קשרים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מודל פעילות הרשת בקרן הגב של חוט השדרה
יישום של 4-AP משרה באופן אמין פעילות קצבית סינכרונית בחוט השדרה DH. פעילות כזו מציגה כ-EAPs ו-LFPs מוגברים. האות המאוחר יותר הוא צורת גל בתדר נמוך, אשר תוארה בעבר בהקלטות MEA30. שינויים בפעילות ה-EAP ו/או ה-LFP בעקבות יישום התרופה משקפים שינוי בפעילות העצבית. דוגמאות ל-EAPs ול-LFPs מוצגות באיור 3B ובאיור 4. ההתמקדות כאן היא בפרמטרים או בתכונות הבאות של נתוני EAP/LFP: תדר, ספירות כוללות, ספירות אלקטרודות פעילות, סינכרוניות כפי שהיא מאופיינת במספר האירועים המקריים שזוהו על פני אלקטרודות מרובות, מספר האלקטרודות הסמוכות המקושרות וחוזק הקשרים בין אלקטרודות סמוכות סמוכות. תוצאות מייצגות מוצגות בטבלה 3 ובאיור 3, איור 4, איור 5, איור 6, איור 7 ואיור 8. הם מראים עלייה משמעותית בכל הפרמטרים שנמדדו (כל p<0.001 על ידי מבחן t מזווג או מבחן שווה ערך לא פרמטרי של Wilcoxon Sign-Rank) הן עבור EAPs (איור 5 ואיור 6) והן עבור LFPs (איור 7 ואיור 8) לאחר גירוי 4-AP ולאחר מכן יציבות יחסית לשאר ההקלטות. הנתונים נבדקו לנורמליות לפני הניתוח הסטטיסטי. לסיכום, 4-AP גורם לפעילות EAP ו-LFP בחוט השדרה DH, וניתן לחלץ תכונות שונות של הנתונים מהקלטות MEA. הפעילות ניתנת לשחזור, וחלק גדול מהפעילות, במיוחד עבור LFPs, היא קצבית וסינכרונית.

תכונת פעילות בסיסית 4-אמינופירידין הבדל משמעותי
פוטנציאל פעולה חוץ-תאי (EAPs)
תדירות 0.07 ± 0.01 0.88 ± 0.09 עמ<0.001
סה"כ ספירת ספייק 261.41 ± 70.62 3289. 57 ± 484.38 עמ<0.001
ספירת אלקטרודות אקטיבית 2.36 ± 0.34 8.95 ± 0.68 עמ<0.001
מספר קוצים מקריים 9.26 ± 4.01 966.94 ± 189.21 עמ<0.001
מספר אלקטרודות מקושרות 2.03 ± 0.42 24.06 ± 1.96 עמ<0.001
חוזק הקשרים בין האלקטרודות 1.97 ± 0.58 29.13 ± 4.60 עמ<0.001
פוטנציאל שדה מקומי (LFPs)
תדירות 0.00 ± 0.00 0.28 ± 0.03 עמ<0.001
סה"כ ספירת ספייק 4.79 ± 0.82 688.47 ± 121.16 עמ<0.001
ספירת אלקטרודות אקטיבית 0.41 ± 0.16 7.64 ± 0.73 עמ<0.001
מספר קוצים מקריים 0.43 ± 0.23 108.06 ± 278.22 עמ<0.001
מספר אלקטרודות מקושרות 0.24 ± 0.15 22.91 ± 2.46 עמ<0.001
חוזק הקשרים בין האלקטרודות 0.34 ± 0.19 29.20 ± 3.59 עמ<0.001

טבלה 3: פעילות המושרה על ידי 4-אמינופירידין. כולם מוצגים כאמצעים ± SEM.

Figure 4
איור 4: פעילות פוטנציאלית של פעולה חוץ-תאית בסיסית לדוגמה. הפאנלים מציגים פעילות EAP (ההקלטות הן מפרוסות שונות). רוב האלקטרודות בהקלטת פרוסה נתונה לא הראו פעילות EAP בסיסית (לוח עליון). EAPs ספורדיים בתדר נמוך נצפו מדי פעם בנקודת ההתחלה, וייתכן שהם מכילים צורות גל ספייק מרובות (לוח אמצעי). פעילות EAP בתדר גבוה נצפתה רק לעתים רחוקות בהקלטות בנקודת ההתחלה (פאנל תחתון). ערכות כניסה מציגות EAPs בודדים מהקלטות מתאימות על ציר זמן מורחב. קיצור: EAP = פוטנציאל פעולה חוץ-תאי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

כיוון פרוסה
מעגלי ה- DH המופעלים על ידי 4-AP מחוברים בכל שלושת הממדים. לפיכך, כיוון פרוסה הוא שיקול חשוב להכנות במבחנה . חיתוך סגיטלי או אופקי עשוי להיות מועדף לצפייה באיתות בין-סגמנטלי, בעוד שפרוסות רוחביות משמרות טוב יותר את הקישוריות הבינונית והדורסו-ונטרלית. בהתחשב בשיקולים אלה, ניתן לראות כי גירוי 4-AP גורם לפעילות קצבית דומה ב-SDH, ללא קשר לכיוון פרוסה (ראו איור 9).

יציבות ארוכת טווח של פעילות מושרית 4-AP
היציבות של פעילות המושרה על ידי 4-AP היא כמובן חיונית כאשר בוחנים את ההשפעות של תרופות יישומיות. לכן, מאופיינת היציבות של פרמטרי פעילות המושרים על-ידי 4-AP, וזו מוצגת באיור 5, איור 6, איור 7 ואיור 8 וטבלה 4. כל מאפייני הפעילות, בתוספת צירוף המקרים של הפעילות עבור LFPs, היו יציבים בהתבסס על הדמיון של פעילות המושרה על ידי 4-AP ב-12 דקות לאחר יישום 4-AP ו-15 דקות מאוחר יותר (עמ' >0.05). מאפייני סינכרוניזציה אחרים של LFP, מספר האלקטרודות הסמוכות המקושרות וחוזק הקישור בין אלקטרודות סמוכות ירדו במשך 15 דקות (p=0.016 ו-p=0.033, בהתאמה), אם כי ההבדל היה צנוע. ניתן היה להבחין בקלות בשינוי הדרגתי זה מהפעולות המיידיות יותר של תרופת בדיקה במהלך מחקרים פרמקולוגיים (ראו להלן). הנתונים נבדקו עבור התפלגות נורמלית לפני השוואות סטטיסטיות ולאחר מכן הוערכו באמצעות מבחני t זוגיים או מבחני Wilcoxon Sign-Rank שאינם פרמטריים לפי הצורך.

תכונת פעילות 4-אמינופירידין 4-אמינופירידין (15 דקות) הבדל משמעותי
פוטנציאל פעולה חוץ-תאי (EAPs)
תדירות 0.8 ± 0.13 0.85 ± 0.10 p>0.05 (ללא דיפרנציאציה)
סה"כ ספירת ספייק 2706.36 ± 510.96 2838.09 ± 447.73 p>0.05 (ללא דיפרנציאציה)
ספירת אלקטרודות אקטיבית 9.32 ± 0.70 10.09 ± 0.56 p>0.05 (ללא דיפרנציאציה)
מספר קוצים מקריים 1037.63 ± 306.84 1013.09 ± 269.80 p>0.05 (ללא דיפרנציאציה)
מספר אלקטרודות מקושרות 22.00 ± 3.37 22.41 ± 2.56 p>0.05 (ללא דיפרנציאציה)
חוזק הקשרים בין האלקטרודות 30.44 ± 6.27 31.88 ± 7.68 p>0.05 (ללא דיפרנציאציה)
פוטנציאל שדה מקומי (LFPs)
תדירות 0.25 ± 0.03 0.17 ± 0.03 p>0.05 (ללא דיפרנציאציה)
סה"כ ספירת ספייק 792.32 ± 155.83 546.32 ± 120.93 p>0.05 (ללא דיפרנציאציה)
ספירת אלקטרודות אקטיבית 9.50 ± 1.11 7.86 ± 1.00 p>0.05 (ללא דיפרנציאציה)
מספר קוצים מקריים 1631.27 ± 734.77 1073.00 ± 490.85 p>0.05 (ללא דיפרנציאציה)
מספר אלקטרודות מקושרות 26.68 ± 4.58 20.95 ± 3.68 עמ' <0.05
חוזק הקשרים בין האלקטרודות 33.35 ± 6.19 24.81 ± 5.41 עמ' <0.05

טבלה 4: יציבות פעילות 4-אמינופירידין. כולם מוצגים כאמצעים ± SEM.

חקירה פרמקולוגית של מאפייני הפעילות
כדי להוכיח שפעילות המושרה על ידי MEA 4-AP ניתנת להתאמה בקלות למניפולציות פרמקולוגיות, הודגשה התלות של אותות אלה בפריקה פוטנציאלית לפעולה. יישום האמבטיה של אנטגוניסט תעלת הנתרן המגודר במתח, טטרודוטוקסין (TTX, 1 μM), ביטל הן את פעילות ה- EAP והן את פעילות ה- LFP, ואישר את תלות הספייק של אותות אלה. עקבות לדוגמה מוצגים באיור 3A. תוצאה זו מספקת גם דוגמה לתועלת של ההכנה לחקירות פרמקולוגיות עתידיות, שבהן ניתן להעריך תרכובות חדשות ומשככי כאבים מבוססים לפעולתם במעגלי DH מופעלים בעמוד השדרה. לבסוף, כדי לשפוך אור נוסף על הרלוונטיות של הפעלת 4-AP של רשתות DH, נוסתה גישה חלופית להשגת דה-פולריזציה צנועה של רשת DH. בגישה זו, תמיסת aCSF מוגברת של אשלגן (4.5 mM) (טבלה 1) יושמה באמבטיה והוכחה כמעוררת תגובת DH דומה לגירוי 4-AP. מניפולציה זו עוררה פעילות LFP שהציגה את אותם מאפיינים סינכרוניים כמו תגובות המושרות על ידי 4-AP (איור 10), מה שמרמז על מנגנון דומה ומעגלים בסיסיים.

Figure 5
איור 5: דוגמה לפעילות פוטנציאלית של פעולה חוץ-תאית הנגרמת על-ידי 4-אמינופירידין. (A) חלקות רסטר מציגות פעילות EAP מערוצים פעילים, שזוהו בנקודת ההתחלה (העליונה) ושתי נקודות זמן (12 דקות - הוקמה, ו-27 דקות) לאחר תוספת אמבטיה של 4-AP (אמצע ולמטה). חלונות כחולים אנכיים מדגישים תקופות של פעילות סינכרונית (השהיה קרובה) ביותר מ-5 אלקטרודות הקלטה. (B) לוחות מסכמים ניתוח מפת פעילות EAP של נתוני MEA. סכמת שמאל מראה את הכיוון של פרוסת חוט השדרה ביחס למערך האלקטרודות. הפאנל השמאלי האמצעי מסכם את הפעילות בנקודת ההתחלה (אלקטרודות פעילות הצבועות באדום) ובתדר EAP המסומן על ידי הצללה לבנה סביב אלקטרודות פעילות (עוצמת ההצללה מציינת פעילות מוגברת). החלונית הימנית האמצעית מציגה את הפעילות באותה פרוסה לאחר 12 דקות של חשיפה של 4-AP. שימו לב, מספר האלקטרודות הפעילות (אדום) גדל יחד עם תדר EAP. בנוסף, סינכרוניזציה בין אלקטרודות סמוכות מסומנת על ידי קווים מקשרים אדומים, המייצרים מפת רשת של פעילות (עובי הקו מציין את מידת הדמיון של EAP בין אלקטרודות). החלונית הימנית מציגה את הפעילות באותה פרוסה לאחר 15 דקות נוספות של חשיפה של 4-AP. שימו לב שמספר האלקטרודות הפעילות (אדום), מידת פעילות ה-EAP (לבן) ומבנה הרשת (קווים אדומים) נותרו יציבים בתקופה זו. קיצורים: 4-AP = 4-אמינופירידין; EAP = פוטנציאל פעולה חוץ-תאי; MEA = מערך מיקרו-אלקטרוניקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: סיכום נתונים קבוצתיים של פעילות פוטנציאלית של פעולה חוץ-תאית הנגרמת על-ידי 4-aminopyridine. (A-F) תרשימי נתונים קבוצתיים המסכמים תכונות EAP ממספר ניסויים זהים לנתוני EAP המוצגים באיור 4 (הנתונים מסוכמים גם בטבלה 3 ובטבלה 4). תדר EAP (A), ספירה (B), אירועים מקריים (C), אלקטרודות פעילות (D), אלקטרודות מקושרות (E) וחוזק הצמדה ממוצע (F) עלו לאחר יישום אמבטיה של 4-AP ולאחר מכן היו יציבים במשך 15 דקות לאחר הקמת פעילות המושרה על ידי 4-AP. הנתונים הם מ-11 ניסויים (הנתונים באדום הם מהניסוי באיור 5). קיצורים: 4-AP = 4-אמינופירידין; EAP = פוטנציאל פעולה חוץ-תאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: פעילות פוטנציאלית של שדה מקומי המושרה על-ידי 4-אמינופירידין. הנתונים מוצגים כמו באיור 5 למעט נתוני LFP. (A) חלקות רסטר מציגות פעילות LFP ממספר ערוצים, שזוהו בנקודת ההתחלה (העליונה) ובשתי נקודות זמן (12 דקות - הוקמה, ו-27 דקות) לאחר הוספת אמבטיה של 4-AP (אמצע ולמטה). חלונות כחולים אנכיים מדגישים תקופות של פעילות סינכרונית (השהיה קרובה) ביותר מ-5 אלקטרודות הקלטה. (B) לוחות מסכמים ניתוח מפת פעילות LFP של נתוני MEA. סכמת שמאל מראה את הכיוון של פרוסת חוט השדרה ביחס למערך האלקטרודות. הפאנל השמאלי האמצעי מסכם את הפעילות בנקודת ההתחלה (אלקטרודות פעילות הצבועות באדום), עם תדירות LFP מינימלית המסומנת על ידי הצללה לבנה סביב אלקטרודות פעילות (עוצמת ההצללה מציינת פעילות מוגברת). החלונית הימנית האמצעית מציגה את הפעילות באותה פרוסה לאחר 12 דקות של חשיפה של 4-AP. מספר האלקטרודות הפעילות (אדום) ותדר LFP גדל באופן משמעותי. בנוסף, סינכרוניזציה בין אלקטרודות סמוכות (קווים מקשרים אדומים) מראה מפת רשת חזקה של פעילות LFP (עובי הקו מציין את מידת הדמיון בין האלקטרודות). החלונית הימנית מציגה את פעילות ה-LFP באותה פרוסה לאחר 15 דקות נוספות של חשיפה ל-4-AP. שימו לב שמספר האלקטרודות הפעילות (אדום), מידת פעילות ה-LFP (לבן) ומבנה הרשת (קווים אדומים) יציבים יחסית בתקופה זו. קיצורים: 4-AP = 4-אמינופירידין; MEA = מערך מיקרו-אלקטרוניקה; LFP = פוטנציאל שדה מקומי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 8
איור 8: סיכום נתונים קבוצתיים של פעילות פוטנציאלית בשדה מקומי המושרה על-ידי 4-aminopyridine. (A-F) שרטוטי נתונים קבוצתיים המסכמים תכונות LFP ממספר ניסויים זהים לנתוני EAP המוצגים באיור 7 (הנתונים מסוכמים גם בטבלה 3 ובטבלה 4). תדירות LFP (A), ספירה (B), אירועים מקריים (C) ואלקטרודות פעילות (D) היו יציבות במשך 15 דקות לאחר שאפקט 4-AP הגיע לשיאו (הנתונים באדום הם מהניסוי באיור 7). עם זאת, אלקטרודות מקושרות (E) וחוזק הקישור הממוצע של LFP (F) ירדו עם הזמן (שניהם p<0.05). הנתונים הם מ-11 ניסויים (הנתונים באדום הם מהניסוי באיור 7). קיצורים: 4-AP = 4-אמינופירידין; LFP = פוטנציאל שדה מקומי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 9
איור 9: פוטנציאל פעולה חוץ-תאית המושרה על-ידי 4-Aminopyridine ופעילות פוטנציאלית של שדה מקומי בפרוסות סגיטליות ואופקיות. לוחות מסכמים את פעילות ה-EAP וה-LFP בניתוח מפת רשת MEA של איתות המושרה על-ידי 4-AP בפרוסות חוט השדרה הסגיטלי (A) והאופקי (B). סכמות (משמאל) מראות את הכיוון של פרוסות חוט השדרה ביחס למערכי אלקטרודות מלבניים. מפות רשת שמאליות מציגות את פעילות ה-EAP וה-LFP הבסיסית בפרוסות חוט השדרה הסגיטליות (A) והאופקיות (B) (האלקטרודות הפעילות הן אדומות, התדירות מסומנת על ידי עוצמת ההצללה הלבנה, וסינכרון בין אלקטרודות סמוכות על ידי קווי חיבור אדומים עם עובי המציין את מידת הסינכרון). מפות רשת ימניות מציגות פעילות EAP ו-LFP באותה פרוסה לאחר 12 דקות של חשיפה של 4-AP בפרוסות חוט השדרה הסגיטלי (A) והאופקי (B). שים לב לעלייה המשמעותית במספר האלקטרודות הפעילות, תדירות הפעילות והסינכרון של אותות אלה לאחר חשיפה של 4-AP, חשיפת רשתות בשני כיווני הפרוסה. קיצורים: MEA = מערך מיקרואלקטרודה; EAP = פוטנציאל פעולה חוץ-תאי; LFP = פוטנציאל שדה מקומי; 4-AP = 4-אמינופירידין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 10
איור 10: פעילות גבוהה של אשלגן (K++ גבוה) המושרה על-ידי פעילות פוטנציאלית בשדה המקומי. לוחות מסכמים פעילות LFP גבוהה של K+ (4.5 mM) המושרה על ידי aCSF. (A) עקבות לדוגמה מערוץ MEA אחד בנקודת ההתחלה ולאחר תוספת אמבטיה של K+ aCSF גבוה (תקופות של 5 דקות). העלאת ריכוז K+ יצרה פעילות LFP ברורה שנעדרה בנקודת ההתחלה, בדומה לזו שנראתה ביישום 4-AP (איור 3). Inset מציג צורת גל LFP על ציר זמן מורחב. (B) לוחות מסכמים את פעילות רשת LFP המושרה על ידי K+ aCSF גבוה. שרטוט שמאלי מראה כיוון של פרוסות חוט השדרה ביחס למערכי אלקטרודות מרובעים. מפות רשת משווות בין פעילות LFP בסיסית ופעילות LFP גבוהה של K+-evoked (אלקטרודות פעילות אדומות, תדירות המסומנת על ידי עוצמת הצללה לבנה, וסינכרוניזציה בין אלקטרודות סמוכות על ידי קווי חיבור אדומים עם עובי המציין את מידת הסינכרון). שים לב לעלייה המשמעותית במספר האלקטרודות הפעילות, תדירות הפעילות והסינכרון של אותות אלה לאחר חשיפה גבוהה ל- K+ aCSF, חשיפת הרשת הבסיסית באופן דומה ל- 4-AP. קיצורים: aCSF = נוזל מוחי מלאכותי; MEA = מערך מיקרו-אלקטרוניקה; EAP = פוטנציאל פעולה חוץ-תאי; LFP = פוטנציאל שדה מקומי; 4-AP = 4-אמינופירידין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות החשיבות של DH עמוד השדרה באיתות, עיבוד, והתגובות ההתנהגותיות והרגשיות הנובעות מכך המאפיינות כאב, המעגלים בתוך אזור זה נותרים לא מובנים היטב. אתגר מרכזי בחקירת סוגיה זו היה מגוון אוכלוסיות הנוירונים המרכיבות את המעגלים האלה 6,31,32. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות מהונדסות, בהובלת אופטוגנטיקה וכימוגנטיקה, מתחילה לפענח את הקשרים החשובים הללו ולהגדיר את המיקרו-מעגלים המעבדים מידע חושי 1,2,3,4,8,9,10,11,12,13,14 . הפיוס בין האופן שבו המיקרו-מעגלים האלה מתאחדים כדי לעצב את הפעילות ברשתות גדולות יותר של נוירוני DH נותר מאתגר, במיוחד לפיתוח טיפולים חדשים ויעילים יותר בכאב. כאן מתואר מודל פונקציונלי של פעילות DH המנוטרת ב-MEAs ומשתמשת בפעילות קצבית מגורה 4-AP כדי לחקור קישוריות רשת רחבה יותר. מודל זה חושף ספירינג חוץ-תאי מקומי (EAPs) ו-LFPs גדולים יותר מבוססי רשת, התלויים בפריקה פוטנציאלית של פעולה וניתן להשתמש בהם כדי למפות שינויים במאפייני הרשת. על ידי שילוב השימוש ב-MEAs כדי להקל על חקירת מעגלים ו-4-AP כדי לחשוף את המעגלים הבסיסיים, הכנה זו מאפשרת ללמוד את פונקציית מעגל ה-DH ברמה אזורית או 'מקרוסקופית'.

היתרונות של מודל פרוסת חוט השדרה MEA/4-AP כוללים בקרה ניסיונית הדוקה של הכנה במבחנה , הניתנת לחקירה פרמקולוגית מפורטת ומספקת רזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה של פעילות עצבית - אינדיבידואלית, כלומר, EAPs ו- LFPs על פני אזור רקמה גדול ונתונים רב-ערוציים שיכולים להעריך איתות ברשתות ובאזורים שונים. חשוב לציין, פעילות ריתמית המושרה על ידי 4-AP היא אמינה, ניתנת לשחזור, וניתן לחקור אותה בכיוונים שונים של פרוסת חוט השדרה. הכנה זו מסייעת לגשר על הפער בין חקירות של תאים יחידים ובעלי חיים שלמים ויכולה לחשוף שינויים בתוך מעגלים אלה בתנאים נורמליים ופתולוגיים כאחד. ניתן גם לקבוע את ההשפעות של תרופות שונות על פעילות הרשת. לפיכך, פלטפורמה זו יכולה לשמש ככלי סינון לחקירת הפעולות של משככי כאבים קיימים וחדשניים במעגלי DH.

ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. ראשית, הכנת רקמות זהירה היא המפתח לייצור פרוסות בנות קיימא לניסויים ורגישות ל-4-AP, ללא קשר לכיוון הפרוסה. מספר משאבים מודגשים כאן המספקים מידע מפורט וייעוץ לפתרון בעיות. בקצרה, דיוק ביצירת פתרונות, כריתה מהירה אך מוקפדת של חוט השדרה, פרמטרי חיתוך אופטימליים כדי למזער דחיסה ונזק לרקמות, וטיפול בעת העברת פרוסות בכל שלב הם כולם גורמים חשובים בשלב ההכנה. טיפול זהיר ב-MEAs, במיוחד כאשר הם נמצאים בסמיכות לאלקטרודות, הוא המפתח לשמירה על תפקודם של רכיבים אלה. המיקום האופטימלי של ה-DH על פני המספר המרבי של אלקטרודות MEA חשוב להגדלת תפוקת ההקלטה של כל ניסוי. בעת שימוש ב- MEAs תלת-ממדיים, נדרשים יותר טיפול ותרגול, במיוחד בעת מיקום והסרה של פרוסות. קל לגרור את הרקמה על פני אלקטרודות MEA בולטות ולפגוע בשימוש עתידי.

יש כמה אזהרות לגישה המתוארת כאן. שלא כמו ברישומים של תאים בודדים, שבהם ניתן לקבוע את זהותם של תאי העצב הנחקרים באמצעות תיוג גנטי או תיוג חיסוני לאחר הוק, לא ניתן לקבוע את המקור המדויק של האותות החשמליים שזוהו על ידי MEAs. אתגר נוסף הוא רמת הפעילות הבסיסית בפרוסות חוט השדרה. למרות שחלק מהדיווחים מתארים נוירוני DH פעילים מבחינה טונית בנקודת ההתחלה, העבודה האחרונה היא ברקמות ילוד צעירות33,34. יתר על כן, פעילות טוניקה המדווחת ברקמה בוגרת מתועדת בדרך כלל באמצעות אסטרטגיית חיפוש שבה אלקטרודות מתקדמות כדי לזהות תחילה את הפעילות הזו ולאחר מכן לחקור אותה35. כאשר נעשה שימוש בגישת דגימה בלתי משוחדת, קביעת רישום לפני הערכת הפעילות, פחות מ-20% מנוירוני ה-DH הבוגרים מפגינים זינוק מתמשך (הקלטות 28/150), ופריקה סדירה נצפתה רק ב-2% מהתאים האלה (3/150)36.

בהתחשב ביחס זה ובאופי הקבוע של אלקטרודות ביחס לפרוסת רקמה, אין זה מפתיע שמעט אלקטרודות MEA (~2 אלקטרודות/פרוסה ב-MEAs אלה) מציגות פעילות בנקודת ההתחלה. חוסר פעילות זה הוא הסיבה העיקרית לכך שהשיטה המתוארת כאן כוללת גירוי פרוסות עם 4-AP כדי לשפר את ה- EAPs ולעורר פעילות LFP. גישה זו מבוססת על שימוש ב-4-AP להפעלת פעילות מעגלים ריתמיים בתכשירים רבים במבחנה, החל ממחקר מנגנוני אפילפטיפורם בקליפת המוח ובהיפוקמפוס ועד לפעילות קטר פיקטיבית בצופר הגחון של חוט השדרה 37,38,39. ספרות ענפה גם מדגישה כי 4-AP משרה פעילות המוגבלת למעגלי DH שטחיים בפרוסות עמוד השדרה ותלויה בהעברה סינפטית מעוררת ומעכבת וכן בסינפסות חשמליות 20,21,22. יתר על כן, מתן in vivo 4-AP מייצר עלייה תלוית מינון בשדות הקלט של נוירוני DH מבלי לשנות את התגובות לגירוי מדורג באזור הקלט המרכזי או לגרום לתגובות מנוונות24. לבסוף, ניתן לראות כי דה-פולריזציה צנועה של מעגלים אלה על ידי העלאת ריכוז יוני האשלגן החוץ-תאיים מייצרת גם פעילות LFP דומה. יחד, תצפיות אלה תומכות בדעה ש-4-AP חושף רשתות רלוונטיות מבחינה פונקציונלית בתוך ה-DH השטחי שניתן לחקור באמצעות MEAs. לבסוף, המקור המדויק של פעילות LFP אינו ברור, אם כי צורות גל אלה נחשבות כמייצגות סיכום של פעילות שזוהתה ממספר תאי עצב המקיפים אלקטרודה. הם עשויים להתייחס או לנבוע מפעילות מתפרצת בתאי עצב או להתאים לפוטנציאלים סינפטיים30. ללא קשר למקורותיהם, ניתן להשוות את המאפיינים של LFPs בתוך ובין פרוסות (הקלטות מרובות / יישומי תרופות), תוך מתן קריאה רבת ערך של תפקוד המעגל והרשת.

האופי של תכשירי פרוסות במבחנה מצדיק גם הוא התייחסות, עם הפרעה פוטנציאלית של מעגלים עצביים ופגיעה בתאים על משטח הפרוסה. למרות זאת, חיתוך הרקמה מספק גישה חשמלית ישירה יותר למעגלי ה- DH הרלוונטיים וגישה פרמקולוגית ללא הפרעה. יש לשקול היטב את היתרונות והחסרונות הניסיוניים הללו, תוך שימת דגש על החשיבות של התחשבות בכיוון פרוסה כדי לשמר באופן מקסימלי את הקישוריות ברשתות העניין. עבור הרוב המכריע של הנתונים המוצגים במאמר זה, מוצגת התפשטות מדיאלית-רוחבית של פעילות בתוך הקרן הגבית והקישוריות הפנימית של הנוירונים באזור זה. כדי לחקור את התפשטות הפעילות הרוסוסטרו-קאודלית, השימוש בפרוסות סגיטליות או אופקיות שומר באופן מועדף על קישוריות בין מקטעי עמוד השדרה, כפי שמודגש באיור 9.

בנוסף, זה בלתי נמנע כי חיתוך חוט השדרה יגרום מידה מסוימת של נזק על פני השטח של פרוסות. מזעור נזק זה חוזר להכנה מדוקדקת של רקמות, חיתוך פרמטרים - כולל מהירות התקדמות איטית ותנודות להב בתדר גבוה - ופתרונות ומצבים שהם מגנים על הנוירו-טקטנטים במהלך תהליך זה. הערכה מפורטת של התועלת של מצבים שונים לבריאות פרוסת חוט השדרה פורסמה בעבר40. למרות ההשפעה הפוטנציאלית של בריאות הפרוסה על הקלטות MEA, עקביות פנימית בהליכי הכנת פרוסות מבטיחה שגורם זה ישפיע על התוצאות על פני מערך נתונים באופן שווה. כמו כן יש לציין כי אלקטרודות MEA נחשבות לקלוט אותות העולים במרחק של כ-30-100 מיקרומטר ממקור הפעילות. מכיוון שמשטח הפרוסה הפגוע צפוי להתפרש על פני שכבת התא העליונה, כ-15-30 מיקרומטר, ניתן לנהל ולמתן את ההשפעות של נזקים הקשורים לחיתוך על הקלטות MEA ולמתן אותן כדי עדיין להניב מערכי נתונים ותובנות יקרי ערך על פעילות רשת DH15,41.

לסיכום, גישת פרוסת חוט השדרה MEA/4-AP המתוארת כאן מספקת פלטפורמה להבנת הקישוריות של מעגלי DH וכיצד הרשתות שהם יוצרים מניעות עיבוד כאב בעמוד השדרה. קיים גם פוטנציאל להתרחבות מתודולוגית נוספת במונחים של פרמטרי ניתוח, מקור גירוי רשת, ויכולתו לשמש כפלטפורמה לסינון פרמקולוגי או לשימוש במודלים של כאב פתולוגי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי (NHMRC) של אוסטרליה (מענקים 631000, 1043933, 1144638 1184974 ו- B.A.G. ו- R.J.C.) ומכון המחקר הרפואי האנטר (מענק ל- B.A.G. ו- R.J.C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-aminopyridine Sigma-Aldrich 275875-5G
100% ethanol Thermo Fisher AJA214-2.5LPL
CaCl2 1M Banksia Scientific 0430/1L
Carbonox (Carbogen - 95% O2, 5% CO2) Coregas 219122
Curved long handle spring scissors Fine Science Tools 15015-11
Custom made air interface incubation chamber
Foetal bovine serum Thermo Fisher 10091130
Forceps Dumont #5 Fine Science Tools 11251-30
Glucose Thermo Fisher AJA783-500G
Horse serum Thermo Fisher 16050130
Inverted microscope Zeiss Axiovert10
KCl Thermo Fisher AJA383-500G
Ketamine Ceva KETALAB04
Large surgical scissors Fine Science Tools 14007-14
Loctite 454 Instant Adhesive Bolts and Industrial Supplies L4543G
MATLAB MathWorks R2018b
MEAs, 3-Dimensional Multichannel Systems 60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in an 8x8 square grid. Electrodes are 12 µm in diameter, 40 µm (100/12/40) or 50 µm (200/12/50) high and equidistantly spaced 100 µm (100/12/40) or 200 µm (200/12/50) apart.
MEA headstage Multichannel Systems MEA2100-HS60
MEA interface board Multichannel Systems MCS-IFB 3.0 Multiboot
MEA net Multichannel Systems ALA HSG-MEA-5BD
MEA perfusion system Multichannel Systems PPS2
MEAs, Planar Multichannel Systems 60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in either a 8x8 square grid (200/30) or a 6x10 rectangular grid (500/30). Electrodes are 30 µm in diameter and equidistantly spaced 200 µm (200/30) or 500 µm (500/30) apart.
MgCl2 Thermo Fisher AJA296-500G
Microscope camera Motic Moticam X Wi-Fi
Multi Channel Analyser software Multichannel Systems V 2.17.4
Multi Channel Experimenter software Multichannel Systems V 2.17.4
NaCl Thermo Fisher AJA465-500G
NaHCO3 Thermo Fisher AJA475-500G
NaH2PO4 Thermo Fisher ACR207805000
Rongeurs Fine Science Tools 16021-14
Small spring scissors Fine Science Tools 91500-09
Small surgical scissors Fine Science Tools 14060-09
Sucrose Thermo Fisher AJA530-500G
Superglue cyanoacrylate adhesive
Tetrodotoxin Abcam AB120055
Vibration isolation table Newport VH3048W-OPT
Vibrating microtome Leica VT1200 S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, K. M., et al. Calretinin positive neurons form an excitatory amplifier network in the spinal cord dorsal horn. eLife. 8, 49190 (2019).
  2. Smith, K. M., et al. Functional heterogeneity of calretinin-expressing neurons in the mouse superficial dorsal horn: implications for spinal pain processing. The Journal of physiology. 593 (19), 4319-4339 (2015).
  3. Boyle, K. A., et al. Defining a spinal microcircuit that gates myelinated afferent input: Implications for tactile allodynia. Cell Reports. 28 (2), 526-540 (2019).
  4. Browne, T. J., et al. Transgenic cross-referencing of inhibitory and excitatory interneuron populations to dissect neuronal heterogeneity in the dorsal horn. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 32 (2020).
  5. Graham, B. A., Hughes, D. I. Rewards, perils and pitfalls of untangling spinal pain circuits. Current Opinion in Physiology. 11, 35-41 (2019).
  6. Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
  7. Hughes, D. I., Todd, A. J. Central nervous system targets: inhibitory interneurons in the spinal cord. Neurotherapeutics. 17 (3), 874-885 (2020).
  8. Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
  9. Hachisuka, J., Chiang, M. C., Ross, S. E. Itch and neuropathis itch. Pain. 159 (3), 603 (2018).
  10. Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
  11. Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
  12. Cheng, L., et al. Identification of spinal circuits involved in touch-evoked dynamic mechanical pain. Nature neuroscience. 20 (6), 804-814 (2017).
  13. Peirs, C., et al. Mechanical allodynia circuitry in the dorsal horn is defined by the nature of the injury. Neuron. 109 (1), 73-90 (2021).
  14. Huang, J., et al. Circuit dissection of the role of somatostatin in itch and pain. Nature Neuroscience. 21 (5), 707-716 (2018).
  15. Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2015).
  16. Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
  17. Johnstone, A. F., et al. Microelectrode arrays: a physiologically based neurotoxicity testing platform for the 21st century. Neurotoxicology. 31 (4), 331-350 (2010).
  18. Stett, A., et al. Biological application of microelectrode arrays in drug discovery and basic research. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 377 (3), 486-495 (2003).
  19. Xu, L., et al. Trends and recent development of the microelectrode arrays (MEAs). Biosensors and Bioelectronics. 175 (1), 112854 (2020).
  20. Chapman, R. J., Cilia La Corte, P. F., Asghar, A. U. R., King, A. E. Network-based activity induced by 4-aminopyridine in rat dorsal horn in vitro is mediated by both chemical and electrical synapses. The Journal of Physiology. 587, Pt 11 2499-2510 (2009).
  21. Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Epileptiform activity in rat spinal dorsal horn in vitro has common features with neuropathic pain. Pain. 105 (1-2), 327-338 (2003).
  22. Kay, C. W., Ursu, D., Sher, E., King, A. E. The role of Cx36 and Cx43 in 4-aminopyridine-induced rhythmic activity in the spinal nociceptive dorsal horn: an electrophysiological study in vitro. Physiological Reports. 4 (14), 12852 (2016).
  23. Jankowska, E., Lundberg, A., Rudomin, P., Sykova, E. Effects of 4-aminopyridine on synaptic transmission in the cat spinal cord. Brain Research. 240 (1), 117-129 (1982).
  24. Semba, K., Geller, H. M., Egger, M. D. 4-Aminopyridine induces expansion of cutaneous receptive fields of dorsal horn cells. Brain Research. 343 (2), 398-402 (1985).
  25. Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Long-range oscillatory Ca2+ waves in rat spinal dorsal horn. European Journal of Neuroscience. 22 (8), 1967-1976 (2005).
  26. Egert, U., et al. A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on substrate-integrated multielectrode arrays. Brain Research Protocols. 2 (4), 229-242 (1998).
  27. Thiebaud, P., De Rooij, N., Koudelka-Hep, M., Stoppini, L. Microelectrode arrays for electrophysiological monitoring of hippocampal organotypic slice cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 44 (11), 1159-1163 (1997).
  28. Rey, H. G., Pedreira, C., Quiroga, R. Q. Past, present and future of spike sorting techniques. Brain Research Bulletin. 119, 106-117 (2015).
  29. Satuvuori, E., et al. Measures of spike train synchrony for data with multiple time scales. Journal of Neuroscience Methods. 287, 25-38 (2017).
  30. Mendis, G. D. C., Morrisroe, E., Reid, C. A., Halgamuge, S. K., Petrou, S. Use of local field potentials of dissociated cultures grown on multi-electrode arrays for pharmacological assays. 38th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 952-956 (2016).
  31. Hughes, D. I., et al. Morphological, neurochemical and electrophysiological features of parvalbumin-expressing cells: a likely source of axo-axonic inputs in the mouse spinal dorsal horn. The Journal of Physiology. 590 (16), 3927-3951 (2012).
  32. Peirs, C., Seal, R. P. Neural circuits for pain: recent advances and current views. Science. 354 (6312), 578-584 (2016).
  33. Li, J., Baccei, M. L. Developmental regulation of membrane excitability in rat spinal lamina I projection neurons. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2604-2614 (2012).
  34. Li, J., Baccei, M. L. Pacemaker neurons within newborn spinal pain circuits. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9010-9022 (2011).
  35. Sandkühler, J., Eblen-Zajjur, A. Identification and characterization of rhythmic nociceptive and non-nociceptive spinal dorsal horn neurons in the rat. Neuroscience. 61 (4), 991-1006 (1994).
  36. Lucas-Romero, J., Rivera-Arconada, I., Roza, C., Lopez-Garcia, J. A. Origin and classification of spontaneous discharges in mouse superficial dorsal horn neurons. Scientific Reports. 8 (1), 9735-9735 (2018).
  37. Antonio, L., et al. L. al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 33-44 (2016).
  38. Avoli, M., Jefferys, J. G. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).
  39. Taccola, G., Nistri, A. Low micromolar concentrations of 4-aminopyridine facilitate fictive locomotion expressed by the rat spinal cord in vitro. Neuroscience. 126 (2), 511-520 (2004).
  40. Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. Journal of Neurophysiology. 107 (2), 728-741 (2012).
  41. Egert, U., Heck, D., Aertsen, A. Two-dimensional monitoring of spiking networks in acute brain slices. Experimental Brain Research. 142 (2), 268-274 (2002).

Tags

מדעי המוח גיליון 180
הקלטת פעילות רשת במעגלים נוסיקפטיים בעמוד השדרה באמצעות מערכי מיקרו-אלקטרוניקה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iredale, J. A., Stoddard, J. G.,… More

Iredale, J. A., Stoddard, J. G., Drury, H. R., Browne, T. J., Elton, A., Madden, J. F., Callister, R. J., Welsh, J. S., Graham, B. A. Recording Network Activity in Spinal Nociceptive Circuits Using Microelectrode Arrays. J. Vis. Exp. (180), e62920, doi:10.3791/62920 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter