Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a reconstituição da atividade extração de Msp1 com componentes totalmente purificados em proteoliposomes definidos.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Reconstituição da Atividade de Extração de Msp1 com Componentes Totalmente Purificados
Neste artigo
Resumo
Resumo
Como centro de fosforilação oxidativa e regulação apoptótica, as mitocôndrias desempenham um papel vital na saúde humana. A função mitocondrial adequada depende de um sistema robusto de controle de qualidade para manter a homeostase proteica (proteostase). Declínios na proteostase mitocondrial têm sido ligados ao câncer, envelhecimento, neurodegeneração e muitas outras doenças. Msp1 é um AAA+ ATPase ancorado na membrana mitocondrial externa que mantém a proteostase removendo proteínas ancoradas na cauda deslocalizadas. Utilizando componentes purificados reconstituídos em proteoliposomes, mostramos que o Msp1 é necessário e suficiente para extrair um modelo de proteína ancorada na cauda de uma bicamada lipídica. Nosso sistema simplificado reconstituído supera várias das barreiras técnicas que têm dificultado o estudo detalhado da extração de proteínas de membrana. Aqui, fornecemos métodos detalhados para a geração de lipossomos, reconstituição de proteínas de membrana e o ensaio de extração de Msp1.
Introdução
A função celular adequada depende de um processo chamado proteostase, que garante que as proteínas funcionais estejam na concentração correta e localização celular1. Falhas na proteostase levam à função organela comprometida e estão associadas a muitas doenças neurodegenerativas2,3,4. As proteínas de membrana apresentam desafios únicos à rede de proteostase, pois devem ser direcionadas para a membrana correta, evitando a agregação dos domínios hidrofóbicos transmembrano (TMDs)5. Consequentemente, o maquinário especializado evolu....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Preparação liposomial
- Combine estoques de clorofórmio de lipídios em proporções apropriadas para imitar a membrana mitocondrial externa.
- Prepare 25 mg de mistura lipídica. Usamos uma mistura previamente estabelecida de lipídios que imitam membranas mitocondriais, constituído por uma razão molar de 48:28:10:10:4 de cerline de ovo de galinha fosfartidil (PC), ovo de frango fosfatidyl etanolamina (PE), inositol de fosfatidil hepático bovino (PI), sintético 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS), e sintético 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glicerol (TOCL)58,59. Os cálcu....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Para interpretar corretamente os resultados, o gel livre de manchas e a mancha ocidental devem ser vistos juntos. O gel livre de manchas garante o carregamento igual em todas as amostras. Ao visualizar o gel livre de manchas, os acompanhantes (GST-calmodulin e GST-SGTA) serão visíveis nas pistas INPUT (I) e ELUTE (E). Verifique duas vezes se a intensidade dessas bandas é uniforme em todas as amostras de ENTRADA. Da mesma forma, certifique-se de que a intensidade é uniforme em todas as amostras de ELUTE. O ELUTE é 5x mais.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
A função mitocondrial adequada depende de um sistema robusto de controle de qualidade de proteína. Devido aos limites inerentes à fidelidade das vias de direcionamento da proteína TA, as proteínas T deslocalizadas são uma fonte constante de estresse para mitocôndrias. Um componente-chave da rede de proteostase mitocondrial é o Msp1, que é um ATPase AAA+ ancorado em membrana que remove proteínas TA mal localizadas do OMM. Aqui, descrevemos como preparar proteoliposomes, co-reconstituir Msp1 e uma proteína TA modelo, e rea.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Agradecimentos
MLW desenvolveu parte deste protocolo durante seus estudos de pós-doutorado com o Dr. Robert Keenan na Universidade de Chicago.
Este trabalho é financiado pela concessão do NIH 1R35GM137904-01 à MLW.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Biobeads | Bio-Rad | 1523920 | |
| Fosfatidil inositol de fígado bovino | Avanti | 840042C | PI |
| Fosfatidilcolina de ovo de galinha | Avanti | 840051C | PC |
| Fosfatidil etanolamina de ovo de galinha | Avanti | 840021C | PE |
| ECL Selecione o reagente de detecção de western blotting | GE | RPN2235 | |
| Suportes de filtro | Avanti | 610014 | |
| Frasco de vidro | VWR | 60910L-1 | |
| Coluna de rotação de glutationa | Thermo Fisher | PI16103 | |
| Cabra anti-coelho | Thermo Fisher | NC1050917 | |
| Mini-extrusora | Avanti | 610020 | |
| Membrana de policarbonato | Avanti | 610006 | 200 nM |
| membrana em PVDF | Thermo Fisher | 88518 | 45 µ M |
| Rabbit anti-FLAG | Sigma-Aldrich | F7245 | |
| Sintético 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina | Avanti | 840035C | DOPS |
| Sintético 1',3'-bis[1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo]-glicerol | Seringa Avanti | 710335C | TOCL |
| , 1 mL | Seringa Norm-Ject | 53548-001 | |
| , 1 mL, à prova | de gásAvanti | 610017 |
Referências
- Song, J., Herrmann, J. M., Becker, T. Quality control of the mitochondrial proteome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22, 54-70 (2021).
- Phillips, B. P., Miller, E. A. Membrane protein folding and quality control. Current Opinion in Structural Biology.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
