O zebrafish é um modelo importante para entender o desenvolvimento renal. Aqui, um protocolo de hibridização in situ é otimizado para detectar expressão genética em larvas de zebrafish e juvenis durante o desenvolvimento de mesonepros.
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Artigo de método
In situ Hibridização em Larvas de Zebrafish e Juvenis durante o Desenvolvimento de Mesonephros
Neste artigo
Resumo
Resumo
O zebrafish forma duas estruturas renais em sua vida. Os pronephros (rim embrionário) formam-se durante o desenvolvimento embrionário e começam a funcionar a 2 dias após a fertilização. Composto por apenas dois nefrões, os glifos servem como rim único durante a vida larval até que mais função renal seja necessária devido ao aumento da massa corporal. Para lidar com essa maior demanda, os mesonepros (rim adulto) começam a se formar durante a metamorfose. Os novos nefrons primários se fundem aos glifos e formam lúmens conectados. Em seguida, nefrões secundários se fundem aos primários (e assim por diante) para criar uma rede de ramificação nos mesonephros. A grande maioria das pesquisas está focada nos dispositivos proviros devido à facilidade de uso de embriões. Assim, é necessário desenvolver técnicas para estudar larvas mais antigas e maiores e peixes juvenis para entender melhor o desenvolvimento de mesonepros. Aqui, um protocolo de hibridização in situ para análise de expressão genética é otimizado para penetração de sondas, lavagem de sondas e anticorpos, e branqueamento de pigmentos para melhor visualizar os mesonephros. A linha transgênica Tg(lhx1a-EGFP) é usada para rotular células progenitoras e os túbulos distais de nefrrons nascentes. Este protocolo preenche uma lacuna na pesquisa de mesonepros. É um modelo crucial para entender como os novos tecidos renais se formam e se integram com os nefrões existentes e fornecem insights sobre terapias regenerativas.
Introdução
O embrião de zebrafish é um modelo importante para estudar o desenvolvimento de tecidos devido ao seu pequeno tamanho, transparência, ferramentas disponíveis e sobrevivência sem se alimentar por até cinco dias1,2. Contribuiu muito para a compreensão do desenvolvimento renal e da conservação entre zebrafish e mamíferos3,4,5. O rim desempenha um papel essencial na manutenção da homeostase fluida, filtrando o sangue e excretando resíduos6. O nefron, a unidade funcional do rim, compreende um filtro....
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Protocolo
O uso de larvas de zebrafish e juvenis é aprovado pelo IUP IACUC (protocolo nº 02-1920, #08-1920). Os detalhes do conteúdo da solução estão listados na Tabela de Materiais.
1. Criar larvas
NOTA: Levará até 21 dias ou mais para elevar larvas e juvenis ao estágio de interesse.
- Configure zebrafish adulto para acasalar adicionando 1 peixe macho e 1 fêmea em um tanque de acasalamento no final da tarde após sua última refeição.
NOTA: Nem todos os pares de peixes vão acasalar. Comece por configurar 20 pares para determinar a taxa de acasalamento e ajustar-se de acordo em experimentos futuro....
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Resultados
Utilizando a linha transgênica Tg(lhx1a-EGFP), foi demonstrado que este protocolo de hibridização in situ é eficaz na rotulagem de células progenitoras renais e várias estruturas de nefrão durante o desenvolvimento de mesonephros. Como esperado, o sistema nervoso central também é rotulado nesta linha transgênica (não mostrada). O nefron mesoneférico inicial se forma em aproximadamente 5,2 mm, dorsal aos tenebrosos (Figura 2A), e o túbulo distal deste nefron é rotulado por E.......
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Discussão
O método de hibridização in situ descrito aqui visa estudar o desenvolvimento de mesonepros. No entanto, pode ser aplicado para estudar o desenvolvimento de outros tecidos e órgãos durante a metamorfose, como intestino, sistema nervoso, escamas e pigmentação14. Sondas podem ser geradas para genes endógenos ou marcadores fluorescentes em linhas transgênicas.
É fundamental que as larvas permaneçam intactas para observar os órgãos e tecidos em seu contexto nativo........
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse.
Agradecimentos
O financiamento foi fornecido pela Academia de Ciências da Pensilvânia, e pela Comunidade de Biólogos da Pensilvânia, e pela Universidade de Indiana da Pensilvânia (Escola de Pós-Graduação e Pesquisa, Departamento de Biologia e Pelo Fundo de Biologia de Graduação Cynthia Sushak para Excelência). A linha transgênica Tg(lhx1a-EGFP) foi fornecida pelo Dr. Neil Hukriede (Universidade de Pittsburgh).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anticorpo anti-fluoresceína | Roche/Sigma-Aldrich | Solução | |
| 0,8% KOH, 0,9% H2O2 em PBST | |||
| 22-363-549 | 100 μ m | ||
| E3 meio | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% azul de metileno | ||
| Manipulador de cílios Fisher | Scientific | NC1083208 | Use para manipular larvas |
| Solução de fixação | % paraformaldeído, 1% DMSO em PBS; calor a 65° C enquanto agita até que o pó se dissolva, em seguida, adicione DMSO depois de esfriar | ||
| Síntese da sonda de fluoresceína | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Fisher | Scientific | 03-338B | |
| Encapsulamento de incubação | Argent | ||
| Hyb- solução | 50% formamida, 5X SSC, 0,1% Tween-20 | ||
| Hyb+ solução | HYB-, 5 mg/mL de RNA torula, 50 ug/mL de heparina | ||
| MAB (10X) | 1 M ácido maleico, 1,5 M NaCl, pH 7,5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0,1% Tween-20 | ||
| Ácido maleico | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldeído | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0,2% KCl, 1,44% Na2HPO4, 0,24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0,1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0,2% Tween-20 | ||
| Alimento | Misture 2 g de cada espirulina e encapsulon de incubação em 50 mL de água do sistema de peixes e agite bem | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use para permeabilizar larvas |
| Solução de proteinase K | 20 μ g/mL, concentração final de DMSO a 1% em | ||
| pó microfino de espirulina | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, acetato de sódio anidro 0,3 M, pH 7, SSCT em autoclave | ||
| (0,2X) | Diluído de 20X SSC, 0,1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Diluído de 20X SSC, 0,1% Tween-20 | ||
| Tampão | de coloração100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20 | ||
| Solução | 200 μ g/mL de cloreto de iodonitrotetrazólio, 200 μ g / mL de sal dissódico de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolil, em tampão de coloração | ||
| Solução de parada | 1 mM EDTA, pH 5,5, em PBST | ||
| Torula (levedura) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaína | Sigma | Aldrich E10521 | 2%, pH 7 |
| Tampão | 50% formamida, 2X SSC, 0,1% Tween-20 |
Referências
- Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. Mapping of zebrafish research: a global outlook. Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate. Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).<....
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Reimpressões e permissões
