Artigo de método

Fabricação microfluida de microcápsulas core-shell carregando esferoides de células-tronco pluripotentes humanas

DOI:

10.3791/62944

⸱

13 de outubro de 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este artigo descreve o encapsulamento de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) usando um dispositivo de foco de fluxo coaxial. Demonstramos que essa tecnologia de encapsulamento microfluido permite a formação eficiente de esferoides hPSC.

Resumo

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Culturas tridimensionais (3D) ou esferoides de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) oferecem os benefícios de melhores resultados de diferenciação e escalabilidade. Neste artigo, descrevemos uma estratégia para a formação robusta e reprodutível de esferoides hPSC onde um dispositivo de foco de fluxo coaxial é utilizado para prender hPSCs dentro de microcápsulas de conchas centrais. A solução central continha suspensão celular única de hPSCs e foi feita viscosa pela incorporação de poli de alto peso molecular (etileno glicol) (PEG) e mídia gradiente de densidade. O fluxo de conchas era composto por PEG-4 arm-maleimide ou PEG-4-Mal e fluiu ao lado do fluxo central em direção a duas junções de óleo consecutivas. A formação de gotículas ocorreu na primeira junção de óleo com a solução shell envolvendo-se em torno do núcleo. A interligação química da casca ocorreu na segunda junção de óleo introduzindo um crosslinker di-thiol (1,4-dithiothreitol ou DTT) nessas gotículas. O crosslinker reage com grupos funcionais de maleimiide via química de clique, resultando na formação de uma concha de hidrogel ao redor das microcápsulas. Nossa tecnologia de encapsulamento produziu cápsulas de 400 μm de diâmetro a uma taxa de 10 cápsulas por segundo. As cápsulas resultantes tinham uma concha de hidrogel e um núcleo aquoso que permitia que células únicas se reunissem rapidamente em agregados e formassem esferoides. O processo de encapsulamento não afetou negativamente a viabilidade dos hPSCs, com viabilidade >95% observada 3 dias após o encapsulamento. Para comparação, os hPSCs encapsulados em micropartículas de gel sólido (sem núcleo aquoso) não formavam esferoides e tinham <50% de viabilidade 3 dias após o encapsulamento. A formação esferoide de hPSCs dentro de microcápsulas de conchas núcleo ocorreu dentro de 48 h após o encapsulamento, com o diâmetro esferoide sendo uma função da densidade de inoculação celular. No geral, a tecnologia de encapsulamento microfluido descrita neste protocolo foi adequada para encapsulamento de hPSCs e formação de esferoides.

Introdução

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Há um interesse considerável nas culturas 3D das células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) devido à melhoria da pluripotência e potencial de diferenciação proporcionada por esse formato de cultura 1,2,3. hPSCs são tipicamente formados em esferoides ou outros formatos de cultura 3D por meio de bioreatores, microwells, hidrogéis e andaimes poliméricos 4,5,6. Encapsulamento oferece outro meio para organizar hPSCs únicos em esferoides. Uma vez encapsulados spheroids hPSC podem ser tra....

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Protocolo

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1. Fabricação de dispositivos

  1. Faça os projetos para o dispositivo de microencapsulação e dispositivo de dissociação usando o software CAD10,11.
  2. Gire as três camadas de fotoresist SU-8 sequencialmente em um wafer de silício (Figura 2A) para alcançar estruturas com as alturas desejadas: 60, 100 e 150 μm.
    NOTA: O processo para os moldes superior e inferior é idêntico.
    1. Gire um wafer de silício limpo de 10 cm com fotoresist negativo SU-8 2025 a 1.100 rpm para criar a primeira camada de 60 μm. Depois de um cozimento macio a 65 °C por 3 min e 95 °C por 10 m....

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Resultados

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Seguindo o protocolo acima mencionado, o leitor poderá fabricar dispositivos microfluidos e produzir microcápsulas portadoras de células. A Figura 3A mostra exemplos de microcápsulas ótimas e subótimas fabricadas usando geração de gotículas microfluídicas. Diferentes formulações de PEG-4-Mal resultaram em cápsulas de morfologias variadas - cápsulas enrugadas estavam associadas à má gelação, baixa integridade mecânica e não resistivam ao cultivo em um bioreator mexido. Cápsulas lisas observad.......

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Discussão

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O processo de encapsulamento descrito aqui resulta na formação reprodutível de esferoides hPSC. O formato de microcápsula facilita a distribuição de esferoides em poços de uma placa de microtítiter para experimentos que visam melhorar/otimizar protocolos de diferenciação ou testar terapias. Esferoides de células-tronco encapsuladas também podem ser usados em culturas de suspensões onde a concha de hidrogel protege as células contra danos induzidos por tesoura7.

Há vário.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Este estudo foi apoiado em parte pelas bolsas do Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, J. W. Kieckhefer Foundation, Al Nahyan Foundation, Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) e NIH (DK107255).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,22 µ m Filtros de seringaGenesee Scientific25-244
Seringa de 1 ml ponta luer-lockBD309628
1x DPBSCorning23220003
maleimida PEG de 4 braços, 10kDaLaysan Inc.164-68
Seringa de 5 ml com ponta luer-lockBD309646
PLACA NÃO TRATADA DE 6 POÇOSUSA ScientificCC7672-7506
Aquapel Pacote AplicadorTratamento de Vidro Aquapel47100
Software CADAutodeskAutoCAD v2020
CELL STRAINER 100 µ m tamanho dos poroscardinal335583
ClorotrimetilsilanoAldrich386529-100mL
Condessa II FL Contador de Células AutomatizadoTecnologia de vidaA27974
Placa quente digitalPlaca
Misturador de vórtice digitalFisher Scientific215370
Água destiladaGibco15230-162
Ditioteritol (TDT)SigmaD0632-10G
DMEM / F12 mídiagibco11320-033
Falcon 15 mL Tubos de centrífuga cônicosFisher scientific14-959-53A
Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrífugaao vivo13-100-675
HERACELL VIOS 160i Incubadora de CO2Thermo Scientific50144906
Microscópio Motorizado de Fluorescência InvertidaOlympusOlympus IX83
Laurell Spin CoatersLaurell TechnologiesWS-650MZ-23NPPB
Kit de coloração de mamíferos vivos/mortosFisherL3224
Fita mágicaGrampos483535
Tubo Micro Médico (0.015" I.D. x 0.043" O.D.)Scientific Commodities, IncBB31695-PE/2
Micro barra de agitaçãoMilliporeSigma EF3288Eda Daigger Scientific
Mineral XX6200006PFisher scientific
SigmaM8410-1L
mTeSR 1 Basal MediumSTEMCELL TECHNOLOGY85850
Agulhas-Aço Inoxidável  14 GaugeFornecimento CML901-14-025
Agulhas-Aço Inoxidável  15 GaugeCML fornecimento901-15-050
OptiPrepSTEMCELL TECHNOLOGY7820
FornoThermo ScientificHERA THERM Forno
Penicilina:Estreptomicina (10,000 U/mL Penicilina G, 10mg/mL Estreptomicina)Gemini400-109
Petri Prato 150X20 Ventilação EstérilSarstedt, Inc.82.1184.500
Sistema de Limpeza de PlasmaYield Engineering System, Inc.YES-G500
Pluronic F-127SigmaP2443-250G
Poli (etilenoglicol) 35kDaSigma94646-250G-F
Agulha PrecisionGlide 27GBD305109
Inibidor de rocha Y-27632 dihidrocloritoSELLECK CHEMS1049-10mg
Bolacha de silício 100mmUniversidade Wafer452
Vidro deslizante (75mm &agudo; 25mm)CardinalHealthM6146
Span 80SigmaS6760-250ML
SpeedMixerThinkyARE-310
Spin-X Filtro de Tubo de Centrífuga (0.22 µ m)Costar8160
SU-8 2025Kayaku Advanced MaterialsY111069 0500L1GL
SU-8 desenvolvedor KayakuAdvanced MaterialsY020100 4000L1PE
Design Cirúrgico Lâminas de bisturi cirúrgico de aço inoxidável Royaltekfisher scientific22-079-684
SYLGARD TM 184 Kit de elastômero de silicone (PDMS)Dow Corning2065622
Bomba de seringaNew Era Pump System, IncNE-4000
TrietanolaminaSigma-aldrichT58300-25G
TrypLE ExpressGibco12604-013
Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.)Tubo Tygon Cole-Parmer06419-01
(0.04" I.D. x 0.07" O.D.)Cole-Parmer06419-04
Limpador Ultrassônico FS20DDessecador a Vácuo Fisher ScientificCPN-962-152R
Bel-ArtF42025-0000
Zeiss Stemi DV4 Microscópio Estéreo 8x-32xZEISS435421-0000-000
μ Gravador a laser PG 101Heidelberg InstrumentsHI 1128
de dados Pinça de Filtro Óleo

Referências

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  1. Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
  2. Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history,....

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