Ensaio de metilação de DNA acoplado à endonuclease à base de fluorescência contínua para triagem de inibidores da DNA metiltransferase

Resumo

As metiltransferases de DNA são potenciais alvos de drogas contra o câncer. Aqui, um protocolo é apresentado para avaliar pequenas moléculas para inibição da DNA metiltransferase. Este ensaio utiliza uma endonuclease para acoplar a metilação do DNA à geração de fluorescência e permite que a atividade enzimática seja monitorada em tempo real.

Resumo

A metilação do DNA, uma forma de regulação genética epigenética, é importante para a função celular normal. Nas células, as proteínas chamadas DNA metiltransferases (DNMTs) estabelecem e mantêm o padrão de metilação do DNA. Mudanças no padrão normal de metilação do DNA estão ligadas ao desenvolvimento e progressão do câncer, tornando os DNMTs potenciais alvos de medicamentos contra o câncer. Assim, identificar e caracterizar novos inibidores de pequenas moléculas dessas enzimas é de grande importância. Este trabalho apresenta um protocolo que pode ser utilizado para o rastreamento de inibidores da DNA metiltransferase. O ensaio de cinética acoplada contínua permite que as velocidades iniciais de metilação do DNA sejam determinadas na presença e ausência de potenciais inibidores de moléculas pequenas. O ensaio usa a endonuclease sensível à metila Gla I para acoplar a metilação de um substrato de DNA hemimetilado à geração de fluorescência.

Este ensaio contínuo permite que a atividade enzimática seja monitorada em tempo real. A realização do ensaio em pequenos volumes em placas de microtitulação reduz o custo dos reagentes. Usando este ensaio, uma pequena tela de exemplo foi conduzida para inibidores de DNMT1, a isoenzima DNMT mais abundante em humanos. O produto natural de antraquinona altamente substituído, o ácido lacáico A, é um potente inibidor competitivo de DNA da DNMT1. Aqui, examinamos três potenciais inibidores de moléculas pequenas - antraquinonas ou moléculas semelhantes à antraquinona com um a três substituintes - em duas concentrações para descrever o protocolo de ensaio. As velocidades iniciais são usadas para calcular a porcentagem de atividade observada na presença de cada molécula. Um dos três compostos examinados exibe inibição dependente da concentração da atividade DNMT1, indicando que é um inibidor potencial da DNMT1.

Introdução

A metilação do DNA é uma importante marca epigenética que regula a expressão gênica e a estrutura da cromatina. A metilação ocorre predominantemente nos dinucleotídeos CpG — citosina seguida de guanosina; o grupo metilo é adicionado à posição 5 da citosina. Padrões corretos de metilação do DNA e, portanto, a expressão gênica adequada, são necessários para o desenvolvimento e a função celular apropriados. Muitos estados patológicos têm sido associados a alterações no padrão normal de metilação ^1,2,3. Por exemplo, existe uma ligação entre o início e a progressão do câncer e alt....

Protocolo

1. Prepare soluções de ensaio para a tela

NOTA: As concentrações de substratos utilizadas neste ensaio podem ser adaptadas. Para DNMT1 sem RFTS, os valores de K_m determinados experimentalmente para o substrato de DNA do hairpin e SAM são 1–2 nM e 2 μM, respectivamente^26,40.

1. Preparar 600 μL de cada condição de ensaio que está sendo testada em tubos de microcentrífuga sobre gelo.
   NOTA: O volume total de solução de ensaio necessário depende do número de replicações que estão sendo conduzidas. Cada condição de ensaio foi executada em triplicado p....

Resultados

DNMT1 ativo é um pré-requisito para esta análise. A DNMT1 sem RFTS foi expressa em E.coli e purificada até a homogeneidade seguindo procedimentos previamente publicados⁴¹. Para garantir que a enzima purificada estivesse ativa, um ensaio descontínuo acoplado à endonuclease foi usado para examinar a atividade de metilação do DNA³⁶. Este ensaio utiliza um DNA duplex de 32 pares de bases com um único CpG hemimetilado posicionado em um local de clivagem Sau3A1. Sau3A1 p.......

Discussão

Para identificar e caracterizar inibidores de DNA metiltransferases, a atividade da enzima deve ser medida. Existem vários métodos para examinar a atividade da DNA metiltransferase. A atividade é comumente monitorada usando radioatividade; a transferência do grupo metilo marcado da SAM pode ser quantificada 29,30,31,32,33,34........

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microplaca de poliestireno de fundo plano preto de meia área de 96 poços	Corning	3694
Placas de fundo cônico de poliestireno de 96 poços	ThermoFisher	249570
Albumina de soro bovino	NEB	B9000S
composto 1	ChemBridge	5812086	composto de triagem; ressuspenso em DMSO para 10 mM
composto 2	ChemBridge	6722175	composto de triagem; ressuspenso em DMSO para 10 mM
composto de triagem 3	ChemBridge	5249376	composto de triagem; ressuspenso em DMSO para 10 mM
Ditiotreitol	Sigma	D0632
Gla I	SibEnzyme	E494	endonuclease metil-sensível
Glicerol	RPI	G22025
Cloreto de magnésio	Sigma	M0250
(5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher)	IDT	sintetizado	internamente extinto DNA hairpin (substrato)
Glutamato de potássio	Sigma	G1501
S-adenosilmetionina	Sigma	A4377	co-fator de doação de metila (substrato)
Tris Base	RPI	T60040

Oligonucleotídeo