Melhorando o conteúdo do tumor através da macrodisseção do tumor

Os tecidos incorporados à parafina (FFPE), coletados como parte do processo de diagnóstico clínico normal e retidos em repositórios de tecido clínico, representam um vasto recurso para a pesquisa humana, incluindo a pesquisa sobre câncer¹. À medida que nossa compreensão da doença humana se aprofunda, está cada vez mais claro que as doenças, antes consideradas entidades únicas baseadas em características morfológicas e imunofenópicas, são de fato compostas por subtipos moleculares distintos que requerem ensaios de subtipos moleculares. Consequentemente, ensaios genômicos de alta sensibilidade capazes de discernir esses subtipos tornaram-se cada vez mais importantes². Embora os tecidos FFPE sejam renomados por serem pouco compatíveis com técnicas genômicas devido a problemas relacionados à fixação, à medida que a tecnologia e os protocolos evoluem, essas técnicas estão se tornando cada vez mais compatíveis com esse formato de tecido clinicamente onipresente ^3,4,5. No entanto, os tecidos FFPE são frequentemente misturas de materiais de tecido tumoral e não tumoral, onde a presença de material não tumoral é frequentemente indesejada e pode, se presente em alta proporção, prejudicar significativamente e impactar os resultados das análises genômicas⁶. De fato, um teor mínimo de tumor de 60% é frequentemente utilizado para tais análises, onde tecidos que ficam aquém desse limiar podem ser excluídos, apesar de cumprirem de outra forma os critérios^{do estudo 7}. Isso pode ser particularmente problemático em ambientes de doenças raras, onde os tecidos do paciente são preciosos e difíceis de coletar em números elevados.

Macrodisseção é um método que minimiza os efeitos do baixo teor tumoral reduzindo a quantidade de tecido normal³. A remoção de tal material não tumoral confuso antes da extração de ácido nucleico pode aumentar significativamente o teor percentual do tumor e, portanto, a pureza tumoral dos ácidos nucleicos extraídos. A ressecção tecidual depende criticamente de uma revisão patológica especializada, na qual a região tumoral é identificada e circulada em uma seção de tecido manchado de hematolina e eosina (H&E) recém-gerada por um patologista certificado pela placa⁸. O H&E circulado é então usado para orientar a remoção e coleta de tecidos indesejados e alvos, respectivamente. Este protocolo descreve as etapas da macrodisseção desde a revisão patológica até a colheita de tecidos realizadas no Laboratório de Núcleo Técnico de Recursos de Aids e Câncer (ACSR) da Clínica Mayo.

Todas as amostras foram coletadas e utilizadas em conformidade com os protocolos aprovados da Mayo Clinic IRB (PR16-000507 e PR2207-02).

1. Preparação da amostra

1. Ligue o banho de água de flutuação tecidual. Coloque a temperatura em 39 °C e deixe a água chegar à temperatura. Mergulhe varas de coleta de madeira no banho de água.
2. Identifique e recupere os blocos de tecido FFPE a serem seccionados.
3. Slides de microscópio pré-rótulo usando um marcador permanente de grau de histologia que pode suportar lavagens de solventes.
4. Use um microtoma para separe os blocos FFPE. Corte pelo menos 2 seções de rosto completo a uma espessura de 4-5 μm por seção para cada bloco (Figura 1A).
5. Transfira a fita recém cortada das seções teciduais para o banho de flutuação de tecido pré-aquecido para montagem de slides (Figura 1B, C).
   NOTA: A água morna ajuda a "passar" as rugas nas seções (Figura 1C).
6. Manuseando cada seção sequencialmente, use fórceps para quebrar uma única seção da fita (Figura 1D).
7. Colete a única seção em um slide de microscópio pré-rotulado.
   1. Submergir o deslizamento do microscópio em um ângulo abaixo da seção, posicionando o slide de talão que a borda da seção tecidual toque o slide (Figura 1E).
   2. Uma vez em contato com a seção de tecido, puxe o slide para fora do banho de flutuação lentamente para permitir que a seção de tecido para endireitar a descarga contra o slide à medida que emerge da água (Figura 1F).
8. Monte 1 seção de tecido por lâmina e repita até que todas as seções tenham sido coletadas.
9. Deixe que as seções de tecido montadas em slides sequem completamente à temperatura ambiente (RT).

2. Revisão patológica

1. Realize a coloração de H&E em uma seção de tecido representativo para cada bloco⁹.
2. Envie os H&Es recém-manchados para revisão patológica por um patologista certificado pelo conselho.
   NOTA: Durante a revisão, o patologista determina e registra o percentual de conteúdo tumoral em cada tecido e circula a área do tumor em cada slide de H&E (ver Figura 2 e Figura 3, Linha 1). A Tabela 1 descreve o conteúdo percentual do tumor por celularidade determinado durante a revisão patológica dos H&Es para amostras A-E mostradas na Figura 3, Linha 1. Seções com <60% de teor de tumor requerem macrodiscção⁷. O número de seções necessárias para a extração de ácido nucleico depende do tamanho da área do tumor circulado. Se seções insuficientes foram cortadas na seção 1 do protocolo e novos cortes são possíveis, então seções adicionais podem precisar ser cortadas.

3. Desparafinação

1. Em um capô de fumaça, preenchie dois pratos de coloração de vidro com histologia não diluída grau d-Limonene ou um solvente à base de d-Limonene e 1 prato de coloração de vidro com etanol molecular de 200 à prova não diluído.
   ATENÇÃO: Evite o contato d-Limonene com a pele e os olhos, evite a inalação de vapor ou névoa e mantenha-se afastado das fontes de ignição. Mantenha o etanol longe do calor, faíscas e chamas abertas, evite derramar e entre em contato com a pele ou os olhos, ventile bem e evite respirar vapores.
   NOTA: Encha os pratos o suficiente para submergir os slides racked (Figura 4A); São necessários 250 mL para encher os 20 pratos de coloração de slides mostrados. Substitua as lavagens d-Limonene e etanol após cada 40 slides. D-Limonene (C₁₀H₁₆) é uma alternativa, igualmente eficaz, e menos tóxica agente de dewaxing para xileno que está se tornando mais comum em metodologias histológicas e produz boa qualidade de ácido nucleico pós extração 10,11,12,13,14. Embora este protocolo possa ser realizado utilizando alternativas mais bioamericas¹⁵, seus efeitos, se houver, na qualidade extraída do ácido nucleico permanecem a ser determinados.
2. Rack o tecido FFPE não manchado montado desliza para os racks de deslizamento coplin de vidro (Figura 4A, inset).
3. Submergir os slides racked em d-Limonene lavagem 1 por 2 min; agitar suavemente para os primeiros 20 s.
   NOTA: Para minimizar a carryover entre as lavagens, ao remover o rack de lâminas de uma lavagem, deixe o rack drenar brevemente antes de suavemente esfregar a parte inferior do rack no papel de tecido para remover o excesso de lavagem.
4. Submergir os slides racked em d-limonene não diluída lavagem 2 por 2 min; agitar suavemente para os primeiros 20 s. Retire, escorra e desemaça novamente o rack.
5. Submergir os slides racked na lavagem do etanol por 2 min; agitar suavemente para os primeiros 20 s. Remova o rack e coloque-o sobre um tecido absorvente para drenar. Deixe os slides secarem pelo menos 10 minutos, mas não mais do que 2h.

3. Macrodisseção

1. No banco, preenche um frasco de vidro Coplin com 50 mL de 3% de glicerol em DNase/RNase água livre
   NOTA: Substitua a lavagem de glicerol após cada 40 slides.
2. Microtubos de pré-rotulagem e pré-preenchimento de 1,5 mL com 160 μL de tampão de digestão de tecido por microtubo.
   NOTA: Extrações de ácido nucleico realizadas após a macrodisseção utilizaram um kit de extração de DNA/RNA FFPE (Tabela de Materiais). Assim, o tampão de digestão tecidual utilizado neste protocolo compreendeu 10 μL de Proteinase K e 150 μL de tampão PKD.
3. Rastreie as marcas patológicas no H&E na parte de trás das lâminas de tecido desparafinadas.
   NOTA: Comparados aos tecidos não desparafinados (Figura 3, Linha 2 e Figura 4B), os tecidos desparafinados são brancos e altamente visíveis (Figura 3, Linha 3 e Figura 4C). É essa visibilidade aumentada e discernimento de características de tecidos desparafinadas que permitem a macrodisseção. Coloque o H&E de bruços no banco e coloque a frente do slide desparaffinizado contra a parte de trás do patologista combinado revisado H&E (Figura 4D). Alinhe o tecido desparafinado com o tecido H&E (Figura 4E). Traçar as marcas do patologista é um passo crítico no processo de macrodisseção, e deve-se tomar cuidado para reproduzir essas marcas da forma mais precisa possível. Isso pode ser particularmente desafiador para tecidos pequenos e ou desconectados, como as amostras B, D e E (Figura 3, Figura 4E e Figura 4E inset i). Para auxiliar no rastreamento, deve-se usar um marcador fino ou ultrafino (Figura 4E, inset ii) para rastrear as marcas desenhadas pelo patologista. Os lenços de etanol podem ser úteis para remover erros e permitir a retração, se necessário.
4. Gire o tecido desparafinado agora marcado para cima e trace a linha do marcador com o canto de uma lâmina de barbear limpa para pré-cortar as bordas da área do tumor.
5. Manuseando cada slide sequencialmente, mergulhe os slides desparafinados na solução de 3% de glicerol. Certifique-se de que o tecido está completamente submerso antes de remover o slide lentamente (Figura 4F).
   NOTA: O objetivo do mergulho de glicerol é umedecerar o tecido para auxiliar a coleta de tecidos, mas também reduzir o acúmulo de carga estática que pode causar repulsa entre o tecido e o microtubo plástico no qual o tecido coletado deve ser colocado.
6. Limpe suavemente a parte de trás da lâmina com um tecido para remover o excesso de solução de glicerol, e coloque o slide no banco, de lado limpo para baixo. Deixe os tecidos se arejarem brevemente por 1-2 min.
   NOTA: O transporte do excesso de glicerol no processo de extração pode afetar negativamente o rendimento e a qualidade das extrações de ácido nucleico. Os tecidos devem estar ligeiramente úmidos, mas não visivelmente molhados quando coletados.
7. Dependendo de onde a área de interesse tumoral está situada na lâmina, use a borda plana da lâmina de barbear para coletar diretamente o tecido tumoral, usando a navalha para raspar/coletar o tecido de interesse da lâmina, ou (b) remover e descartar o tecido não tumoral primeiro antes de coletar o tecido tumoral de interesse (Figura 3).
   NOTA: O tecido coletado tende a recolher ou enrolar na parte inferior da lâmina (Figura 4G)
8. Use uma vara de madeira para remover o tecido coletado da lâmina (Figura 4H e inset) e transfira-o para o microtubo pré-rotulado e pré-preenchido apropriado (Figura 4I).
   NOTA: O tampão de digestão serve para "puxar" o tecido da picareta de madeira para dentro do líquido.
9. Prossiga para a extração de ácido nucleico.
   NOTA: As extrações de ácido nucleico foram concluídas utilizando-se o kit de extração de DNA/RNA FFPE de acordo com as instruções do fabricante, e os ácidos nucleicos resultantes foram quantificados por meio de um espectrofotômetro UV-vis. O RNA resultante foi executado no ensaio DLBCL90 baseado em perfil genético digital¹⁶.

Um total de 5 linfomas FFPE (DLBCL) foram seccionados, e as seções resultantes foram macrodissectadas ou não antes da extração de ácido nucleico. O RNA extraído foi executado no ensaio DLBCL9016. As amostras macrodissectadas foram executadas duas vezes, uma vez utilizando 5 μL de concentração de estoque de RNA, mas não mais do que 300 ng de entrada total de RNA e uma vez usando 5 μL de estoque de RNA diluído para corresponder aos insumos de RNA de suas respectivas contrapartes não dissecadas. Os resultados do DLBCL90 estão descritos na Tabela 2.

O DLBCL é composto por 3 subtipos de células distintas de origem (COO) com diferentes responsividade terapêutica, ou seja, GCB, ABC, e um grupo intermediário conhecido como unclassified ou UNC17,18. Translocações envolvendo MYC, BCL2 e ou BCL6 sozinhos ou em combinação (duplo ou triplo hit) também são frequentemente observadas no DLBCL, particularmente no subtipoGCB 19. O ensaio DLBCL90 é uma expansão de seu antecessor, o ensaio clínico Lymph2Cx, e é, portanto, capaz de determinar o subtipo DLBCL COO, mas foi desenvolvido principalmente para identificar amostras que abrigam translocações de duplo hit (DH) envolvendo BCL2 usando expressão genética digital como alternativa à hibridização de fluorescência in-situ (FISH)16,20. Os resultados da Tabela 2 mostram que a macrodisseção alterada tanto o COO quanto o status DHITsig exige 60% (3/5) das amostras examinadas.

A macrodisseção da amostra A não teve efeito na chamada COO, mas alterou a chamada DHITsig de NEG para UNCLASS, e essa alteração foi observada independentemente da entrada de RNA da amostra macrodissectada e com escores de probabilidade semelhantes (0,224, 0,254). Em contraste, a macrodisseção da amostra C não teve efeito na chamada DHITsig, mas alterou a chamada COO de GCB para UNC. Mais uma vez, essa mudança foi observada independentemente da entrada de RNA amostral macrodissectada. No entanto, em 0,117, a probabilidade de chamada de COO estava mais próxima do limiar de chamada de 0,1 para a amostra macrodissectada com entrada RNA reduzida. Semelhante à amostra A, a macrodisseção da amostra E não teve efeito na chamada COO, mas alterou a chamada DHITsig. No entanto, para a amostra E, a chamada mudou de UNCLASS para NEG e o fez independentemente da entrada de RNA de amostra macrodissectada com chamadas de probabilidade razoavelmente semelhantes (0,849, 0,833). Notavelmente, esta mudança de chamada para DHITsig NEG faz sentido biológico, dado que a amostra E foi encontrada para a ABC-DLBCL, e translocações de duplo sucesso envolvendo BCL2 foram relatadas para serem observadas exclusivamente no GCB-DLBCL19.

Figura 1: Gerando seções de tecido montadas em lâminas usando um bloco de tecido FFPE mantido no lugar pelo mandril de microtome e cortado para produzir uma fita de seções de tecido FFPE sequencial. (B) Utilizando varas de madeira pré-encharcadas, a fita é coletada do microtome e transferida para um banho de água morna. (C) O calor da água ajuda a passar as dobras na fita de tecido. (D) As seções individuais de tecido FFPE são removidas da fita de tecido colocando fórceps fechados na junção de duas seções e abrindo suavemente os fórceps, que se separam um do outro. (E) As seções são coletadas da água submergindo uma lâmina de vidro em um ângulo e movendo suavemente o lado em direção à seção tecidual até que a borda da seção toque na lâmina de vidro. (F) Uma vez que a lâmina e a seção estejam tocando, remova lentamente o escorregador da água, permitindo que a seção do tecido caia contra a lâmina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Revisão patológica e histológica de seções manchadas de hematoxilina e eosina (H&E). (C,D) Uma vez que o patologista tenha visto todo o tecido e descoberto que não é 100% tecido tumoral, o patologista usará um marcador para cercar a área tumoral do tecido. (E,F) Segurar o H&E marcado contra o bloco de tecido FFPE original mostra que nem todo o tecido é material tumoral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Amostras de tecido. Esta imagem demonstra as seções patologicamente revisadas e marcadas pelo tumor H&Es (Linha 1), seções de tecido FFPE não processadas (Linha 2), seções de tecido FFPE desparafinadas montadas em slides (Linha 3), montagem desparafinada 000 Seções de tecidoffpe com marcas patológicas traçadas na parte de trás do slide (Linha 4), seções de tecido FFPE desparafinadas e macrodissectadas (Linha 5) para as 5 amostras (A-E) utilizadas para demonstrar este protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Desparaffinização e macro-dissecção de seções de tecido FFPE: (A) Em um capô de fumaça, os tecidos FFPE montados em um rack de slides são lavados em duas lavagens de d-limoneno e uma lavagem de etanol. (B,C) Pós-lavagem, toda a parafina foi removida, e apenas o tecido permanece na lâmina, que agora é branca e altamente visível em comparação com sua contraparte pré-lavada. (D) A seção de tecido desparafinada montada na parte de slide é colocada de bruços na parte de trás de sua marca correspondente H&E. (E) As marcas da área do tumor no H&E são então rastreadas na parte de trás do slide desparafinado usando um marcador permanente fino ou ultrafino (F) A seção de tecido desparafinado desparaffinizada é então mergulhada em uma seção de glicerolização para lavar a seção de tecido para a coleta. O slide é removido lentamente do glicerol, e a parte de trás do slide limpa com um tecido para remover o excesso de glicerol antes de colocar o tecido de lâmina face-up no banco. (G) Utilizando o lado plano de uma lâmina de barbear limpa, o tecido é macrodisstado, e o tecido indesejado fora das marcas patologistas é descartado antes de coletar o tecido de interesse, que se reúne ao longo da borda da lâmina. (H) Uma vara de madeira é usada para remover o tecido coletado da borda da lâmina. (I) O tecido é então transferido para um tampão de digestão de tecido pré-preenchido de microtubos pré-enchido e está pronto para extração de ácido nucleico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Dados de revisão patológica. A tabela mostra (a) o percentual de tumor viável em toda a seção tecidual por área, (b) o percentual de tumor viável na área circunvimentada/marcada pelo patologista durante a revisão por celularidade, (c) a célula celularidade tumoral geral estimada de todo o tecido (a x b), (d) o aumento estimado da dobra na celularidade tumoral alcançada com macrodisseção, (e e f) o número de seções de tecido ffpe não manchadas de 5 μm não manchadas extraídas e as concentrações de RNA resultantes para amostras não macrodissectadas e macrodissectadas. % Outros referem-se a todos os outros tecidos presentes em uma determinada amostra que não é tecido tumoral e podem incluir tecido conjuntivo, fibroblastos estromamais, vasos sanguíneos, bem como outros elementos estrômicos inerentes. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Resultados de ensaio de expressão genética digital DLBCL90. Cinco amostras (A-E) não foram macrodissectadas ou macrodissectadas antes da realização de extrações de ácido nucleico. O RNA resultante foi executado no ensaio DLBCL90, para o qual o volume máximo de entrada de RNA é de 5 μL. As amostras não macrodissectadas foram executadas usando 5 μL de RNA de estoque. Cada amostra macrodissectada foi executada duas vezes usando (a) 5 μL de RNA de estoque, a menos que as alíquotas de 60 ng/μL fossem possíveis e (b) 5 μL de RNA de estoque diluído para corresponder às concentrações/entrada de suas contrapartes nãodissectadas. O sufixo _M denota que essa amostra foi macrodissectada. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Os autores não têm nada a revelar.