Name: Melhorando o conteúdo do tumor através da macrodisseção do tumor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Aprenda a técnica de macrodisseção para enriquecer o conteúdo tumoral em amostras de tecido FFPE. Este método melhora a precisão das análises genômicas ao isolar material tumoral de tecidos não tumorais.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabalho é apoiado pelo NIH financiado por AIDS e Recursos de Amostras de Câncer (<a href="https://www.acsr1.com/">ACSR</a>, UM1 CA181255-2) sob seu programa de ciência de bioespecimen. O vídeo foi filmado e a edição pós-produção foi realizada pela Mayo Clinic Media Services.

Todas as amostras foram coletadas e utilizadas em conformidade com os protocolos aprovados da Mayo Clinic IRB (PR16-000507 e PR2207-02).
1. Preparação da amostra
<ol><li>Ligue o banho de água de flutuação tecidual. Coloque a temperatura em 39 °C e deixe a água chegar à temperatura. Mergulhe varas de coleta de madeira no banho de água.</li>
	<li>Identifique e recupere os blocos de tecido FFPE a serem seccionados.</li>
	<li>Slides de microscópio pré-rótulo usando um marcador permanente de grau de histologia que pode suportar lavagens de solventes.</li>
	<li>Use um microtoma para separe os blocos FFPE. Corte pelo menos 2 seções de rosto completo a uma espessura de 4-5 μm por seção para cada bloco (Figura 1A).</li>
	<li>Transfira a fita recém cortada das seções teciduais para o banho de flutuação de tecido pré-aquecido para montagem de slides (Figura 1B, C). NOTA: A água morna ajuda a "passar" as rugas nas seções (Figura 1C).</li>
	<li>Manuseando cada seção sequencialmente, use fórceps para quebrar uma única seção da fita (Figura 1D).</li>
	<li>Colete a única seção em um slide de microscópio pré-rotulado.<ol>
<li>Submergir o deslizamento do microscópio em um ângulo abaixo da seção, posicionando o slide de talão que a borda da seção tecidual toque o slide (Figura 1E).</li>
		<li>Uma vez em contato com a seção de tecido, puxe o slide para fora do banho de flutuação lentamente para permitir que a seção de tecido para endireitar a descarga contra o slide à medida que emerge da água (Figura 1F).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monte 1 seção de tecido por lâmina e repita até que todas as seções tenham sido coletadas.</li>
	<li>Deixe que as seções de tecido montadas em slides sequem completamente à temperatura ambiente (RT).</li>
</ol>2. Revisão patológica
<ol><li>Realize a coloração de H&E em uma seção de tecido representativo para cada bloco9.</li>
	<li>Envie os H&Es recém-manchados para revisão patológica por um patologista certificado pelo conselho. NOTA: Durante a revisão, o patologista determina e registra o percentual de conteúdo tumoral em cada tecido e circula a área do tumor em cada slide de H&E (ver Figura 2 e Figura 3, Linha 1). A Tabela 1 descreve o conteúdo percentual do tumor por celularidade determinado durante a revisão patológica dos H&Es para amostras A-E mostradas na Figura 3, Linha 1. Seções com <60% de teor de tumor requerem macrodiscção7. O número de seções necessárias para a extração de ácido nucleico depende do tamanho da área do tumor circulado. Se seções insuficientes foram cortadas na seção 1 do protocolo e novos cortes são possíveis, então seções adicionais podem precisar ser cortadas.</li>
</ol>3. Desparafinação
<ol><li>Em um capô de fumaça, preenchie dois pratos de coloração de vidro com histologia não diluída grau d-Limonene ou um solvente à base de d-Limonene e 1 prato de coloração de vidro com etanol molecular de 200 à prova não diluído. ATENÇÃO: Evite o contato d-Limonene com a pele e os olhos, evite a inalação de vapor ou névoa e mantenha-se afastado das fontes de ignição. Mantenha o etanol longe do calor, faíscas e chamas abertas, evite derramar e entre em contato com a pele ou os olhos, ventile bem e evite respirar vapores. NOTA: Encha os pratos o suficiente para submergir os slides racked (Figura 4A); São necessários 250 mL para encher os 20 pratos de coloração de slides mostrados. Substitua as lavagens d-Limonene e etanol após cada 40 slides. D-Limonene (C10H16) é uma alternativa, igualmente eficaz, e menos tóxica agente de dewaxing para xileno que está se tornando mais comum em metodologias histológicas e produz boa qualidade de ácido nucleico pós extração 10,11,12,13,14. Embora este protocolo possa ser realizado utilizando alternativas mais bioamericas15, seus efeitos, se houver, na qualidade extraída do ácido nucleico permanecem a ser determinados.</li>
	<li>Rack o tecido FFPE não manchado montado desliza para os racks de deslizamento coplin de vidro (Figura 4A, inset).</li>
	<li>Submergir os slides racked em d-Limonene lavagem 1 por 2 min; agitar suavemente para os primeiros 20 s. NOTA: Para minimizar a carryover entre as lavagens, ao remover o rack de lâminas de uma lavagem, deixe o rack drenar brevemente antes de suavemente esfregar a parte inferior do rack no papel de tecido para remover o excesso de lavagem.</li>
	<li>Submergir os slides racked em d-limonene não diluída lavagem 2 por 2 min; agitar suavemente para os primeiros 20 s. Retire, escorra e desemaça novamente o rack.</li>
	<li>Submergir os slides racked na lavagem do etanol por 2 min; agitar suavemente para os primeiros 20 s. Remova o rack e coloque-o sobre um tecido absorvente para drenar. Deixe os slides secarem pelo menos 10 minutos, mas não mais do que 2h.</li>
</ol>3. Macrodisseção
<ol><li>No banco, preenche um frasco de vidro Coplin com 50 mL de 3% de glicerol em DNase/RNase água livre NOTA: Substitua a lavagem de glicerol após cada 40 slides.</li>
	<li>Microtubos de pré-rotulagem e pré-preenchimento de 1,5 mL com 160 μL de tampão de digestão de tecido por microtubo. NOTA: Extrações de ácido nucleico realizadas após a macrodisseção utilizaram um kit de extração de DNA/RNA FFPE (Tabela de Materiais). Assim, o tampão de digestão tecidual utilizado neste protocolo compreendeu 10 μL de Proteinase K e 150 μL de tampão PKD.</li>
	<li>Rastreie as marcas patológicas no H&E na parte de trás das lâminas de tecido desparafinadas. NOTA: Comparados aos tecidos não desparafinados (Figura 3, Linha 2 e Figura 4B), os tecidos desparafinados são brancos e altamente visíveis (Figura 3, Linha 3 e Figura 4C). É essa visibilidade aumentada e discernimento de características de tecidos desparafinadas que permitem a macrodisseção. Coloque o H&E de bruços no banco e coloque a frente do slide desparaffinizado contra a parte de trás do patologista combinado revisado H&E (Figura 4D). Alinhe o tecido desparafinado com o tecido H&E (Figura 4E). Traçar as marcas do patologista é um passo crítico no processo de macrodisseção, e deve-se tomar cuidado para reproduzir essas marcas da forma mais precisa possível. Isso pode ser particularmente desafiador para tecidos pequenos e ou desconectados, como as amostras B, D e E (Figura 3, Figura 4E e Figura 4E inset i). Para auxiliar no rastreamento, deve-se usar um marcador fino ou ultrafino (Figura 4E, inset ii) para rastrear as marcas desenhadas pelo patologista. Os lenços de etanol podem ser úteis para remover erros e permitir a retração, se necessário.</li>
	<li>Gire o tecido desparafinado agora marcado para cima e trace a linha do marcador com o canto de uma lâmina de barbear limpa para pré-cortar as bordas da área do tumor.</li>
	<li>Manuseando cada slide sequencialmente, mergulhe os slides desparafinados na solução de 3% de glicerol. Certifique-se de que o tecido está completamente submerso antes de remover o slide lentamente (Figura 4F). NOTA: O objetivo do mergulho de glicerol é umedecerar o tecido para auxiliar a coleta de tecidos, mas também reduzir o acúmulo de carga estática que pode causar repulsa entre o tecido e o microtubo plástico no qual o tecido coletado deve ser colocado.</li>
	<li>Limpe suavemente a parte de trás da lâmina com um tecido para remover o excesso de solução de glicerol, e coloque o slide no banco, de lado limpo para baixo. Deixe os tecidos se arejarem brevemente por 1-2 min. NOTA: O transporte do excesso de glicerol no processo de extração pode afetar negativamente o rendimento e a qualidade das extrações de ácido nucleico. Os tecidos devem estar ligeiramente úmidos, mas não visivelmente molhados quando coletados.</li>
	<li>Dependendo de onde a área de interesse tumoral está situada na lâmina, use a borda plana da lâmina de barbear para coletar diretamente o tecido tumoral, usando a navalha para raspar/coletar o tecido de interesse da lâmina, ou (b) remover e descartar o tecido não tumoral primeiro antes de coletar o tecido tumoral de interesse (Figura 3). NOTA: O tecido coletado tende a recolher ou enrolar na parte inferior da lâmina (Figura 4G)</li>
	<li>Use uma vara de madeira para remover o tecido coletado da lâmina (Figura 4H e inset) e transfira-o para o microtubo pré-rotulado e pré-preenchido apropriado (Figura 4I). NOTA: O tampão de digestão serve para "puxar" o tecido da picareta de madeira para dentro do líquido.</li>
	<li>Prossiga para a extração de ácido nucleico. NOTA: As extrações de ácido nucleico foram concluídas utilizando-se o kit de extração de DNA/RNA FFPE de acordo com as instruções do fabricante, e os ácidos nucleicos resultantes foram quantificados por meio de um espectrofotômetro UV-vis. O RNA resultante foi executado no ensaio DLBCL90 baseado em perfil genético digital16.</li>
</ol>

<ol><li>Mathieson, W., Thomas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+biospecimens+must+be+used+in+genomic+medicine%3A+An+evidence-based+review+and+conclusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).</li>
<li>Robetorye, R. S., Maguire, A., Rosenthal, A. C., Rimsza, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+lymphoma+from+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Profiling of lymphoma from formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Seminars in Hematology. 56 (1), 46-51 (2019).</li>
<li>Moorcraft, S. Y., Gonzalez, D., Walker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+next+generation+sequencing+in+oncology%3A+A+guide+for+oncologists%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Understanding next generation sequencing in oncology: A guide for oncologists.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 96 (3), 463-474 (2015).</li>
<li>Haile, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+high+throughput+nucleic+acid+purification+from+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+samples+for+next+generation+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated high throughput nucleic acid purification from formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples for next generation sequence analysis.</a> PLoS One. 12 (6), 0178706(2017).</li>
<li>Oh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+accuracy+of+whole-exome+sequencing+with+formalin-fixed+paraffin-embedded+and+fresh+frozen+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of accuracy of whole-exome sequencing with formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen tissue samples.</a> PLoS One. 10 (12), 0144162(2015).</li>
<li>Holley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+clonal+profiling+of+formalin+fixed+paraffin+embedded+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Deep clonal profiling of formalin fixed paraffin embedded clinical samples.</a> PLoS One. 7 (11), 50586(2012).</li>
<li>Network T.C.G.A.R. TCGA Tissue sample requirements: High quality requirements yield high quality data. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/structural-genomics/tcga/studied-cancers">https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/structural-genomics/tcga/studied-cancers</a> (2021).</li>
<li>Javey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+tumor+tissue+dissection+tool+for+molecular+oncology+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%3A+JMD%22%5BJournal%5D)">Innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics.</a> The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 23 (4), 399-406 (2021).</li>
<li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li>
<li>Duan, Q., Zhang, H., Zheng, J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+cold+into+hot%3A+Firing+up+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Turning cold into hot: Firing up the tumor microenvironment.</a> Trends in Cancer. 6 (7), 605-618 (2020).</li>
<li>Kim, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+evaluation+and+risk+assessment+of+d-Limonene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicology+and+Environmental+Health+Part+B%3A+Critical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Safety evaluation and risk assessment of d-Limonene.</a> Journal of Toxicology and Environmental Health Part B: Critical Reviews. 16 (1), 17-38 (2013).</li>
<li>Foti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occupational+contact+dermatitis+to+a+limonene-based+solvent+in+a+histopathology+technician%5BTitle%5D)+AND+%22Contact+Dermatitis%22%5BJournal%5D)">Occupational contact dermatitis to a limonene-based solvent in a histopathology technician.</a> Contact Dermatitis. 56 (2), 109-112 (2007).</li>
<li>Meuse, C. W., Barker, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+infrared+spectroscopy+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue+specimens%3A+paraffin+wax+removal+with+organic+solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+and+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Quantitative infrared spectroscopy of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue specimens: paraffin wax removal with organic solvents.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 17 (6), 547-552 (2009).</li>
<li>Schmeller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setting+out+the+frame+conditions+for+feasible+use+of+FFPE+derived+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+-+Research+and+Practice%22%5BJournal%5D)">Setting out the frame conditions for feasible use of FFPE derived RNA.</a> Pathology - Research and Practice. 215 (2), 381-386 (2019).</li>
<li>Prema, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofriendly+substitutes+for+xylene+in+deparaffinization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biofriendly substitutes for xylene in deparaffinization.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 12, Suppl 1 623-630 (2020).</li>
<li>Ennishi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-hit+gene+expression+signature+defines+a+distinct+subgroup+of+germinal+center+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Double-hit gene expression signature defines a distinct subgroup of germinal center B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 37 (3), 190-201 (2019).</li>
<li>Alizadeh, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+types+of+diffuse+large+B-cell+lymphoma+identified+by+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling.</a> Nature. 403 (6769), 503-511 (2000).</li>
<li>Rosenwald, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+molecular+profiling+to+predict+survival+after+chemotherapy+for+diffuse+large-B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse large-B-cell lymphoma.</a> The New England Journal of Medicine. 346 (25), 1937-1947 (2002).</li>
<li>Scott, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-grade+B-cell+lymphoma+with+MYC+and+BCL2+and%2For+BCL6+rearrangements+with+diffuse+large+B-cell+lymphoma+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-grade B-cell lymphoma with MYC and BCL2 and/or BCL6 rearrangements with diffuse large B-cell lymphoma morphology.</a> Blood. 131 (18), 2060-2064 (2018).</li>
<li>Scott, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+cell-of-origin+subtypes+of+diffuse+large+B-cell+lymphoma+using+gene+expression+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Determining cell-of-origin subtypes of diffuse large B-cell lymphoma using gene expression in formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Blood. 123 (8), 1214-1217 (2014).</li>
<li>Heinrich, M. A., Mostafa, A., Morton, J. P., Hawinkels, L., Prakash, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+complexity+and+heterogeneity+of+pancreatic+tumor%3A+3D+in+vitro+to+in+vivo+models%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Translating complexity and heterogeneity of pancreatic tumor: 3D in vitro to in vivo models.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 174, 265-293 (2021).</li>
<li>Erickson, H. S., Gillespie, J. W., Emmert-Buck, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 424, 433-448 (2008).</li>
<li>Geiersbach, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digitally+guided+microdissection+aids+somatic+mutation+detection+in+difficult+to+dissect+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genetics%22%5BJournal%5D)">Digitally guided microdissection aids somatic mutation detection in difficult to dissect tumors.</a> Cancer Genetics. 209 (1-2), 42-49 (2016).</li>
<li>de Bruin, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrodissection+versus+microdissection+of+rectal+carcinoma%3A+minor+influence+of+stroma+cells+to+tumor+cell+gene+expression+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Macrodissection versus microdissection of rectal carcinoma: minor influence of stroma cells to tumor cell gene expression profiles.</a> BMC Genomics. 6, 142(2005).</li>
<li>Ramsower, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+laboratory+validation+of+the+MCL35+assay+for+molecular+risk+stratification+of+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematopathology%22%5BJournal%5D)">Clinical laboratory validation of the MCL35 assay for molecular risk stratification of mantle cell lymphoma.</a> Journal of Hematopathology. 13 (4), 231-238 (2020).</li>
<li>Maguire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+DNA+repair+and+genomic+stability+identify+a+novel+HIV-related+diffuse+large+B-cell+lymphoma+signature%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Enhanced DNA repair and genomic stability identify a novel HIV-related diffuse large B-cell lymphoma signature.</a> International Journal of Cancer. 145 (11), 3078-3088 (2019).</li>
<li>Rosenwald, A., Staudt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of diffuse large B-cell lymphoma.</a> Leukemia & Lymphoma. 44, Suppl 3 41-47 (2003).</li>
<li>Wright, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+probabilistic+classification+tool+for+genetic+subtypes+of+diffuse+large+B+cell+lymphoma+with+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A probabilistic classification tool for genetic subtypes of diffuse large B cell lymphoma with therapeutic implications.</a> Cancer Cell. 37 (4), 551-568 (2020).</li>
<li>Hilton, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+double-hit+signature+identifies+double-hit+diffuse+large+B-cell+lymphoma+with+genetic+events+cryptic+to+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The double-hit signature identifies double-hit diffuse large B-cell lymphoma with genetic events cryptic to FISH.</a> Blood. 134 (18), 1528-1532 (2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os tecidos FFPE são frequentemente misturas heterogêneas de tecidos tumorais e não tumorais. Testes genômicos de alta sensibilidade estão se tornando cada vez mais prevalentes em ambientes clínicos e de pesquisa, mas podem ser confundidos pela presença de tecido não tumoral contaminante. De fato, um teor mínimo de tumor de 60% é frequentemente recomendado para estudos genômicos. O tumor percentual pode ser determinado pela área de tecido ocupada pelo material tumoral ou pela proporção de células tumorais dentro do tecido. Embora o tumor por área seja uma métrica comumente usada para a pureza do tumor, nem sempre retrata uma descrição precisa do tecido. Considere dois tecidos, ambos com 1000 células, dos quais 500 são células tumorais. No tecido A, as 500 células não tumorais são células estromamicanas com volumes semelhantes aos da célula tumoral. Nesse tecido, o percentual de tumor pode ser considerado 50% tanto pela celularidade quanto pela área. No tecido B, as 500 células não tumorais são células de gordura com volumes que são 4x que a célula tumoral. Nesse tecido, o percentual de tumor ainda é de 50% por celularidade, mas 20% por área. Um terceiro tecido, tecido C, é composto por 500 células tumorais mais 400 células de gordura e 800 células estrômicas com volumes que são 4x e 0,5x que as células tumorais, respectivamente. Dado que 100 células de gordura equivalem ao volume de 800 células estromas, a porcentagem de tumor de tecido C é de 29% por celularidade (500/1700), mas ainda 20% por área. O tecido D também é composto por células tumorais, gordura e estroma, com proporções de volume de 1x, 4x e 0,1x. No entanto, o número de células é de 400, 10 e 720, respectivamente. Assim, o percentual de tumor de tecido D é de 35% por celularidade (400/1130), mas 78% por área. Esses exemplos são excessivamente simplistas e não refletem composições teciduais do mundo real, mas transmitem claramente a importância da composição tecidual e a diferença entre o conteúdo tumoral por área e pela celularidade. É importante ressaltar que, quando se trata de enriquecer o conteúdo tumoral para extração de ácido nucleico a jusante, a celularidade tumoral é o atributo mais importante devido ao potencial de confusão aumentado de extrair material genômico de mais células não tumorais do que as células tumorais. Isso não apenas reforça a necessidade de avaliar o conteúdo tumoral dos tecidos em termos de porcentagem de celularidade, mas também a necessidade de extirto de tecido indesejado, a fim de minimizar eventuais efeitos negativos do tecido não tumoral. Existem vários métodos disponíveis para enriquecimento tecidual, sendo os principais macrodisseção e microdisseção.
A macrodisseção, método descrito neste protocolo, é relativamente rápida, simples e não requer equipamentos caros ou especializados. Embora a macrodisseção possa melhorar muito o conteúdo tumoral, é importante entender que ele não elimina completamente o material não tumoral. O objetivo da macrodisseção é enriquecer o tecido de interesse suficientemente através da exclusão de tecido indesejado, a fim de reduzir o "ruído" decorrente do tecido indesejado, que por sua vez pode aumentar o sinal de interesse do tecido de interesse. Assim, o enriquecimento tumoral mediado pela macrodisseção é uma maneira de aumentar a relação sinal-ruído, a fim de detectar melhor marcadores de interesse, particularmente marcadores moleculares específicos do tumor com baixa abundância ou má expressão. No entanto, a macrodisseção tem limitações devido à falta de precisão oferecida por ferramentas grosseiras, como lâminas de barbear e é suscetível a questões de precisão decorrentes da espessura da linha do marcador do patologista, bem como possíveis erros ao rastrear as demarcações H&E dos patologistas. Como aludido acima, não é possível alcançar 100% de pureza tumoral devido à presença de elementos estromais inerentes e indutores de tumores (ou seja, tecido conjuntivo, fibroblastos estrômicos, vasos sanguíneos, linfócitos reativos benignos, macrófagos) incorporados dentro do próprio tumor. De fato, muitas malignidades invasivas ou difusivamente infiltrativas induzem uma resposta estromal desmoplástica robusta, resultando em aglomerados de células tumorais que são intimamente misturadas com fibroblastos estrômicos e outros tipos de células não neoplásicas; onde tumores associados a esse padrão de reação estroma, como os tecidos de câncer de pâncreas21, podem se beneficiar mais da microdisseção digitalmente guiada do que da macrodisseção manual. 
A microdisseção manual é realizada sob um microscópio para auxiliar na identificação, dissecção e isolamento de tecidos de células específicas ou populações usando uma agulha ou bisturi e tem a vantagem de aumentar a precisão sobre a macrodisseção22. No entanto, a microdissecção manual é um processo trabalhoso que carece da finesse necessária para tecidos complexos com baixo teor de tumor ou características intrincadas que são incompatíveis com dissecção manual. Esses tecidos podem ser dissecados usando métodos automatizados de alta precisão, como microdisseção de captura de laser. De fato, a microdissecção digitalmente guiada tem se mostrado que produz conteúdo de tumor percentual maior em comparação com a macrodisseção manual nos tecidos de câncer de pâncreas23. No entanto, as desvantagens desses métodos automatizados de alta precisão, como a necessidade de equipamentos especializados, caros e indivíduos altamente treinados, têm dificultado sua incorporação em fluxos de trabalho. Um estudo realizado por de Bruin et al. comparando os efeitos da macrodisseção e microdisseção de captura a laser (LCM) no perfil de expressão genética descobriu que as amostras de LCM tinham baixo rendimento total de RNA (média de 30 ng) e necessitavam de duas rodadas de amplificação de mRNA para atender ao limiar de entrada de preparação da biblioteca cDNA24. Os autores descobriram que os perfis resultantes de expressão genética LCM foram afetados pelas rodadas de amplificação do mRNA mais do que perfis macrodissectados foram afetados por contribuições estrômicas não tumorais e concluíram que a macrodisseção poderia ser adequadamente utilizada para gerar dados confiáveis de expressão genética24. 
Uma vantagem significativa do perfil de expressão genética digital NanoString, particularmente quando se trabalha com RNA derivado de FFPE altamente degradado, é que ele não requer processos dependentes enzimáticos, como amplificação de RNA ou preparação de bibliotecas cDNA. No entanto, os ensaios são tipicamente otimizados para insumos entre 50-300 ng do total de RNA 25,26, que, com base nos achados de De Bruin et al.24, podem não ser compatíveis com tecidos microdisstados sem aumentar a entrada de tecido; uma demanda desfavorável em uma era onde amostras de tecido são cada vez mais coletadas como pequenas biópsias em vez de ressecções cirúrgicas. As entradas de RNA utilizadas para o ensaio DLBCL90 variaram de 68,5-300 ng para os tecidos macrodissectados e não dissecados. Os resultados mostram que a macrodisseção resultou em alterações de chamada em 60% das amostras examinadas e que essas alterações foram observadas independentemente da entrada de RNA das amostras macrodissectadas. No entanto, a probabilidade de COO para a entrada de RNA baixa invadiu o limiar de chamada de probabilidade COO GCB/UNC, onde os limiares são de 0 a <0,1 para GCB, 0,1-0,9 para UNC e >0,9 a 1,0 para o ABC chama20. Os principais subtipos de COO da DLBCL são o GCB e o ABC, que representam 41% e 44% de todos os casos de DLBCL, com a UNC representando um grupo intermediário dos dois e o ABC sendo o mais agressivo20,27. Assim, embora a mudança de chamada de COO na macrodisseção da amostra C não tenha causado uma mudança franca no subtipo de COO de GCB para ABC, a mudança do GCB para a UNC pode sugerir uma mudança para uma doença mais agressiva. Além disso, estudos recentes indicam que o subtipo unc não é simplesmente um subtipo intermediário e que pode potencialmente possuir atributos terapeuticamente exploráveis subtipo28. Da mesma forma, a macrodisseção das amostras A e E não causou alterações francas nas chamadas DHITsig de DH negativo para DH positivo, ou vice-versa. No entanto, os movimentos de uma amostra de GCB (amostra A) de NEG para UNCLASS e uma amostra de ABC (amostra E) da UNCLASS para neg após a macrodisseção são biologicamente apropriados, pois translocações de duplo impacto envolvendo BCL2 são relatadas como um fenômeno GCB exclusivamenteGCB 19. Embora as translocações sejam tradicionalmente e onipresentemente detectadas pelo FISH em ambientes clínicos, há um impulso crescente para identificar um método alternativo menos envolvido e demorado para sua detecção. O ensaio DLBCL90 é uma ferramenta importante que aborda essa necessidade, onde a lógica para seu uso é reforçada pela constatação de que este ensaio é capaz de detectar translocações enigmáticas para sondas FISH utilizadas no diagnóstico clínico29.
O protocolo de macrodisseção descrito acima descreve um método simples que permite aos pesquisadores aumentar o conteúdo tumoral de amostras de tecido que normalmente ficariam abaixo dos limites de critérios de inclusão do estudo comumente usados. A macrodisseção em um fluxo de trabalho de estudo permite que os pesquisadores resgatem tecidos mal tumorais densos da exclusão do estudo, aumentando seu conteúdo tumoral. Por sua vez, isso permite maior confiança de que os elunatos de RNA e DNA resultantes representam o tumor sob investigação genômica. Embora existam outros métodos mais precisos para dissecção tecidual, para tumores que crescem de forma mais expansiva, não-infiltrativa, semelhante a folhas ou sólidas, a macrodisseção é provavelmente suficiente. Os resultados aqui apresentados destacam a importância da pureza tumoral em ensaios genômicos e macrodisseção como uma ferramenta confiável para isso.

Os tecidos incorporados à parafina (FFPE), coletados como parte do processo de diagnóstico clínico normal e retidos em repositórios de tecido clínico, representam um vasto recurso para a pesquisa humana, incluindo a pesquisa sobre câncer1. À medida que nossa compreensão da doença humana se aprofunda, está cada vez mais claro que as doenças, antes consideradas entidades únicas baseadas em características morfológicas e imunofenópicas, são de fato compostas por subtipos moleculares distintos que requerem ensaios de subtipos moleculares. Consequentemente, ensaios genômicos de alta sensibilidade capazes de discernir esses subtipos tornaram-se cada vez mais importantes2. Embora os tecidos FFPE sejam renomados por serem pouco compatíveis com técnicas genômicas devido a problemas relacionados à fixação, à medida que a tecnologia e os protocolos evoluem, essas técnicas estão se tornando cada vez mais compatíveis com esse formato de tecido clinicamente onipresente 3,4,5. No entanto, os tecidos FFPE são frequentemente misturas de materiais de tecido tumoral e não tumoral, onde a presença de material não tumoral é frequentemente indesejada e pode, se presente em alta proporção, prejudicar significativamente e impactar os resultados das análises genômicas6. De fato, um teor mínimo de tumor de 60% é frequentemente utilizado para tais análises, onde tecidos que ficam aquém desse limiar podem ser excluídos, apesar de cumprirem de outra forma os critériosdo estudo 7. Isso pode ser particularmente problemático em ambientes de doenças raras, onde os tecidos do paciente são preciosos e difíceis de coletar em números elevados.
Macrodisseção é um método que minimiza os efeitos do baixo teor tumoral reduzindo a quantidade de tecido normal3. A remoção de tal material não tumoral confuso antes da extração de ácido nucleico pode aumentar significativamente o teor percentual do tumor e, portanto, a pureza tumoral dos ácidos nucleicos extraídos. A ressecção tecidual depende criticamente de uma revisão patológica especializada, na qual a região tumoral é identificada e circulada em uma seção de tecido manchado de hematolina e eosina (H&E) recém-gerada por um patologista certificado pela placa8. O H&E circulado é então usado para orientar a remoção e coleta de tecidos indesejados e alvos, respectivamente. Este protocolo descreve as etapas da macrodisseção desde a revisão patológica até a colheita de tecidos realizadas no Laboratório de Núcleo Técnico de Recursos de Aids e Câncer (ACSR) da Clínica Mayo.

<table><tbody><tr><td>Kit de DNA/RNA FFPE</td> de 200 graus de etanol Decon 2701 <td></td><td></td> AllPrep Qiagen 80234 <td>Kit de extração de DNA/RNA FFPE</td></tr><tr><td>Coplin pots</td><td>Várias</td><td></td> sondas de DLBCL90 <td></td></tr><tr><td></td><td>NanoString</td><td>várias</td><td>Perfis de expressão gênica digital com base no ensaio de DLBCL90</td></tr><tr><td>d-Limoneno</td><td>VWR</td><td>89376-092</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Vários</td><td>x</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio de vidro</td><td>FisherBrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>VWR</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>Kits de mestre</td><td>NanoString</td><td>vários</td><td></td></tr><tr><td>micrótomos</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Microtubos</td><td>Ambion</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Scientific</td> Espectrofotômetro <td>ND-ONE-W</td><td>para qualificação de DNA, RNA e proteína</td></tr><tr><td>nCounter</td><td>NanoString</td><td>x</td><td>Plataforma de perfil de expressão gênica digital usada para executar o ensaio de DLBCL90</td></tr><tr><td>Marcador permanente</td><td>Electrib Microscope Sciences</td><td>72109-12</td><td></td></tr><tr><td>Dispensador de lâminas de barbear</td><td>Electrib Microscope Sciences</td><td>71985-10</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de barbear</td><td>Electrib Microscópio Sciences</td><td>71985-23</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de digestão de tecidos</td><td>Qiagen</td><td>80234</td><td></td></tr><tr><td>Água ultrapura</td><td>VWR</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Triângulo Biomedical Sciences</td><td>TFB-120</td><td></td></tr><tr><td>Bastão de madeira</td><td>FisherMarca</td><td>22363158</td><td></td></tr></tbody></table>

melhorando o conteúdo do tumor através da macrodisseção do tumor

Enhancing Tumor Content through Tumor Macrodissection

A presença de tecidos não tumorais contaminantes em tecidos parafinas fixas em formalina (FFPE) pode prejudicar muito os estudos genômicos. Aqui descrevemos a macrodisseção, um método projetado para aumentar o conteúdo percentual do tumor de uma amostra de tecido, removendo e eliminando tecido indesejado antes de realizar extrações de ácido nucleico a jusante. Os blocos de tecido FFPE foram seccionados para produzir seções de tecido montado em lâminas de 4-5 μm. Uma seção representativa foi submetida à coloração de hematoxilina e eosina (H&E) e posteriormente revisada por um patologista certificado pelo conselho. Durante a revisão, o patologista identificou e marcou as regiões do tecido tumoral no H&E. Uma vez concluído, o H&E demarcado foi usado para orientar a ressecção das seções não manchadas em série do mesmo bloco de tecido. Para demonstrar os efeitos da macrodisseção, o RNA extraído de linfomas difusos de células B (DLBCL) foram executados em um ensaio de expressão genética digital capaz de determinar o subtipo DLBCL e o status de translocação BCL2. Os resultados mostraram que a macrodisseção alterou as chamadas de status de translocação do subtipo ou BCL2 em 60% das amostras examinadas. Em conclusão, a macrodissecção é um método simples e eficaz para realizar o enriquecimento tumoral antes das extrações de ácido nucleico, o produto do qual pode ser usado com confiança em estudos genômicos a jusante.

Um total de 5 linfomas FFPE (DLBCL) foram seccionados, e as seções resultantes foram macrodissectadas ou não antes da extração de ácido nucleico. O RNA extraído foi executado no ensaio DLBCL9016. As amostras macrodissectadas foram executadas duas vezes, uma vez utilizando 5 μL de concentração de estoque de RNA, mas não mais do que 300 ng de entrada total de RNA e uma vez usando 5 μL de estoque de RNA diluído para corresponder aos insumos de RNA de suas respectivas contrapartes não dissecadas. Os resultados do DLBCL90 estão descritos na Tabela 2.
O DLBCL é composto por 3 subtipos de células distintas de origem (COO) com diferentes responsividade terapêutica, ou seja, GCB, ABC, e um grupo intermediário conhecido como unclassified ou UNC17,18. Translocações envolvendo MYC, BCL2 e ou BCL6 sozinhos ou em combinação (duplo ou triplo hit) também são frequentemente observadas no DLBCL, particularmente no subtipoGCB 19. O ensaio DLBCL90 é uma expansão de seu antecessor, o ensaio clínico Lymph2Cx, e é, portanto, capaz de determinar o subtipo DLBCL COO, mas foi desenvolvido principalmente para identificar amostras que abrigam translocações de duplo hit (DH) envolvendo BCL2 usando expressão genética digital como alternativa à hibridização de fluorescência in-situ (FISH)16,20. Os resultados da Tabela 2 mostram que a macrodisseção alterada tanto o COO quanto o status DHITsig exige 60% (3/5) das amostras examinadas.
A macrodisseção da amostra A não teve efeito na chamada COO, mas alterou a chamada DHITsig de NEG para UNCLASS, e essa alteração foi observada independentemente da entrada de RNA da amostra macrodissectada e com escores de probabilidade semelhantes (0,224, 0,254). Em contraste, a macrodisseção da amostra C não teve efeito na chamada DHITsig, mas alterou a chamada COO de GCB para UNC. Mais uma vez, essa mudança foi observada independentemente da entrada de RNA amostral macrodissectada. No entanto, em 0,117, a probabilidade de chamada de COO estava mais próxima do limiar de chamada de 0,1 para a amostra macrodissectada com entrada RNA reduzida. Semelhante à amostra A, a macrodisseção da amostra E não teve efeito na chamada COO, mas alterou a chamada DHITsig. No entanto, para a amostra E, a chamada mudou de UNCLASS para NEG e o fez independentemente da entrada de RNA de amostra macrodissectada com chamadas de probabilidade razoavelmente semelhantes (0,849, 0,833). Notavelmente, esta mudança de chamada para DHITsig NEG faz sentido biológico, dado que a amostra E foi encontrada para a ABC-DLBCL, e translocações de duplo sucesso envolvendo BCL2 foram relatadas para serem observadas exclusivamente no GCB-DLBCL19.
<img alt="Processo de seccionamento de micrótomos e preparação de lâminas, destacando o processamento de tecidos em laboratório." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62961/62961fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Gerando seções de tecido montadas em lâminas usando um bloco de tecido FFPE mantido no lugar pelo mandril de microtome e cortado para produzir uma fita de seções de tecido FFPE sequencial. (B) Utilizando varas de madeira pré-encharcadas, a fita é coletada do microtome e transferida para um banho de água morna. (C) O calor da água ajuda a passar as dobras na fita de tecido. (D) As seções individuais de tecido FFPE são removidas da fita de tecido colocando fórceps fechados na junção de duas seções e abrindo suavemente os fórceps, que se separam um do outro. (E) As seções são coletadas da água submergindo uma lâmina de vidro em um ângulo e movendo suavemente o lado em direção à seção tecidual até que a borda da seção toque na lâmina de vidro. (F) Uma vez que a lâmina e a seção estejam tocando, remova lentamente o escorregador da água, permitindo que a seção do tecido caia contra a lâmina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62961/62961fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Processo de microscopia; preparo da lâmina de tecido; inspeção óptica; configuração experimental; análise biológica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62961/62961fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Revisão patológica e histológica de seções manchadas de hematoxilina e eosina (H&amp;E). (C,D) Uma vez que o patologista tenha visto todo o tecido e descoberto que não é 100% tecido tumoral, o patologista usará um marcador para cercar a área tumoral do tecido. (E,F) Segurar o H&amp;E marcado contra o bloco de tecido FFPE original mostra que nem todo o tecido é material tumoral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62961/62961fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Resultado da cromatografia mostrando a separação de cores entre as amostras; O diagrama exibe o método de análise." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62961/62961fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Amostras de tecido. Esta imagem demonstra as seções patologicamente revisadas e marcadas pelo tumor H&amp;Es (Linha 1), seções de tecido FFPE não processadas (Linha 2), seções de tecido FFPE desparafinadas montadas em slides (Linha 3), montagem desparafinada 000 Seções de tecidoffpe com marcas patológicas traçadas na parte de trás do slide (Linha 4), seções de tecido FFPE desparafinadas e macrodissectadas (Linha 5) para as 5 amostras (A-E) utilizadas para demonstrar este protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62961/62961fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Preparo e secção de amostras de tecido para análise histológica; série de imagens detalhando processos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62961/62961fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Desparaffinização e macro-dissecção de seções de tecido FFPE: (A) Em um capô de fumaça, os tecidos FFPE montados em um rack de slides são lavados em duas lavagens de d-limoneno e uma lavagem de etanol. (B,C) Pós-lavagem, toda a parafina foi removida, e apenas o tecido permanece na lâmina, que agora é branca e altamente visível em comparação com sua contraparte pré-lavada. (D) A seção de tecido desparafinada montada na parte de slide é colocada de bruços na parte de trás de sua marca correspondente H&amp;E. (E) As marcas da área do tumor no H&amp;E são então rastreadas na parte de trás do slide desparafinado usando um marcador permanente fino ou ultrafino (F) A seção de tecido desparafinado desparaffinizada é então mergulhada em uma seção de glicerolização para lavar a seção de tecido para a coleta. O slide é removido lentamente do glicerol, e a parte de trás do slide limpa com um tecido para remover o excesso de glicerol antes de colocar o tecido de lâmina face-up no banco. (G) Utilizando o lado plano de uma lâmina de barbear limpa, o tecido é macrodisstado, e o tecido indesejado fora das marcas patologistas é descartado antes de coletar o tecido de interesse, que se reúne ao longo da borda da lâmina. (H) Uma vara de madeira é usada para remover o tecido coletado da borda da lâmina. (I) O tecido é então transferido para um tampão de digestão de tecido pré-preenchido de microtubos pré-enchido e está pronto para extração de ácido nucleico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62961/62961fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:font-size="7px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2" style="min-width: 80px;">ID de amostra</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 80px;">Tecido integral (a)</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 80px;">Área circular do tecido (b)</td>
			<td rowspan="2" style="min-width: 80px;">Conteúdo geral do tumor de tecido inteiro (c)</td>
			<td rowspan="2" style="min-width: 80px;">Aumento da dobra no conteúdo do tumor por macrodisseção (d)</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 80px;">Não macrodissectado (e)</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 80px;">Macrodissectados (f)</td>
		</tr>
<tr>
<td style="min-width: 80px;">% Tumor viável</td>
			<td style="min-width: 80px;">% Outros</td>
			<td style="min-width: 80px;">% Tumor viável</td>
			<td style="min-width: 80px;">% Outros</td>
			<td style="min-width: 80px;"># de slides de 5 μm extraídos</td>
			<td style="min-width: 80px;">RNA conc (ng/μL)</td>
			<td style="min-width: 80px;"># de slides de 5 μm extraídos</td>
			<td style="min-width: 80px;">RNA conc (ng/μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td style="min-width: 80px;">Amostra A</td>
			<td style="min-width: 80px;">60</td>
			<td style="min-width: 80px;">40</td>
			<td style="min-width: 80px;">75</td>
			<td style="min-width: 80px;">25</td>
			<td style="min-width: 80px;">45</td>
			<td style="min-width: 80px;">1.7</td>
			<td style="min-width: 80px;">2</td>
			<td style="min-width: 80px;">19.0</td>
			<td style="min-width: 80px;">4</td>
			<td style="min-width: 80px;">58.3</td>
		</tr>
<tr>
<td style="min-width: 80px;">Amostra B</td>
			<td style="min-width: 80px;">60</td>
			<td style="min-width: 80px;">40</td>
			<td style="min-width: 80px;">65</td>
			<td style="min-width: 80px;">35</td>
			<td style="min-width: 80px;">39</td>
			<td style="min-width: 80px;">1.7</td>
			<td style="min-width: 80px;">1</td>
			<td style="min-width: 80px;">34.0</td>
			<td style="min-width: 80px;">2</td>
			<td style="min-width: 80px;">60.0</td>
		</tr>
<tr>
<td style="min-width: 80px;">Amostra C</td>
			<td style="min-width: 80px;">40</td>
			<td style="min-width: 80px;">60</td>
			<td style="min-width: 80px;">65</td>
			<td style="min-width: 80px;">35</td>
			<td style="min-width: 80px;">26</td>
			<td style="min-width: 80px;">2.5</td>
			<td style="min-width: 80px;">1</td>
			<td style="min-width: 80px;">13.7</td>
			<td style="min-width: 80px;">2</td>
			<td style="min-width: 80px;">46.2</td>
		</tr>
<tr>
<td style="min-width: 80px;">Amostra D</td>
			<td style="min-width: 80px;">35</td>
			<td style="min-width: 80px;">65</td>
			<td style="min-width: 80px;">90</td>
			<td style="min-width: 80px;">10</td>
			<td style="min-width: 80px;">32</td>
			<td style="min-width: 80px;">2.9</td>
			<td style="min-width: 80px;">1</td>
			<td style="min-width: 80px;">57.3</td>
			<td style="min-width: 80px;">2</td>
			<td style="min-width: 80px;">60.0</td>
		</tr>
<tr>
<td style="min-width: 80px;">Amostra E</td>
			<td style="min-width: 80px;">20</td>
			<td style="min-width: 80px;">80</td>
			<td style="min-width: 80px;">30</td>
			<td style="min-width: 80px;">70</td>
			<td style="min-width: 80px;">6</td>
			<td style="min-width: 80px;">5.0</td>
			<td style="min-width: 80px;">3</td>
			<td style="min-width: 80px;">25.2</td>
			<td style="min-width: 80px;">3</td>
			<td style="min-width: 80px;">44.6</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Dados de revisão patológica. A tabela mostra (a) o percentual de tumor viável em toda a seção tecidual por área, (b) o percentual de tumor viável na área circunvimentada/marcada pelo patologista durante a revisão por celularidade, (c) a célula celularidade tumoral geral estimada de todo o tecido (a x b), (d) o aumento estimado da dobra na celularidade tumoral alcançada com macrodisseção, (e e f) o número de seções de tecido ffpe não manchadas de 5 μm não manchadas extraídas e as concentrações de RNA resultantes para amostras não macrodissectadas e macrodissectadas. % Outros referem-se a todos os outros tecidos presentes em uma determinada amostra que não é tecido tumoral e podem incluir tecido conjuntivo, fibroblastos estromamais, vasos sanguíneos, bem como outros elementos estrômicos inerentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62961/Table%201-62961R3.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">ID de amostra</td>
			<td>Entrada de RNA (ng)</td>
			<td>Chamada de COO DLBCL90</td>
			<td>Probabilidade de chamada DLBCL90</td>
			<td>Chamada DHITsig</td>
			<td>DHITsig pos probabilidade</td>
			<td>DHITsig neg probabilidade</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Não macrodissectado</td>
			<td>Amostra A</td>
			<td>95.0</td>
			<td>Gcb</td>
			<td>0.000</td>
			<td>Negativo</td>
			<td>0.135</td>
			<td>0.865</td>
		</tr>
<tr>
<td>Amostra B</td>
			<td>170.0</td>
			<td>Gcb</td>
			<td>0.000</td>
			<td>Negativo</td>
			<td>0.032</td>
			<td>0.968</td>
		</tr>
<tr>
<td>Amostra C</td>
			<td>68.5</td>
			<td>Gcb</td>
			<td>0.028</td>
			<td>Negativo</td>
			<td>0.033</td>
			<td>0.967</td>
		</tr>
<tr>
<td>Amostra D</td>
			<td>286.5</td>
			<td>Abc</td>
			<td>0.998</td>
			<td>Negativo</td>
			<td>0.002</td>
			<td>0.998</td>
		</tr>
<tr>
<td>Amostra E</td>
			<td>126.0</td>
			<td>Abc</td>
			<td>0.989</td>
			<td>CLASSE UNCLASS</td>
			<td>0.212</td>
			<td>0.788</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Macrodissectado</td>
			<td>A_M amostra</td>
			<td>291.7</td>
			<td>Gcb</td>
			<td>0.000</td>
			<td>CLASSE UNCLASS</td>
			<td>0.224</td>
			<td>0.776</td>
		</tr>
<tr>
<td>B_M amostra</td>
			<td>300.0</td>
			<td>Gcb</td>
			<td>0.000</td>
			<td>Negativo</td>
			<td>0.016</td>
			<td>0.984</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_M amostra</td>
			<td>231.2</td>
			<td>CLASSE UNCLASS</td>
			<td>0.210</td>
			<td>Negativo</td>
			<td>0.015</td>
			<td>0.985</td>
		</tr>
<tr>
<td>D_M amostra</td>
			<td>300.0</td>
			<td>Abc</td>
			<td>0.999</td>
			<td>Negativo</td>
			<td>0.002</td>
			<td>0.998</td>
		</tr>
<tr>
<td>E_M amostra</td>
			<td>223.2</td>
			<td>Abc</td>
			<td>0.987</td>
			<td>Negativo</td>
			<td>0.151</td>
			<td>0.849</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Macrodissected &amp; RNA diluído</td>
			<td>A_M amostra</td>
			<td>95.0</td>
			<td>Gcb</td>
			<td>0.000</td>
			<td>CLASSE UNCLASS</td>
			<td>0.254</td>
			<td>0.746</td>
		</tr>
<tr>
<td>B_M amostra</td>
			<td>170.0</td>
			<td>Gcb</td>
			<td>0.000</td>
			<td>Negativo</td>
			<td>0.023</td>
			<td>0.977</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_M amostra</td>
			<td>68.5</td>
			<td>CLASSE UNCLASS</td>
			<td>0.117</td>
			<td>Negativo</td>
			<td>0.027</td>
			<td>0.973</td>
		</tr>
<tr>
<td>D_M amostra</td>
			<td>286.5</td>
			<td>Abc</td>
			<td>0.999</td>
			<td>Negativo</td>
			<td>0.002</td>
			<td>0.998</td>
		</tr>
<tr>
<td>E_M amostra</td>
			<td>126.0</td>
			<td>Abc</td>
			<td>0.995</td>
			<td>Negativo</td>
			<td>0.167</td>
			<td>0.833</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Resultados de ensaio de expressão genética digital DLBCL90. Cinco amostras (A-E) não foram macrodissectadas ou macrodissectadas antes da realização de extrações de ácido nucleico. O RNA resultante foi executado no ensaio DLBCL90, para o qual o volume máximo de entrada de RNA é de 5 μL. As amostras não macrodissectadas foram executadas usando 5 μL de RNA de estoque. Cada amostra macrodissectada foi executada duas vezes usando (a) 5 μL de RNA de estoque, a menos que as alíquotas de 60 ng/μL fossem possíveis e (b) 5 μL de RNA de estoque diluído para corresponder às concentrações/entrada de suas contrapartes nãodissectadas. O sufixo _M denota que essa amostra foi macrodissectada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62961/Table%202-62961R3.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>

Este protocolo apresenta um método para aumentar o conteúdo percentual de tumores de amostras de tecido embutidas em parafina.

Melhorando o conteúdo do tumor através da macrodisseção do tumor

The presence of contaminating non-tumor tissues in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can greatly undermine genomic studies. Herein we ...

Os tecidos parafina-fixados ou FFPE são frequentemente misturas de materiais tumorais e não tumorais, onde a presença de material não tumorado é frequentemente indesejada e pode, se presente em alta proporção, impactar significativamente os resultados da análise genômica, assim, a principal vantagem da macrodiscção em relação ao trabalho com tecidos não ressecados é que as seções de tecido ressecados desparafinadas resultantes podem ser coletadas para o RNA e extração de DNA, que pode então ser usado com confiança na análise genômica a jusante. Sabendo que os materiais extraídos são derivados de tecidos com maior teor tumoral com contribuições mínimas da contaminação de tecidos não tumorais. O fluxo de trabalho em várias etapas deste processo será demonstrado pelo Sr. Lee Wisner, Dr. Brandon Larsen, e eu em preparação para a seção de tecidos, pré-enlouqueça os blocos de parafina em água gelada por 10 a 15 minutos.O resfriamento dos blocos endurece a cera enquanto a água umedece o tecido, o que, juntos, facilita o corte do tecido. Enquanto os blocos estiverem no gelo, rotule os slides do microscópio adequadamente. Encha e aqueça o banho de água a 39 graus Celsius e coloque o microtome na espessura de corte desejada.Carregue cuidadosamente a lâmina no microtome. Coloque a lâmina no lugar e coloque o protetor de segurança até que esteja pronto para começar a seccionar os blocos. Enquanto o guarda de segurança estiver no local, insira o bloco FFPE no mandril de microtome.Para começar, sele lentamente o bloco até que uma seção facial completa seja obtida. Isso é conhecido como de frente para o bloco. Uma vez que isso é alcançado, o bloco pode estar em seção mais rápido para obter uma fita de seções.Uma vez cortado, transfira a fita das seções de tecido para o banho de água morna. Use fórceps para separar uma única seção de tecido da fita. Para isso, coloque a parte de trás das fórceps curvas fechadas na articulação entre as duas seções e deixe que os fórceps abram suavemente para separar as seções.Colete a seção de tecido isolado em uma lâmina de microscópio. Para evitar bolhas de aprisionamento, insira o deslizamento do microscópio na água em um ângulo. Agite suavemente o slide para remover o excesso de água antes de colocar no rack para secar o ar.Uma vez seco, selecione pelo menos uma das seções de tecido recém-cortadas para hematoxilina e eosina, também conhecida como H e E.Once manchada, envie o slide H e E para revisão patológica. Durante a revisão patológica, um patologista especialista revisa as lâminas de manchas H e E para determinar onde está o tecido de interesse em cada tecido. O patologista primeiro revisa todo o tecido para determinar onde os tecidos de interesse residem dentro do tecido.Uma vez que a histologia inicial e a revisão morfológica esteja completa, o patologista usa uma caneta de marcação de slides para anotar cada slide manchado de H e E. Usando o marcador, o patologista desenha um círculo em torno do tecido de interesse, excluindo o tecido que não é de interesse. Este processo de revisão é então repetido para todos os slides manchados de H e E no projeto.Configure o espaço de trabalho de bancada de dissecção macro que permite que cada amostra seja tratada sequencial e eficientemente. Para cada amostra, devem estar as seções de tecido montados em lâminas não manchadas correspondentes, bem como os micro tubos pré-rotulados contendo o tampão de digestão para coleta de tecidos. Carregue os slides não manchados em um rack e prossiga para o capô da fumaça para desparafinação.Desparafinar os slides imergindo os slides em duas lavagens sequenciais de D-limonene ou CitriSolv não diluídos seguidos de uma lavagem final em 100% de etanol por dois minutos por lavagem. No início de cada lavagem, agitar suavemente a lavagem por cerca de cinco a 10 segundos. Para minimizar a carryover entre as lavagens, deixe que os slides escorra brevemente e desaja o rack na toalha de papel.Depois das três lavagens, os tecidos agora são altamente visíveis nos slides do microscópio. Deixe os slides secarem por 10 minutos. Uma vez seco, o H e O são então colocados de bruços no banco e o tecido desparafinado colocado em cima, também de frente para baixo, alinhando o tecido desparafinado com o H e E.Uma vez corretamente alinhado, a área tumoral marcada pelo patologista no H e E é rastreada na parte de trás da lâmina da seção de tecido desparafinado.Os slides agora marcados não manchados são mergulhados em uma solução de 3% de glicerol para minimizar a coleta estática e auxiliar os tecidos. Remova lentamente os slides mergulhados para minimizar a quantidade de solução de glicerol que se apega ao slide mergulhado. Uma vez removido, limpe a parte de trás do slide e quaisquer áreas livres de tecido na parte frontal do slide para remover o excesso de glicerol.Em seguida, usando uma lâmina limpa, rastreie as marcas patológicas com a lâmina para quebrar a conexão entre o tecido de interesse e o resto do tecido. Observando que esse passo pode ser feito antes do mergulho do glicerol, particularmente se as marcas patológicas são complexas, pois cortar tecido seco pode ser mais fácil e também pode minimizar o risco de arrasto tecidual. O tecido fora das marcas patológicas não são de interesse.Estes são removidos usando a borda plana da lâmina, certificando-se de que o canto da lâmina prende a parte externa das marcas patológicas. Uma vez que o tecido indesejado é removido, uma nova lâmina é usada para coletar o tecido de interesse. O tecido coletado é então removido da lâmina usando a extremidade plana de uma vara de madeira e, em seguida, transferido para um micro tubo pré-rotulado com tampão de digestão, completando assim o enriquecimento mediado do tecido tumoral mediado por macro dissecção, que agora está pronto para extração de ácido nucleico.Para demonstrar como a macrodiscção pode afetar a análise genômica a jusante, seções teciduais de cinco linfomas difusos de células B grandes, ou DLBCL, com diferentes conteúdos tumorais foram dissecadas macroditos ou não dissecadas macro. Extrações de ácido nucleico foram realizadas nos tecidos coletados e o RNA resultante examinado utilizando o ensaio de perfil de expressão genética digital DLBCL90, que também é conhecido como o ensaio de assinatura de duplo hit. O DLBCL é composto por três subtipos moleculares distintos, ou seja, GCB, ABC, e seu subtipo intermediário denotado não classificado, que pode ser determinado usando o ensaio DLBCL90.Este ensaio também é capaz de identificar tumores DLBCL que abrigam translocações de duplo impacto envolvendo o gene BCL2. Os resultados do DLBCL 90 são mostrados nesta tabela. Amostras dissecadas macro foram executadas duas vezes.Uma vez usando sua concentração de estoque de RNA e uma vez usando o estoque de RNA diluído para corresponder à concentração de suas respectivas contrapartes não-macro-dissecadas. Os resultados mostram que a dissecação macro resultou em alterações de chamada de subtipo ou duplo em três das cinco amostras. A macrodiscção da amostra A não teve efeito na chamada do subtipo, mas alterou a chamada de duplo hit de negativa para não classificada, e essa alteração foi observada independentemente da entrada de RNA amostral dissecada macro.Em contraste, a macrodiscção da amostra C não teve efeito na chamada de duplo hit, mas alterou a chamada do subtipo de GCB para não classificada, o que também foi observado independentemente da entrada de RNA amostral dissecada macro. Semelhante à amostra A, a macro-dissecção da amostra E não teve efeito na chamada do subtipo, mas alterou a chamada de duplo hit. No entanto, para a amostra E, a chamada mudou de não classificada para negativa, e novamente, o fez independentemente da entrada de RNA amostral dissecada macro.Notavelmente, esta chamada alterada para duplo impacto negativo faz sentido biológico, dado que a amostra E foi encontrada como ABC e translocações de duplo impacto envolvendo BCL2 foram relatadas como sendo observadas exclusivamente em tumores GCB. Juntos, esses resultados destacam a importância da pureza tumoral e dos ensaios genômicos e da macrodiscção como uma ferramenta confiável para isso. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma melhor compreensão do que é macrodiscção, a importância da revisão patológica e os benefícios do estudo obtidos pela inclusão da macro dissecção no seu fluxo de trabalho de manuseio de tecidos.

enhancing-tumor-content-through-tumor-macrodissection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O vídeo descreve a dissecção a laser do modelo de cocultura organotípica 3D com precisão em nível de mícron. Em modelos organotípicos 3D, constituintes estromais, como fibroblastos, são co-cultivados tridimensionalmente com células epiteliais cancerígenas. O modelo 3D serve como uma ferramenta experimental que permite que as interações entre invasão e estroma de câncer sejam estudadas em condições quase fisiológicas.

Microdissecção a laser: uma técnica para isolar células invasoras de câncer colorretal a partir de um modelo de cultura organotípica 3D

Este vídeo descreve um método para a macrodissecção manual de tecido canceroso a partir de amostras de tecido não coradas para obter um tecido cancerígeno específico. A seção de tecido pode ser processada posteriormente para obter DNA para estudos de todo o genoma sobre cânceres gastrointestinais.

Macrodissecção de tecido tumoral FFPE: uma técnica para obter tecido tumoral específico de amostras não coradas

Este vídeo ilustra o teste de terapia adjuvante ou adicional em um modelo de camundongo com tumores subcutâneos ressecados de forma incompleta. O camundongo parcialmente ressecado pelo tumor é tratado com um anticorpo direcionado à proteína anticitotóxica das células T reguladoras, reduzindo potencialmente o crescimento do tumor e sugerindo terapia adjuvante eficaz.

Uma terapia adjuvante em um modelo de camundongo com um tumor subcutâneo ressecado incompletamente

Perfil molecular de células de laser e microdissecados do estroma, modelos de cancro colorectal sintéticos engenharia de tecidos representa uma abordagem nova e manipulável para caracterizar e dissecar a biologia distinta na interface entre as células tumorais na frente invasiva e células estromais de cancro associado.

Profiling Molecular do microambiente do tumor invasivo em um modelo 3-Dimensional de células de câncer colorretal e<em&gt; Ex vivo</em&gt; Os fibroblastos

Este protocolo descreve o uso de microscopia multifotônica para executar imagiologia prolongado de lapso de tempo de interacções multicelulares em tempo real, in vivo, a resolução de células simples.

Estendida Time-lapse Imagem intravital do Real-time multicelular Dynamics no microambiente tumoral

Aqui nós descrevemos um método para separar e enriquecer os componentes do microambiente de imune e não imune a tumor em tumores subcutâneos estabelecidas. Esta técnica permite a análise separada de infiltrar imune tumor e frações não imune tumor que podem permitir a caracterização abrangente do microambiente imune do tumor.

Enriquecimento e caracterização do microambiente que imune e não imune Tumor em tumores murino subcutâneos estabelecidas

A microdissecção a laser (LMD) é uma técnica sensível e altamente reprodutível que pode ser usada para descobrir caminhos que mediam a heterogeneidade e invasão do glioma. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para isolar áreas discretas do tecido glioma usando LMD a laser seguido de análise transcritiva.

Microdissecção de Captura a Laser de Sub-regiões de Glioma para Caracterização Espacial e Molecular da Heterogeneidade Intratumoral, Oncostreams e Invasão

A anotação digital com dissecção automatizada de tecidos fornece uma abordagem inovadora para enriquecer tumores em casos de baixo teor de tumor e é adaptável tanto parafina quanto para tipos de tecido congelado. O fluxo de trabalho descrito melhora a precisão, a reprodutibilidade e o throughput e pode ser aplicado tanto em pesquisas quanto em configurações clínicas.

Protocolo automatizado de dissecção para enriquecimento de tumores em tecidos de baixo teor de tumores

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de alto rendimento para segmentação de regiões de interesse confirmadas pela patologia de imagens de seção de tecidos manchados e finos para enriquecimento de populações celulares resolvidas por histologia usando microdisseção a laser. Esta estratégia inclui um novo algoritmo que permite a transferência de demarcações denotando populações celulares de interesse diretamente para microscópios a laser.

Microdisseção laser industrializada e guiada por inteligência artificial para análise proteômica microescalada do Microambiente tumoral

Um novo método para escaneamento 3D e mapeamento virtual de ressecções de câncer é proposto com o objetivo de melhorar a comunicação entre a equipe multidisciplinar de cuidados oncológicos.

Comunicação aprimorada de margens tumorais usando varredura e mapeamento 3D

Aprenda a técnica de macrodisseção para enriquecer o conteúdo tumoral em amostras de tecido FFPE. Este método melhora a precisão das análises genômicas ao isolar material tumoral de tecidos não tumorais.

Melhorando o conteúdo do tumor através da macrodisseção do tumor

Explorar mais vídeos