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Summary

Este protocolo é dedicado à visualização plus-end do microtúbulo pela transfecção de proteínaS EB3 para estudar suas propriedades dinâmicas na cultura celular primária. O protocolo foi implementado em fibroblastos de pele primários humanos obtidos de pacientes com a doença de Huntington.

Abstract

Transfecção com uma proteína marcadora fluorescente de interesse em combinação com microscopia de vídeo de lapso de tempo é um método clássico de estudar as propriedades dinâmicas do citoesqueleto. Este protocolo oferece uma técnica para transfecção do fibroblasto primário humano, que pode ser difícil devido às especificidades das condições primárias de cultivo celular. Além disso, a manutenção da propriedade dinâmica do citoesqueleto requer um baixo nível de transfecção para obter uma boa relação sinal-ruído sem causar estabilização de microtúbulos. É importante tomar medidas para proteger as células contra o estresse induzido pela luz e o desbotamento do corante fluorescente. No decorrer do nosso trabalho, testamos diferentes métodos e protocolos de transfecção, bem como diferentes vetores para selecionar a melhor combinação de condições adequadas para estudos de fibroblasto primário humano. Analisamos os vídeos resultantes do lapso de tempo e a dinâmica calculada de microtúbulos usando ImageJ. A dinâmica dos plus-ends dos microtúbulos nas diferentes partes celulares não são semelhantes, por isso dividimos a análise em subgrupos – a região centro-grande, a lamella e a cauda dos fibroblastos. Notavelmente, este protocolo pode ser usado para análise in vitro da dinâmica do citoesqueleto em amostras de pacientes, permitindo o próximo passo para entender a dinâmica do desenvolvimento de várias doenças.

Introduction

A doença de Huntington (HD) é uma patologia neurodegenerativa incurável causada por uma proteína de codificação genética de codificação de genes (HTT). O HTT está associado principalmente a vesículas e microtúbulos e provavelmente está envolvido em processos de transporte dependentes de microtúbulos^1,2. Para estudar a influência do HTT mutante na dinâmica dos microtúbulos, utilizamos a visualização in vitro da proteína EB3, que regula as propriedades dinâmicas dos microtúbulos, vinculando e estabilizando o crescimento de plus-ends. Para carregar eb3 fluorescentemente rotulado em fibroblastos de pele humana, foi aplicada transfecção plasmida. Utilizou-se a cultura do fibroblasto primário obtida a partir da biópsia da pele dos pacientes HD para este estudo.

A mutação no gene da proteína HTT leva ao alongamento do trato de poliglutamina³. O HTT tem um papel em processos celulares como a endocitose^4,transporte celular^1,2,degradação proteica^5,etc. Parte substancial desses processos envolve vários elementos do citoesqueleto celular, incluindo os microtúbulos.

As células primárias humanas são o melhor modelo para reproduzir eventos que ocorrem em células do paciente o mais próximo possível. Para criar tais modelos, é preciso isolar as células do material de biópsia humana (por exemplo, a partir de amostras cirúrgicas). A linha celular primária resultante é adequada para estudar a patogênese usando vários métodos genéticos, bioquímicos, moleculares e de biologia celular. Além disso, as culturas celulares primárias humanas servem como precursora da criação de várias culturas transdiferenciadas e transgênicas⁶.

No entanto, em contraste com as culturas celulares imortalizadas, a desvantagem significativa das células primárias é sua capacidade limitada de passagem. Por isso, recomendamos o uso de células na fase de passagens iniciais (até 15). Culturas mais antigas degeneram muito rapidamente, perdendo suas propriedades únicas. Assim, as células primárias recém-obtidas devem ser mantidas congeladas para armazenamento a longo prazo.

As culturas celulares primárias são suscetíveis às condições de cultivo. Portanto, muitas vezes requerem abordagens únicas e otimização de condições de crescimento. Em particular, os fibroblastos primários da pele humana usados em nossos experimentos são exigentes no substrato. Assim, utilizamos vários revestimentos adicionais (por exemplo, gelatina ou fibronectina) dependendo do tipo de experimento.

O citoesqueleto celular determina a forma da célula, mobilidade e locomoção. A dinâmica do citoesqueleto é crucial para muitos processos intracelulares tanto na interfase quanto na mitose. Em particular, o citoesqueleto polimerizado a partir de tubulina, são estruturas altamente dinâmicas e polares, permitindo o transporte intracelular direcionado mediado por proteína motora. As extremidades dos microtúbulos estão em constante rearranjo, suas fases de montagem se alternam com as fases de desmontagem, e esse comportamento é chamado de “instabilidade dinâmica”^7,8,9. Várias proteínas associadas mudam o equilíbrio da reação de polimerização, levando à formação do polímero ou à formação de monômeros proteicos. A adição de subunidades de tubulina ocorre principalmente na extremidade mais alta dos microtúbulos¹⁰. A família de proteínas end-binding (EB) é composta por três membros: EB1, EB2 e EB3. Eles servem como proteínas de rastreamento plus-end (+TIPs) e regulam as propriedades dinâmicas dos microtúbulos, vinculando e estabilizando seus plus-ends^{crescentes 11}.

Muitos estudos usam microinjeção ou transfecção de tubulina com imagem de lapso de tempo e análise de vídeo para visualizar microtúbulos in vitro. Esses métodos podem ser invasivos e prejudiciais às células, especialmente as células humanas primárias. O passo mais desafiador é encontrar condições para transfecção celular. Tentamos alcançar o mais alto nível possível de transfecção sem afetar a viabilidade e a morfologia celular nativa. Este estudo aplica o método clássico para estudar as diferenças na dinâmica dos microtúbulos nos fibroblastos de pele de doadores saudáveis e pacientes com a doença de Huntington.

Protocol

Este protocolo segue as diretrizes do Centro Federal de Pesquisa e Clínica de Medicina Físico-Química da Agência Federal de Biologia Médica datada de 08 de setembro de 2015.

NOTA: A Figura 1 dá uma visão geral do protocolo.

1. Obtenção de uma cultura primária de fibroblastos de pele humana (Figura2)

1. Entregue a biópsia em um laboratório dentro de algumas horas no meio DMEM (Modified Eagle Media, mídia de águia modificada) de Dulbecco, complementado com 50 μg/mL de penicilina e 50 U/mL de estreptomicina.
   NOTA: Uma biópsia de pele deve ser realizada em condições estéreis por um médico após um paciente assinar um consentimento informado.
2. Coloque o tecido da biópsia em uma placa de Petri de 6 cm juntamente com uma pequena quantidade do meio.
3. Usando um bisturi estéril, corte a amostra de biópsia em pedaços de cerca de 0,5-1 mm de tamanho. Coloque fragmentos obtidos 1-2 em uma placa de Petri de 3,5 cm e coloque um deslizamento estéril sobre as peças de biópsia. Adicione lentamente 1,5 mL de um meio de crescimento à seguinte composição: DMEM, penicilina-estreptomicina u/mL e 10% de soro bovino fetal (FBS).
4. Os fibroblastos culturais no meio de crescimento dentro de uma incubadora de CO₂ mantiveram-se em 5% de CO₂, 37 °C, 80% de umidade.
   NOTA: Após 4-7 dias, primeiro os queratinócitos, depois os fibroblastos, começam a migrar do tecido para o fundo do prato.

2. Armazenamento, congelamento e descongelamento da cultura primária

1. Remova as células do prato de cultura (ver pontos 3.2-3.4).
2. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL e centrífuga por 5 min a 200 x g. Em seguida, descarte o supernatante e resuspenque a pelota celular em 900 μL de FBS resfriado.
3. Transfira para um tubo de criopreservação gota a gota e adicione 100 μL de sulfóxido de dimetila (DMSO).
4. Coloque a crioprobe em um congelador de baixa temperatura a -80 °C. Vinte e quatro horas depois, transfira o criovial para o nitrogênio líquido (−196 °C) para armazenamento a longo prazo.
5. Para descongelar as células criopreservadas, remova o criovial do armazenamento de nitrogênio e, dentro de 1 min, transfira 1 mL do conteúdo para um tubo cônico de 15 mL contendo 9 mL do meio de transporte pré-aquecido a 37 °C.
6. Resuspengue cuidadosamente e, em seguida, centrifugar o tubo por 5 min a 200 x g. Descarte o supernasce, resuspenque a pelota celular no volume necessário do meio de crescimento e coloque-os em uma placa de Petri do diâmetro necessário.

3. Cultivo de células

1. Cubra o fundo do prato com solução de gelatina autoclaved de 0,1% preparada em água destilada. Incubar por 15 min.
   NOTA: Para visualização de transfecção, devem ser utilizados pratos de placas de fundo de vidro (pratos confocal com espessura de vidro de 170 μm).
2. Prepare um meio de cultura com a seguinte composição: DMEM complementado com 10% de FBS, 2 mM L-alanyl-L-glutamina, 50 U/mL penicilina-estreptomicina. Misture bem e armazene a 4 °C. Aqueça o médio a 37 °C antes de adicionar às células.
3. Avalie a cultura sob o microscópio. Remova o meio e lave os fibroblastos com a solução de sal fosfato de Dulbecco (DPBS).
4. Adicione 1 mL de solução pré-aquecida de 0,25% de trippsina às células. Verifique as células sob o microscópio se elas se desprendem completamente do substrato. Desativar trippsina com 1 mL do meio de cultura.
5. Transfira a suspensão da célula para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar o tubo a 200 x g por 5 min, remover o supernascedor e resuspensar a pelota celular em 1 mL do meio de cultura.
6. Conte o número de células. Calcule o número necessário de células para semeá-las com uma densidade de 8-15 x 10³/cm² e resuspense em 2 mL do meio de cultura.
7. Remova a solução de gelatina do prato de cultura e adicione imediatamente 2 mL da suspensão celular. Cultivar fibroblastos a 37 °C em uma incubadora de CO_2.
8. Refrescar o meio a cada 2-4 dias.
   NOTA: Para experimentos, use as células de passagens de 4-11.

4. Transfecção

1. Substitua o meio de cultura por um meio de cultura fresco 24 horas antes da transfecção.
   NOTA: A confluência celular deve ser de 70 a 80%.
2. Prepare um complexo de DNA-lipíde, baseado na área e densidade da semeadura celular. Use agente de transfecção à base de liposome.
   NOTA: Use a densidade de semeadura celular como 1 x 10⁴ células/cm².
3. Adicione 3 μL de reagente de transfecção comercial a 125 μL de meio essencial mínimo ideal (Opti-MEM) não contendo antibióticos, sem tocar nas paredes do tubo. Levemente resuspend.
4. Diluir o DNA plasmídeo (GFP-EB3) adicionando 1 μg do DNA plasmídeo a 125 μL de Opti-MEM. Levemente resuspend.
   NOTA: A codificação vetorial de expressão GFP-EB3¹¹ foi recebida como um presente gentil do Dr. I. Kaverina (Universidade Vanderbilt, Nashville) com permissão do Dr. A. Akhmanova (Erasmus University, Roterdã)¹¹.
5. Adicione DNA plasmídeo diluído a cada tubo de reagente de transfecção diluído (1:1). Incubar por 30 min.
6. Adicione o complexo DNA-lipídico à placa de Petri de 6 cm contendo células e misture com um balanço cruciforme para 30 s. Incubar células com um agente de transfecção por 24 h e, em seguida, mudar para meio fresco. Analise a eficiência da transfecção após 24h e 48h.
   NOTA: 24h após a transfecção, a eficiência foi de 10-15%, e depois de 48h até 40%.

5. Preparação para a imagem

1. Antes da imagem viva das células, mude o meio de cultura para um meio sem corante indicador de pH para reduzir a autofluorescência.
2. Aplique cuidadosamente o óleo mineral na superfície média para cobrir completamente o meio, isolando-o do ambiente externo para reduzir a penetração de O₂ e a evaporação média.
3. Use uma lâmpada de mercúrio e uma lente objetiva de imersão de óleo 60x ou 100x com uma alta abertura numélica para tirar as imagens.
   NOTA: Para observações in vivo, o microscópio deve ser equipado com uma incubadora para manter as condições necessárias para as células, incluindo o aquecimento da mesa do objeto e a lente para +37 °C, uma câmara fechada com fornecimento de CO₂ e suporte ao nível de umidade. Use água dupla destilada para criar umidade. Verifique o nível de água dupla destilada antes de filmar.
4. Coloque a antena confocal com as células no suporte do microscópio antes da imagem. Certifique-se de que o prato e a câmera estão bem ligados ao suporte para evitar a deriva enquanto tira imagens.

6. Definindo os parâmetros de imagem

1. Escolha os baixos valores de exposição, uma vez que a luz induz espécies reativas de oxigênio reativa (ROS) prejudiciais às células.
   NOTA: Para estudar a dinâmica dos microtúbulos nos fibroblastos da pele humana, foi selecionada uma exposição de 300 ms.
2. Concentre-se no objeto de interesse.
   NOTA: Para imagens de lapso de tempo de longo prazo, use o sistema automático de estabilização do foco para compensar uma possível mudança ao longo do eixo z.
3. Escolha as condições de imagem ideais dependendo da fotosensibilidade das células e da taxa de desbotamento fluorocromático.
   NOTA: Uma vez que os microtúbulos são estruturas altamente dinâmicas, um intervalo de tempo razoavelmente curto pode ser selecionado, e a taxa de quadros deve ser suficientemente alta. Para investigar a dinâmica dos microtúbulos nos fibroblastos de pele, utilizamos em uma frequência de 1 quadro/s por 3-5 min.
4. Ao selecionar o próximo objeto para obter a imagem, afaste-se da área já visualizada. Uma vez que esta área estava sob a influência da luz, haverá um notável branqueamento fotográfico.
   NOTA: Como uma frequência de imagem relativamente alta foi usada, o obturador não se fechou entre as imagens, e a lâmpada foi acesa durante todo o período de imagem, razão pela qual o desbotamento aumentou.
5. Escolha o vídeo ideal para estudar a dinâmica dos microtúbulos visualmente, levando em conta a qualidade da transfecção, a qualidade das imagens dos microtúbulos (ótima relação sinal-ruído) e a ausência de deriva no caso da célula analisada(Figura 3).
6. Use os vídeos selecionados para estudar a dinâmica de plus-ends dos microtúbulos, traçando-os no programa ImageJ ou Fiji(Figura 4).
   NOTA: Para instruções de análise quantitativa consulte Figura Suplementar 2 e Arquivo Suplementar 1.

Representative Results

Discussion

Melhores resultados de qualidade para a análise dinâmica dos microtúbulos podem ser obtidos a partir de imagens microscópicas de alta qualidade. É importante observar todas as condições necessárias para a imagem de lapso de tempo das células vivas e ajustar corretamente os parâmetros de imagem. Usar pratos especiais de cultura celular com fundo de vidro (pratos confocal) é importante, já que o vidro tem um índice de luz refrativo diferente do plástico. A espessura do vidro e sua uniformidade sobre toda a sua área também é extremamente importante, uma vez que esses parâmetros são cruciais para o foco normal da amostra. A violação desses parâmetros inevitavelmente leva a uma falha do sistema de foco perfeito, resultando em um mau foco, tornando impossível o uso desse vídeo fora de foco para análise(Figura 5A). Outra condição importante para a imagem de células vivas é a proteção do ROS. Vários reagentes podem ser usados para tais fins²⁰. Em nosso trabalho, usamos óleo mineral, que isola completamente o meio cultural da atmosfera e impede a troca de gás. Da mesma forma, a oximoras redutora de ROS pode ser usada, mas esta enzima não é adequada para todos os tipos de células e é mais frequentemente aplicável à imagem com tempo aumentado.

Ao escolher o tempo ideal de incubação das células após a transfecção (24 ou 48 h), deve-se dar atenção ao número de células transfeccionadas. Um número menor do que o número máximo de células expressando a proteína rotulada já é suficiente para a análise. A superexpressão não deve ser permitida porque os microtúbulos, nesses casos, estão estabilizados e suas propriedades dinâmicas não podem ser analisadas(Figura 5B).

Em alguns casos, pode ser necessário ajustar os parâmetros de imagem de acordo com a reação das células após o início da gravação de vídeo. Por exemplo, é possível observar o encolhimento da lamella celular devido à alta sensibilidade à luz (fototoxicidade) (Figura 5C). Quando excitadas, as moléculas fluorescentes normalmente reagem com oxigênio molecular para formar radicais livres que podem danificar os componentes celulares²¹. Ao projetar experimentos, os fluoroforos com o comprimento de onda máximo possível devem ser selecionados para minimizar os danos celulares sob a iluminação de ondas curtas. Além disso, há relatos de que certos componentes da mídia de cultura padrão, incluindo a vitamina riboflavina e o aminoácido triptofano, também podem contribuir para os efeitos adversos da luz sobre células cultivadas²². Entre outras coisas, isso pode ser causado por uma quantidade excessiva de rótulos fluorescentes em uma célula. Nesses casos, torna-se necessário reduzir a duração do registro e a intensidade da iluminação. Outro problema possível também pode ser a fotobleaching rápida – diminuição da intensidade do sinal durante a gravação(Figura 5D). Esse efeito deve ser levado em conta ao selecionar o próximo objeto na mesma antena experimental, uma vez que as células vizinhas ao redor da área imagem também são queimadas.

Deve-se mencionar que existem outros métodos para visualização de microtúbulos em células vivas, como microinjeção de tubulina com rótulo fluorescente na transdução celular ou celular usando vírus. Como em qualquer outro método, há vantagens e desvantagens para o método de transfecção. No entanto, do nosso ponto de vista, em comparação com o método de injeção, a transfecção é mais eficaz e permite alcançar a inclusão em massa de vetores de expressão nas células, resultando em um grande número de células fluorescentes para análise. Além disso, o método de transfecção não requer equipamentos e habilidades especiais do pesquisador. O método de transdução viral apresenta bons resultados e pode ser aplicado. Ainda assim, não é adequado para todas as culturas celulares (em particular, é menos adequado para fibroblastos humanos, obtidos a partir da biópsia da pele dos pacientes hd).

O passo mais crítico neste protocolo é a transfecção realizada para garantir expressão proteica suficiente. Uma boa relação sinal-ruído, sem fotobleaching de microtúbulos, e a ausência de drifting celular durante a gravação de vídeo time-lapse são absolutamente críticos para imagens eficazes de microtúbulos. Em nossoexperimento, a visualização de microtúbulos e a análise dinâmica fornecem informações vitais sobre propriedades microtúbulas e comportamento nas células com HTT mutante. Nosso protocolo é aplicável para estudos de outras doenças para as quais a patologia implica propriedades dinâmicas de microtúbulos.

Materials

<strong>Instrumentation</strong>
Camera iXon DU897 EMCCD	Andor Technology
Eppendorf Centrifuge 5804 R	Eppendorf Corporate
Fluorescence filter set HYQ FITC	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
LUNA-II Automated Cell Counte	Logos Biosystems	L40002
Microscope incubator for lifetime filming	Okolab	Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS
		Gas controller CO2-O2-UNIT-BL
Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
<strong>Software</strong>
Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c)	Open source image processing software
NIS Elements	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
<strong>Additional reagents</strong>
Mineral oil (Light white oil)	MP	151694
<strong>Cell culture dish</strong>
Cell Culture Dish	SPL Lifesciences	20035
Confocal Dish (glass thickness 170 &micro;m)	SPL Lifesciences	211350	Alternative: MatTek
Conical Centrifuge tube	SPL Lifesciences	50015
Cryogenic Vials	Corning-Costar	430659
Microcentrifuge Tube	Nest	615001
<strong>Cultivation</strong>
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Dimethyl sulfoxide	PanEko	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg"/>135
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media)	PanEko	C420<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg"/>
DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution)	PanEko	P060<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg"/>
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	K053/SH30071.03
Gelatin (bovine skin)	PanEko	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg"/>070
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050038
Opti-MEM (1x) + Glutamax	Gibco	519850026
Penicillin-streptomycin	PanEko	A063<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg"/>
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher Scientific	25200072
<strong>Transfection</strong>
Plasmid DNA with EB3-GFP	Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova<br/> [Erasmus University, Rotterdam]	Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003