Este protocolo é dedicado à visualização plus-end do microtúbulo pela transfecção de proteínaS EB3 para estudar suas propriedades dinâmicas na cultura celular primária. O protocolo foi implementado em fibroblastos de pele primários humanos obtidos de pacientes com a doença de Huntington.
Artigo de método
Visualização da dinâmica plus-end de microtúbulo no modelo de doença de Huntington baseado em fibroblastos de pele primárias humanas
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Transfecção com uma proteína marcadora fluorescente de interesse em combinação com microscopia de vídeo de lapso de tempo é um método clássico de estudar as propriedades dinâmicas do citoesqueleto. Este protocolo oferece uma técnica para transfecção do fibroblasto primário humano, que pode ser difícil devido às especificidades das condições primárias de cultivo celular. Além disso, a manutenção da propriedade dinâmica do citoesqueleto requer um baixo nível de transfecção para obter uma boa relação sinal-ruído sem causar estabilização de microtúbulos. É importante tomar medidas para proteger as células contra o estresse induzido pela luz e o desbotamento do corante fluorescente. No decorrer do nosso trabalho, testamos diferentes métodos e protocolos de transfecção, bem como diferentes vetores para selecionar a melhor combinação de condições adequadas para estudos de fibroblasto primário humano. Analisamos os vídeos resultantes do lapso de tempo e a dinâmica calculada de microtúbulos usando ImageJ. A dinâmica dos plus-ends dos microtúbulos nas diferentes partes celulares não são semelhantes, por isso dividimos a análise em subgrupos - a região centro-grande, a lamella e a cauda dos fibroblastos. Notavelmente, este protocolo pode ser usado para análise in vitro da dinâmica do citoesqueleto em amostras de pacientes, permitindo o próximo passo para entender a dinâmica do desenvolvimento de várias doenças.
Introdução
A doença de Huntington (HD) é uma patologia neurodegenerativa incurável causada por uma proteína de codificação genética de codificação de genes (HTT). O HTT está associado principalmente a vesículas e microtúbulos e provavelmente está envolvido em processos de transporte dependentes de microtúbulos1,2. Para estudar a influência do HTT mutante na dinâmica dos microtúbulos, utilizamos a visualização in vitro da proteína EB3, que regula as propriedades dinâmicas dos microtúbulos, vinculando e estabilizando o crescimento de plus-ends. Para carregar eb3 fluorescentemente rotulado em fibroblastos de pele h....
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Protocolo
Este protocolo segue as diretrizes do Centro Federal de Pesquisa e Clínica de Medicina Físico-Química da Agência Federal de Biologia Médica datada de 08 de setembro de 2015.
NOTA: A Figura 1 dá uma visão geral do protocolo.
1. Obtenção de uma cultura primária de fibroblastos de pele humana (Figura2)
- Entregue a biópsia em um laboratório dentro de algumas horas no meio DMEM (Modified Eagle Media, mídia de águia modificada) de Dulbecco, complementado com 50 μg/mL de penicilina e 50 U/mL de estreptomicina.
NOTA:....
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Resultados
Os filmes GFP-EB3 resultantes produzidos usando o protocolo (Figura 1) ilustram as propriedades dinâmicas dos microtúbulos. Os microtúbulos estão envolvidos em diferentes processos celulares, e suas propriedades dinâmicas impactam várias características de vida da cultura celular humana primária a partir do material de biópsia dos pacientes(Figura 2).
Os seguintes parâmetros determinam a instabilidade dinâmica dos microtúbulos: as tax.......
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Discussão
Melhores resultados de qualidade para a análise dinâmica dos microtúbulos podem ser obtidos a partir de imagens microscópicas de alta qualidade. É importante observar todas as condições necessárias para a imagem de lapso de tempo das células vivas e ajustar corretamente os parâmetros de imagem. Usar pratos especiais de cultura celular com fundo de vidro (pratos confocal) é importante, já que o vidro tem um índice de luz refrativo diferente do plástico. A espessura do vidro e sua uniformidade sobre toda a sua área também .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi financiada pelo Ministério da Ciência e Educação Superior da Federação Russa, concedendo o nº 075-15-2019-1669 (transfecção de fibroblastos), pela Fundação Russa de Ciência, conceder nº 19-15-00425 (todos os outros trabalhos sobre o cultivo de fibroblastos in vitro). Foi parcialmente apoiado pelo programa de desenvolvimento da Universidade Estadual de Moscou, PNR5.13 (imagem e análise). Os autores reconhecem o apoio do Centro de Excelência Nikon do Instituto A. N. Belozersky de Biologia Físico-Química. Queremos oferecer nossos agradecimentos especiais a Ekaterina Taran por sua ajuda com a dublagem. Os autores também agradecem a Pavel Belikov....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Instrumentation | |||
| Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
| Conjunto de filtros de fluorescência HYQ FITC | Nikon | Alternativa: Leica, Olympus, Zeiss | |
| LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
| Incubadora de microscópio para filmagens vitalícias | Okolab | H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| Controlador de gás CO2-O2-UNIT-BL | |||
| Lente objetiva CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Alternativa Nikon | : Leica, Olympus, Zeiss | |
| Microscópio de luz de fluorescência de campo amplo Eclipse Ti-E | Alternativa Nikon | : Leica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (Image J versão 2.1.0/1.53c) | Software | ||
| NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Reagentes adicionais | |||
| Óleo mineral (óleo branco claro) | MP | 151694 | |
| Placa de cultura de células | |||
| Placa de cultura de células | SPL Lifesciences | 20035 | |
| Placa Confocal (espessura do vidro 170 µ m) | SPL Lifesciences | 211350 | Alternativa: Tubo |
| centrífuga cônica | SPL Lifesciences | 50015 | |
| Tubo de microcentrífuga | |||
| Cultivation | |||
| Thermo Fisher Scientific | L3000001 | ||
| Dimetilsulfóxido | PanEko |  135 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | PanEko | C420 | |
| DPBS (Dulbecco's solução de fosfato-sal) | PanEko | P060 | |
| Soro fetal bovino (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| Gelatina (pele bovina) | PanEko | 070 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| Penicilina-estreptomicina | PanEko | A063 | |
| Tripsina-EDTA (0,25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| Transfection | |||
| DNA de plasmídeo com EB3-GFP | Gentil presente do Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] com permissão do Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam] | Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
Referências
- Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
- Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L.
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