Culturas primárias de micróglias são comumente usadas para avaliar novas moléculas anti-inflamatórias. O presente protocolo descreve um método reprodutível e relevante para isolar magneticamente a micróglia de filhotes recém-nascidos.
Artigo de método
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Culturas primárias de micróglias são comumente usadas para avaliar novas moléculas anti-inflamatórias. O presente protocolo descreve um método reprodutível e relevante para isolar magneticamente a micróglia de filhotes recém-nascidos.
A micróglia, como macrófagos residentes no cérebro, são fundamentais para várias funções, incluindo a resposta ao estresse ambiental e a homeostase cerebral. A micróglia pode adotar um grande espectro de fenótipos de ativação. Além disso, a micróglia que endossa o fenótipo pró-inflamatório está associada a distúrbios neurodesenvolvimentais e neurodegenerativos. Estudos in vitro são amplamente utilizados em pesquisas para avaliar potenciais estratégias terapêuticas em tipos específicos de células. Neste contexto, estudar a ativação microglial e a neuroinflamação in vitro usando culturas microgliais primárias é mais relevante do que as linhagens celulares microgliais ou a microglia derivada de células-tronco. No entanto, o uso de algumas culturas primárias pode sofrer de falta de reprodutibilidade. Este protocolo propõe um método reprodutível e relevante de isolar magneticamente a micróglia de filhotes recém-nascidos. A ativação microglial utilizando vários estímulos após 4 h e 24 h por quantificação da expressão de mRNA e um ensaio fagocítico de esferas Cy3 é demonstrado aqui. Espera-se que o presente trabalho forneça uma técnica facilmente reprodutível para isolar micróglias fisiologicamente relevantes dos estágios de desenvolvimento juvenis.
Microglia são as células semelhantes a macrófagos residentes no sistema nervoso central derivadas de precursores eritropoiéticos do saco vitelino que migram para o neuroepitélio durante o desenvolvimento embrionário inicial1. Além de suas funções de imunidade, eles também desempenham um papel significativo durante o neurodesenvolvimento, particularmente para sinaptogênese, homeostase neuronal e mielinização2. Na idade adulta, a micróglia desenvolve longos processos celulares para escanear o ambiente continuamente. Em caso de rupturas de homeostase, como lesão cerebral ou doença cerebral, a micróglia pode alterar sua apar....
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O protocolo foi aprovado e todos os animais foram manuseados de acordo com as diretrizes institucionais do Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, França). O isolamento magnético da micróglia dos cérebros de 24 filhotes de camundongos OF1 (machos e fêmeas) em P8, divididos em placas de 6 poços, 12 ou 96 poços, são apresentados. O trabalho experimental foi realizado sob um capô para manter as condições estéreis.
1. Preparação de soluções estéreis para isolamento e cultura celular
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A micróglia é o macrófago residente do SNC que é ativado quando exposto a desafios ambientais (trauma, moléculas tóxicas, inflamação)4,5,6,34 (Figura 3A). Estudos in vitro sobre micróglia são comumente usados para avaliar mecanismos autônomos celulares relacionados a esses desafios ambientais e caracterizar o estado de ativação após manipulação farmacológi.......
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O presente trabalho apresenta uma cultura primária de células microgliais usando células CD11b+ classificadas magneticamente. Além da avaliação funcional microglial (RT-qPCR e ensaios fagocíticos), a pureza da cultura microglial também foi determinada.
Culturas clássicas de células de micróglias são comumente geradas a partir do cérebro de recém-nascidos de roedores P1 ou P2 e co-cultura com astrócitos por pelo menos 10 dias. As micróglias são então separadas mecanicamente usando um agitador o.......
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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
As figuras foram criadas usando BioRender. A investigação é financiada pela Inserm, Université de Paris, Horizonte 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, e uma subvenção adicional do Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS e Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anti rato ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti rato CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
| Anti rato CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
| Anti rato CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
| Anti rato NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
| anti kit de | |||
| Biosciences | 554655 | ||
| Albumina de soro bovino | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Microscópio confocal | Leica TCS SP8 | ||
| D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Falcon Placa de cultura de células de 12 poços, fundo plano + tampa | Dutscher | 353043 | |
| Falcon Placa de cultura de células de 96 poços, fundo plano + tampa | Dutscher | 353072 | |
| Tubos Falcon 50 mL | Dutscher | 352098 | |
| Reagente de bloqueio Fc (Mouse CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
| Microscópio de fluorescência | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
| gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubos) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator com Aquecedores | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Solução Salina Balanceada Hanks (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Solução | Thermo Scientific 14065049 | |
| Hanks (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
| Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
| Grânulos de látex, poliestireno modificado com amina, vermelho fluorescente | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
| Lipopolissacarídeos (LPS) de Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
| Macrophage-SFM meio sem soro | Thermo Scientific | 12065074 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μ m), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
| Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
| Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
| Multi-24 Blocos de Coluna | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
| MultiMACS Cell24 Separador | Miltenyi Kit de | ||
| - Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
| Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
| Nun EZFlip Top Tubos de Centrífuga Cônicos | Thermo Scientific | 362694 | |
| OPTILUX Placa de Petri - 100 x 20 mm | Dutscher | ||
| Pé estreptomicina de nicilina (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
| Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
| REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
| REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
| Proteína IFN-gama de camundongo recombinante | R& D System | 485-MI | |
| Proteína IL-10 de camundongo recombinante | R& D System | 417-ML | |
| Proteína IL-4 de camundongo recombinante | R& D System | 404-ML | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Sonda de viabilidade (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |
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