Preparação da Amostra e Quantitação Relativa usando Metilação Redutiva de Aminas para Estudos de Peptidômica

Summary

Este artigo descreve um método de preparação amostral baseado na inativação de calor para preservar peptídeos endógenos evitando a degradação pós-morte, seguido de quantitação relativa usando rotulagem isotópica mais LC-MS.

Abstract

A peptidomia pode ser definida como a análise qualitativa e quantitativa dos peptídeos em uma amostra biológica. Suas principais aplicações incluem identificar os biomarcadores de peptídeos de doença ou estresse ambiental, identificar neuropeptídeos, hormônios e peptídeos intracelulares bioativos, descobrir peptídeos antimicrobianos e nutracêuticos a partir de hidrólises proteicos, e pode ser usado em estudos para entender os processos proteolíticos. O recente avanço na preparação da amostra, métodos de separação, técnicas de espectrometria de massa e ferramentas computacionais relacionadas ao sequenciamento de proteínas contribuíram para o aumento do número de peptídeos identificados e peptidomes caracterizados. Estudos peptidômicos frequentemente analisam peptídeos que são gerados naturalmente nas células. Aqui, é descrito um protocolo de preparação de amostras baseado na inativação do calor, que elimina a atividade de protease, e extração com condições leves, portanto não há laços de peptídeos. Além disso, também é mostrada a quantitação relativa de peptídeos usando rotulagem estável de isótopos por metilação redutiva de aminas. Este método de rotulagem tem algumas vantagens, pois os reagentes estão disponíveis comercialmente, baratos em comparação com outros, quimicamente estáveis, e permite a análise de até cinco amostras em uma única corrida LC-MS.

Introduction

As ciências "omics" são caracterizadas pela análise profunda de um conjunto de moléculas, como DNA, RNA, proteínas, peptídeos, metabólitos, etc. Estes conjuntos de dados gerados em larga escala (genômica, transcriômica, proteômica, peptidômica, metabolômica, etc.) revolucionaram a biologia e levaram a uma compreensão avançada dos processos ^biológicos1. O termo peptidomia começou a ser introduzido no início ^{do século XX}, e alguns autores se referem a ele como um ramo da proteômica2. No entanto, a peptidômica possui particularidades distintas, onde o principal interesse é investigar o conteúdo de peptídeos gerad....

Protocol

O procedimento a seguir para extração de peptídeos e metilação redutiva foi adaptado de procedimentos publicados anteriormente24,25,26,27. Esse protocolo seguiu as diretrizes do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) e foi aprovado pela Comissão de Ética para Uso de Animais (CEUA) do Instituto de Biociências da Universidade estadual de São Paulo. As etapas do protocolo são mostradas na Figura 1.

NOTA: Prepare todas as soluções aquosas em água ultrauso.

Results

Os resultados obtidos a partir das corridas realizadas no espectrômetro de massa são armazenados em arquivos de dados brutos que podem ser abertos no software de espectrômetro de massa. Nos espectros de MS, é possível observar grupos de pico representando peptídeos rotulados de acordo com o esquema de rotulagem utilizado, variando de 2-5 rótulos. Por exemplo, na Figura 2, pares de picos detectados em tempo cromatográfico são representados em um experimento onde apenas dois rótulos isotópicos.......

Discussion

Na maioria dos estudos de peptidóticos, um dos passos críticos é, sem dúvida, a preparação da amostra que deve ser cuidadosamente realizada para evitar a presença de fragmentos de peptídeos gerados por proteases após alguns minutos após a morte. Os estudos iniciais sobre extratos cerebrais preparados a partir de amostras não micro-ondas mostraram um grande número de fragmentos de proteínas presentes nos microfiltratos de 10 kDa. Diferentes abordagens foram descritas para evitar espectros de peptídeos da degradação protei.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filtros de corte de 10 kDa	Merck Millipore	UFC801024	Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10
kDa Acetona	Sigma-Aldrich	179124
Acetonitrila	Sigma-Aldrich	1000291000
Bicarbonato de amônio	Sigma-Aldrich	11213
coluna analítica (EASY-Column)	EASY-Column	(SC200)	10 cm, ID75 µ m, 3 e micro; m, C18-A2
Etil 3-aminobenzoato metanossulfonato	Sigma-Aldrich	E10521	MS-222
Fluoresamina	Sigma-Aldrich	F9015
Solução de formaldeído	Sigma-Aldrich	252549
Formaldeído-13C, d2, solução	Sigma-Aldrich	596388
Formaldeído-d2 solução	Sigma-Aldrich	492620
Ácido fórmico	Sigma-Aldrich	33015
Hotte	Quimis	Q216
Ácido clorídrico - HCl	Sigma-Aldrich	258148
Tubos de retenção LoBind-Protein	Eppendorf	EP0030108116-100EA
LTQ-Orbitrap Velos	Thermo Fisher Scientific	LTQ Velos
Forno de microondas	Panasonic	NN-ST67HSRU
n Easy-nLC II nanoHPLC	Thermo Fisher Scientific	LC140
PEAKS Studio	Bioinformatics Solutions Inc.	VERSÃO 8.5
Solução salina tamponada com fosfato	Invitrogen	3002	comprimidos
pré-coluna (EASY-Column)	Thermo Fisher Scientific	(SC001)	2 cm, ID100 µ m, 5 e micro; m, C18-A1
Centrífuga refrigerada	Hermle	Z326K	para tubos cônicos
Centrífuga refrigerada		Visão VS15000CFNII	para microtubos
Colunas de limpeza de fase reversa    (Cartucho Oasis HLB 1 cc)	Waters	186000383	Oasis HLB 1 cc Cartucho
Cianoborodeuterido de sódio - NaBD3CN	Sigma-Aldrich	190020
Cianoborohidreto de sódio - NaBH3CN	Sigma-Aldrich	156159
Fosfato de sódio dibásico	Sigma-Aldrich	S9763	NOTA: 0,2 M PB = 0,1 M tampão fosfato pH 6,8 (26,85 mL de Na2HPO3 1M) mais tampão fosfato 0,1 M pH 6,8 (23,15 mL de NaH2PO3 1M) a 250 ml de água
Fosfato de sódio monobásico	Sigma-Aldrich	S3139
Sonicator	Qsonica	Q55-110
Peptídeo padrão	Proteimax		: Tampão de trietilamônio LTLRTKL
- TEAB 1 M	Sigma-Aldrich	T7408
Ácido trifluoroacético - TFA	Sigma-Aldrich	T6508
Água ultra purificada	Milli-Q	Direct-Q 3UV
Centrífuga a vácuo	GeneVac	MiVac Concentrador de DNA Banho-maria
	Cientec	266
Xcalibur Software	ThermoFisher Scientific	OPTON-30965