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Isolamento e Cultura das Células Epiteliais Gengivais Humanas Primárias usando Y-27632

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DOI:

10.3791/62978

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6 de novembro de 2021

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1Department of Tissue Engineering and Regeneration, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 2Department of Orthodontics, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 3Department of Stomatology, Shengli Oilfield Central Hospital, 4Department of Pediatric Surgery, Shengli Oilfield Central Hospital, 5Ningbo Stomatology Hospital of Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College

Neste artigo

Resumo

Aqui apresentamos um método modificado para o isolamento e cultura das células epiteliais gengival humanas adicionando o inibidor de Rocha, Y-27632, ao método tradicional. Este método é mais fácil, menos demorado, melhora as propriedades das células-tronco e produz um número maior de células epiteliais de alto potencial, tanto para o laboratório quanto para aplicações clínicas.

Resumo

O tecido gengival é a primeira estrutura que protege os tecidos periodontais e desempenha papéis significativos em muitas funções orais. O epitélio gengival é uma importante estrutura de tecido gengival, especialmente na reparação e regeneração do tecido periodontal. Estudar as funções das células epiteliais gengival tem valor científico crucial, como reparar defeitos orais e detectar a compatibilidade de biomateriais. Como as células epiteliais gengivais humanas são células queratinizadas altamente diferenciadas, sua vida útil é curta, e são difíceis de passar. Até agora, há apenas duas maneiras de isolar e cultivar células epiteliais gengivas, um método de explante direta e um método enzimático. No entanto, o tempo necessário para obter células epiteliais usando o método de explanta direta é maior, e a taxa de sobrevivência celular do método enzimático é menor. Clinicamente, a aquisição de tecido gengival é limitada, por isso é necessário um sistema de isolamento e cultura in vitro estável, eficiente e simples. Melhoramos o método enzimático tradicional adicionando Y-27632, um inibidor de quinase associado a Rho (ROCK), que pode promover seletivamente o crescimento de células epiteliais. Nosso método enzimático modificado simplifica os passos do método enzimático tradicional e aumenta a eficiência da cultura de células epiteliais, que tem vantagens significativas sobre o método de explante direta e o método enzimático.

Introdução

A gingiva humana, a estrutura de defesa de primeira linha que protege o tecido periodontal, não é apenas uma barreira física e química1,mas também secreta diferentes classes de mediadores inflamatórios que participam de respostas imunes e constituem uma barreira imune2,3. O epitélio gengival desempenha um papel importante na reparação e regeneração do tecido periodontal. Portanto, estudar a defesa e imunidade do epitélio gengival é de grande importância para a compreensão da ocorrência, diagnóstico e tratamento da periodontite. O isolamento e a cultura das células epiteliais gengival do tecido gengival humano é o primeiro passo necessário para estudar o epitélio gengival. Tal procedimento requer operações básicas como a produção de células de sementes para a engenharia de tecidos, modelos in vitro de doenças periodontais associadas e materiais para reparação de defeitos periodontais.

As células epiteliais gengivais primárias são caracterizadas por uma baixa taxa de divisão in vitro4, pesquisadores têm procurado um método ideal de isolamento e cultivo há décadas. Até o momento, duas técnicas diferentes, um método de explante direta e um método enzimático, são comumente utilizadas em laboratórios para obter células de epitélio gengival primário in vitro4,5. O método de explante direta tem vantagens como a exigência de uma menor quantidade de amostras de tecido e procedimento de isolamento simples, mas tem as desvantagens de maior tempo de cultura e suscetibilidade à contaminação5. Embora o método enzimático encurte o tempo de cultura necessário, a eficiência é relativamente baixa e varia dependendo das enzimas e médias utilizadas. Kedjarune et al.6 mostraram que o método de explante direta, que requer mais tempo antes da subcultura (2 semanas), parecia ser mais bem sucedido para o cultivo de células epiteliais gengivas em comparação com o método enzimático. No entanto, comparando esses dois métodos, Klingbeil et al.7 descobriram que o método enzimático teve os melhores resultados para as culturas primárias das células epiteliais orais, e foi possível obter o rendimento celular ideal no menor período de tempo (11,9 dias versus 14,2 dias).

Por isso, foi importante desenvolver um método mais conveniente e eficaz para o isolamento e cultura das células epiteliais orais4. Relatamos anteriormente que a adição de Y-27632, um inibidor da quinase proteica associada a Rho (ROCK), simplifica o procedimento de isolamento das células epidérmicas primárias humanas e queratinócitos dos tecidos de pele adultos8,9,10. Desenvolvemos o G-médio, um novo meio de inoculação condicionada que separa espontaneamente epidérmico das células dérmicas e suporta o crescimento e o rendimento das células epidérmicas primárias8,9,10. No presente estudo, desenvolvemos uma nova técnica de isolamento e cultura livre de soro para células epiteliais gengival, combinando G-médio com Y-27632. Em essência, nosso método baseia-se em uma simplificação do método enzimático tradicional de duas etapas, por isso comparamos nosso novo método com o método de explant direto. Este método enzimático modificado encurta significativamente o tempo necessário para separar as células epiteliais gengival do tecido gengival e aumenta a eficiência de cultura de células epiteliais gengivais.

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Protocolo

Os tecidos humanos utilizados neste protocolo são tecidos gengival adultos frescos descartados a partir de extrações de dentes impactados no Departamento de Cirurgia Maxilofacial de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética em Pesquisa Humana da Instituição (Protocolo Nº. GR201711, Data: 27/02/2017).

1. Preparativos

  1. Colete tecidos gengival adultos frescos em tubos de 15 mL contendo 10 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) complementados com penicilina/estreptomicina de 3% (P/S) e mantenha os tecidos a 4 °C.
    NOTA: Trate os tecidos como detalhados abaixo dentro de 24 horas após a excisão.

2. Prepare reagentes e meio de cultura

  1. Prepare a solução de lavagem: 3% P/S. Mix 50 mL de PBS com 1,5 mL de penicilina (100 U/mL) e 1,5 mL de estreptomicina (100 mg/L).
  2. Prepare 500 mL de meio contendo fator de crescimento (chamado G-médio): DMEM/F12 (3:1) médio contendo 1% P/S, 2% suplemento B27, 20 ng/mL de fator de crescimento epidérmico (EGF), 40 ng/mL de fator de crescimento fibroblasto 2 (FGF2) e 40 μg/mL de fungiz.
  3. Preparar soluções de digestão enzimática para o novo método: Dissolver 125 mg de pó de dispase e 125 mg de pó de colagenase tipo I em 50 mL de DMEM.
    NOTA: Filtre todas as soluções enzimásas através de um coador de 0,22 μm e armazene a 4 °C.
  4. Prepare 500 mL do meio para neutralizar a digestão enzimática: 10% soro bovino fetal (FBS) e 1% P/S no meio DMEM.

3. Método de explante direta

  1. Pré-tratamento de tecido gengival
    1. Lave tecido gengival com 5 mL de 75% de etanol para 30 s. Em seguida, enxágue duas vezes com 5 mL da solução de lavagem (passo 2.1) por 5 min.
      NOTA: Realize todas as lavagens em pratos de cultura celular com diâmetro de 50 mm.
  2. Cultura celular epitelial gengival
    1. Corte o tecido gengival em 1 mm3 pedaços e espalhe-os em um prato de cultura celular de 100 mm. Use fórceps pontiagudas finas e tesouras oftálmicas para as operações de corte.
    2. Adicione o meio-G (passo 2.2) ao prato de cultura. Em seguida, incubar o prato de cultura em uma incubadora de 5% de CO2 a 37 °C. Use um microscópio invertido (40x) para examinar os tecidos a cada 24 horas.
    3. Remova os pedaços de tecido gengival quando as células epiteliais se propagaram a um diâmetro de 2-5 mm ao redor dos pedaços de tecido. Troque o G-médio a cada 2-4 dias.

4. O novo método enzimático modificado

  1. Pré-tratamento de tecido gengival
    1. Para isso, siga os mesmos passos descritos para o método de explant direto, passo 3.1.1.
  2. Digestão do tecido gengival
    1. Corte o tecido gengival em pedaços minúsculos, aproximadamente < 1 mm de tamanho, com duas lâminas esterilizadas. Repita o processo de trituração com duas lâminas cirúrgicas.
    2. Adicione 1 mL de dispase de 2,5 mg/mL + solução de colagenase a um tubo de centrífuga de 1,5 mL contendo as peças de tecido gengival e, em seguida, incubar o tubo por 15-20 min em uma incubadora a 37 °C.
    3. Quando o tecido se tornar transparente e flocculente, adicione 1 mL da solução de neutralização para terminar a digestão. Misture bem a solução pipetando para cima e para baixo 10-15 vezes. Passe a solução através de um filtro de malha de 100 μm.
    4. Centrifugar a 200 x g por 5 min.
    5. Remova o supernasce e resuspenha a pelota celular na parte inferior em 10 mL de meio contendo fator de crescimento (passo 2.2). Transfira a suspensão celular para um prato de cultura celular de 100 mm. Adicione 10 μM de Y-27632 ao prato de cultura celular.
    6. Cultume as células a 37 °C em uma incubadora de CO2 de 5%. Substitua o antigo meio-G pelo meio-G fresco a cada 2 dias. Observe as células no dia 1 e dia 3.

5. Passagem celular

  1. Retire o prato da incubadora, retire o meio gasto e lave duas vezes com PBS. Adicione 2 mL de 0,05% de trippsina para cada prato de 100 mm.
    NOTA: Agite o prato para ter certeza de que há contato suficiente entre a solução Trypsin e o fundo do prato.
  2. Deixe o prato em uma incubadora em torno de 5 min a 37 °C para o processo de digestão.
  3. Use um microscópio (40x) para examinar as células e certificar-se de que a maioria das células se separou da parte inferior do prato.
  4. Adicione 2 mL da solução de neutralização para parar a digestão e transfira as células para um tubo de 15 mL. Pipeta para cima e para baixo 10-15 vezes. Centrifugar as células a 200 x g por 5 min.
  5. Remova o supernatante lentamente. Resuspend as células com 10 mL de G-médio e conte o número de células.
  6. Adicione cerca de 1 x 106 células em 10 mL de G-médio e 10 μM Y-27632 a cada prato de 100 mm.
  7. Renove o G-medium e Y-27632 a cada 2 dias. Veja as células nos dias 1 e 5.

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Resultados

A Figura 1 mostra um diagrama esquemático do método de explant direto e do método enzimático modificado. O método de explante direta não precisa de enzima digestiva durante todo o processo. Em contraste, o método enzimático tradicional geralmente precisa de dois conjuntos de enzimas digestivas, despase e colagem, para separar a folha epitelial da camada de fibroblasto subjacente, e então tentar a liberação das células epiteliais em suspensão. Nosso novo método omite a etapa da separação e é ...

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Discussão

O tecido gengival é uma estrutura fundamental que mantém a integridade periodontal e a saúde. As células epiteliais gengival têm papéis significativos na reparação e regeneração do tecido periodontal e podem ser utilizadas em pesquisas científicas e aplicações clínicas e áreas relacionadas, incluindo biologia oral, farmacologia, toxicologia e deficiências de mucosa oral18. Portanto, é necessário desenvolver um método estável e eficiente para a colheita das células epiteliais orais

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Divulgações

Todos os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Programa-Chave da Fundação de Ciência Natural da Província de Shandong (ZR2019ZD36) e pelo Programa de Pesquisa e Desenvolvimento da Província de Shandong (2019GSF108107) para X.W.; o Programa de Pesquisa e Desenvolvimento chave da Província de Shandong (2018GSF118240) para J.G.; Projeto de Desenvolvimento de Ciência e Tecnologia Médica e Em Saúde da Província de Shandong (2018WS163) para Z.X., e o Projeto de Desenvolvimento de Ciência e Tecnologia Médica e Em Saúde da Província de Shandong (2019WS045) para J.S.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nomes, abreviaturas e Comentários
Condessa contador de células automatizadoShanghai Ruiyu Bio-science& Tecnologia Co.Ltd.BBA0218ACautomática de CO2 de contagem de células
Thermo Scientific51026333para incubação de células
Centrífuga Sorvall ST 16R CentrífugaThermo Scientific75004380Centrífuga de células
Prato de cultura de célulasEppendorf30702115Para cultura de células
Tubo de centrífuga de 50 mlKIRGEN171003Para centrifugação de células
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mlKIRGEN190691JPara digestão celular
FiltroCorning incorporado431792Filtração celular
Solução tamponada com fosfatoSolarbio Life ScienceP1020-500Solução de lavagem
DMEMThermo ScientificC11995500Componente do meio de neutralização
Definido K-SFMVida útil Technologies10785-012Meio de cultura de células epiteliais gengivais
Penicilina EstreptomicinaThermo Scientific15140-122Antibióticos
Fetal Bovino SerumBiological Industries04-001-1AC5Componente do meio de neutralização
0.05% TrypsinLife Technologies25300-062Para HGGEPCs meio de diluição de dissociação
Life Technologies50-9701Para matriz de revestimento
DispaseGibco17105-041Para isolamento de HGGEPCs
Colagenase Tipo ILife Technologies17100-017Para isolamento de HGGEPCs
F12 Nutrient Mix, HamsLife Technologies31765035Componente do G-meio
B27 SuplementoLife Technologies17504044Fator de crescimento em G-meio
FGF-2 MilliporeMerck Biosciences341595Fator de crescimento em G-meio
Y-27632Operação do geneIAD1011inibidor de ROCK
FungizoneGibco15290026Preparação para G-meio
EGF Proteína Humana RecombinanteGibcoPHG0311Fator de crescimento em G-meio
Kit de Contagem de Células-8Dojindo Molecular TechnologiesCK04para ensaio de proliferação celular
Rabbit Anti-Human CK18Abcamab82254Para coloração de imunofluorescência para verificar o marcador de diferenciação de HGGEPCs
Rabbit Anti-Human Cytokeratin10Abcamab76318Para coloração de imunofluorescência para verificar o marcador de diferenciação de HGGEPCs
de sinalização celularvimentina anti-humana de camundongo3390Para coloração de imunofluorescência de fibroblastos gengivais
Rabbit Anti-Human pan-ckBD550951Para coloração de imunofluorescência para verificar o marcador de diferenciação de HGGEPCs
coelho anti-Ki67Abcam15580Para coloração de imunofluorescência para verificar o marcador de diferenciação de HGGEPCs
coelho anti-p63Biolegend619002Para coloração de imunofluorescência para verificar o marcador de diferenciação de HGGEPCs
coelho anti-p75NGFRAbcamab52987Para coloração de imunofluorescência para verificar o marcador de diferenciação de HGGEPCs
Incubadora celular Tecnologia de

Referências

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