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Artigo de método

Geração organoide cerebral a partir de células-tronco pluripotentes induzidas em mini-bioreatores caseiros

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DOI:

10.3791/62987

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11 de dezembro de 2021

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1Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine, Federal Medical Biological Agency, 2Faculty of Bioengineering and Bioinformatics, Lomonosov Moscow State University, 3Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine, Federal Medical Biological Agency, 4Department of Pathological Anatomy, North-Western State Medical University, 5Department of Biology, Lomonosov State University

Neste artigo

Resumo

Aqui descrevemos um protocolo para a geração de organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs). Para obter organoides cerebrais em grandes quantidades e de alta qualidade, usamos mini bioreatores caseiros.

Resumo

O organoide cerebral derivado do iPSC é uma tecnologia promissora para modelar in vitro as patologias do sistema nervoso e o rastreamento de drogas. Essa tecnologia surgiu recentemente. Ainda está em sua infância e ainda tem algumas limitações não resolvidas. Os protocolos atuais não permitem que a obtenção de organoides seja consistente o suficiente para a descoberta de drogas e estudos pré-clínicos. O amadurecimento dos organoides pode levar até um ano, pressionando os pesquisadores a lançar múltiplos processos de diferenciação simultaneamente. Impõe custos adicionais para o laboratório em termos de espaço e equipamentos. Além disso, organoides cerebrais geralmente têm uma zona necrosada no centro, que sofre de deficiência de nutrientes e oxigênio. Assim, a maioria dos protocolos atuais utiliza um sistema circulante para o meio cultural para melhorar a nutrição.

Enquanto isso, não há sistemas dinâmicos baratos ou bioreatores para o cultivo organoide. Este artigo descreve um protocolo para a produção de organoides cerebrais em minirepartores caseiros compactos e baratos. Este protocolo permite a obtenção de organoides de alta qualidade em grandes quantidades.

Introdução

Modelos derivados do iPSC humano são amplamente utilizados nos estudos de distúrbios neurodesenvolvimentantes e neurodegenerativos1. Na última década, modelos de tecido cerebral 3D, os chamados organoides cerebrais, essencialmente complementaram as culturas neuronais 2D tradicionais2. Os organoides recapitulam até certo ponto a arquitetura 3D do cérebro embrionário e permitem uma modelagem mais precisa. Muitos protocolos são publicados para a geração de organoides representando diferentes regiões cerebrais: córtex cerebral3,4,5, cerebelo6, cérebro médio, cérebro, hipotálamo7,8,9e hipocampo10. Houve vários exemplos de uso de organoides para estudar doenças do sistema nervoso humano11. Além disso, os organoides foram implementados em descobertas de medicamentos12 e utilizados em estudos de doenças infecciosas, incluindo SARS-Cov-213,14.

Os organoides cerebrais podem atingir até vários milímetros de diâmetro. Assim, a zona interna do organoide pode sofrer de hipóxia ou desnutrição e eventualmente se tornar necrosada. Portanto, muitos protocolos incluem bioreatores especiais8,shakers ou sistemas microfluidos15. Esses dispositivos podem exigir grandes volumes de mídia de cultura celular cara. Além disso, o custo desses equipamentos geralmente é alto. Alguns bioreatores consistem em muitas partes mecânicas que os tornam difíceis de esterilizar para reutilização.

A maioria dos protocolos sofre do "efeito lote"16, que gera variabilidade significativa entre organoides obtidos a partir de iPSCs idênticos. Essa variabilidade dificulta o teste de drogas ou estudos pré-clínicos que requerem uniformidade. O alto rendimento de organoides suficientes para selecionar organoides de tamanho uniforme pode resolver parcialmente este problema.

O fator tempo também é um problema significativo. Matsui et al. (2018) mostraram que os organoides cerebrais requerem pelo menos seis meses para atingir a maturidade17. Trujillo et al. (2019) também demonstraram que a atividade eletrofisiológica ocorreu apenas em organoides após seis meses de cultivo18. Devido ao longo tempo de maturação organoide, os pesquisadores frequentemente lançam uma nova diferenciação antes de completar a anterior. Múltiplos processos paralelos de diferenciação exigem despesas adicionais, equipamentos e espaço de laboratório.

Recentemente desenvolvemos um mini bioreator que resolve principalmente os problemas mencionados acimade 19. Este bioreator caseiro consiste em uma placa de Petri ultra-baixa ou não tratada com um botão plástico no centro. Este botão plástico evita a aglomeração de organoides e sua conglutinação no centro da placa de Petri, que é causada pela rotação do agitador. Este artigo descreve como este mini bioreator caseiro barato e simples permite gerar organoides cerebrais de alta qualidade em grandes quantidades.

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Protocolo

NOTA : Utilize técnica estéril em todo o protocolo, excluindo as etapas 1.2 e 1.3. Aqueça todos os meios de cultura e soluções a 37 °C antes de aplicar em células ou organoides. Cultivar células em uma incubadora de CO2 a 37 °C em 5% de CO2 em 80% de umidade. O esquema de protocolo é mostrado na Figura 1.

1. Transformando placas de Petri em mini bioreatores

  1. Corte tubos de centrífugas estéreis de 15 mL em anéis de 7-8 mm de altura; autoclave os anéis.
  2. Quebre a baixa adesão, placas de Petri não tratadas ou microbiológicas em migalhas. Dissolva cerca de 1 g de migalhas plásticas em 10 mL de clorofórmio durante a noite para preparar plástico líquido.
    ATENÇÃO: Trabalhe em um capô de fumaça.
  3. Verifique se o plástico líquido resultante é viscoso o suficiente para a pipetação; sua queda retém uma forma esférica e não se espalha na superfície. Se for muito líquido, adicione mais migalhas de plástico. Se for grosso, adicione clorofórmio.
  4. Faça um botão de plástico no centro de uma placa de Petri ultra-baixa estéril de 6 cm. Existem duas maneiras igualmente adequadas, conforme detalhado abaixo.
    1. Coloque o anel de plástico autoclavado no centro e solte o plástico líquido no interior do anel.
    2. Sem nenhum anel de plástico, deixe cair o plástico líquido no centro da placa de Petri.
  5. Deixe os pratos abertos por 2-3 h em uma capa de fluxo laminar até que sequem completas. Trate os pratos secos com radiação ultravioleta por 15-20 min.

2. Indução da diferenciação neuronal dos iPSCs

  1. Cultivar iPSCs no meio para células-tronco pluripotentes até 75-90% de confluência em placas de Petri de 35 mm pré-revestidas com uma matriz composta por proteínas extracelulares.
  2. Prepare o meio A-SR. Consulte a Tabela 1 para obter detalhes.
  3. Aspire o meio de cultivo e adicione 2 mL de meio A-SR no dia 0 de diferenciação.
  4. Prepare o meio A (ver Tabela 2).
  5. Cultivar células em média A por duas semanas entre os dias 2 e 14, meio refrescante em pratos petri a cada dois dias.

3. A formação de esferoides a partir de células precursoras neuroepiteliais no dia 14

  1. No dia 14, faça esferoides a partir de células precursoras neuroepiteliais usando uma placa de cultura especial de 24 poços contendo aproximadamente 1.200 microwells em cada poço(Figura 2C). Acompanhe o procedimento abaixo.
    NOTA: Nesta fase de diferenciação, uma placa de Petri de 35 mm geralmente contém 3 - 3,5 x 106 células precursoras neuroepitheliais. Assim, uma placa de Petri de 35 mm com células precursoras neuroepitenelianas é suficiente para 3 - 4 poços de placa de cultura de 24 poços com microwells.
  2. Prepare uma placa de cultura de 24 poços com microwells: Para cada poço, adicione 1 mL de média A. Centrífuga brevemente a 1.300 x g por 5 min em rotor de balde balançando equipado com porta-placas. Controle sob o microscópio que não há bolhas em microwells.
  3. Prepare o meio B (Tabela 3).
  4. Remover o meio da placa de Petri com células precursoras neuroefitelais; lavar as células com 2 mL de DMEM/F12. Para o descolamento celular, trate as células com 1,5 mL de solução EDTA de 0,48 mM preparada em PBS. Controle o desprendimento celular sob o microscópio.
  5. Colhe as células em um tubo de 15 mL. Adicione 5 mL de DMEM/F12 no tubo para lavar as células. Centrifugar a 200 x g por 5 min. Remova as células supernascidas e resuspendes em 2 mL de média B.
  6. Verifique a concentração e viabilidade celular por staining Trypan Blue e um hemócitometro. Calcule o volume de suspensão necessário para conter 1 x 106 células viáveis no total.
  7. Transfira a suspensão celular contendo 1 x 106 células em cada poço de uma placa de 24 poços com microwells. Adicione b médio até 2 mL em cada poço, células de pipeta suavemente para cima e para baixo várias vezes, e centrífuga brevemente 100 x g por 1 min para capturar células nos microwells.
    NOTA: O número de células por poço não deve exceder 1 x 106. Caso contrário, esferoides de microwells vizinhos se fundem.
  8. Verifique sob o microscópio que as células são distribuídas uniformemente em microwells. Reincidente a pipetação e a centrifugação se as células forem distribuídas de forma irregular.
  9. Incubar a placa durante a noite para permitir que as células se acumulem em esferoides.

4. Obtenção e cultivo de organoides

  1. Na manhã seguinte (dia 15), verifique a qualidade dos esferoides sob o microscópio. Certifique-se de que são transparentes e suaves, se saudáveis(Figura 2A,B). Colete cuidadosamente os esferoides de cada poço em um tubo de 15 mL, deixe os esferoides precipitarem pela gravidade por 2-3 minutos e, em seguida, remova o sobrenante.
  2. Adicione aos esferoides 2 mL da matriz descongelada durante o mesmo tempo no gelo. Misture suavemente por pipetar e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos.
  3. Para lavar o excesso da matriz, adicione ao tubo 8 mL de B médio. Pipeta suavemente, em seguida, centrifugar o tubo por 1 min a 100 x g.
    NOTA: Não exceda o tempo e a velocidade da centrifugação para evitar a agregação irreversível de esferoides.
  4. Remova o supernatante. Adicione ao tubo 2 mL de B médio, pipeta suavemente. Divida a suspensão esferoide entre dois mini bioreatores, cada um contendo 4 mL de médio B. Coloque os mini bioreatores em uma placa de Petri de 15 cm para evitar a evaporação da água e para evitar contaminação.
  5. Coloque a placa de Petri com mini bioreatores em um agitador orbital. Cultive os organoides a uma taxa de rotação de 70-75 rpm.
  6. No dia 16, prepare o meio C (Tabela 4).
  7. Transfira os organoides para tubo de 15 mL. Por 5 min, deixe-os cair para o fundo, aspirar o supernante, adicionar 5 mL de C médio. Devolva os organoides para os mini bioreatores.
    NOTA: Tenha cuidado para não perder os esferoides, que são transparentes e pouco visíveis.
  8. Cultivar esferoides em C médio por duas semanas, refrescando o meio a cada dois dias. Ao final dessas duas semanas, deixe cerca de 100 esferoides por mini bioreator para o cultivo seguinte. Congele eferóides excessivos em um meio de congelamento em nitrogênio líquido.
  9. No dia 30, prepare o meio D (Tabela 5).
  10. Mude o cultivo médio para médio D, que é um meio de maturação. Atualize o meio de cultivo a cada 2-3 dias durante três semanas e use o médio D sem BDNF e GDNF.

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Resultados

O esquema de protocolo é mostrado na Figura 1. O protocolo incluiu cinco mídias nas quais os iPSCs se diferenciaram em organoides cerebrais durante pelo menos um mês. A diferenciação foi iniciada, então os iPSCs atingiram a confluência de 75-90% (Figura 2A,B). Os primeiros sinais de diferenciação em relação aos neurônios foram observados nos dias 10-11 do cultivo do iPSC no médio A, quando as células começaram a se agrupar em "rosetas"

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Discussão

O protocolo descrito tem duas etapas cruciais que permitem a geração de organoides de alta qualidade de tamanho uniforme. Primeiro, os organoides crescem a partir de esferoides que são quase idênticos no número celular e na maturidade celular. Em segundo lugar, os bioreatores caseiros fornecem a cada organoide um ambiente uniforme, onde organoides não se aglomeram ou se mantêm unidos.

A qualidade celular e o estado de maturação celular são essenciais para a execução do protocolo. É fundamental...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela subvenção 075-15-2019-1669 do Ministério da Ciência e Educação Superior da Federação Russa (análise RT-PCR) e pela concessão nº 19-15-00425 da Fundação Russa de Ciência (para todos os outros trabalhos). Os autores também agradecem a Pavel Belikov por sua ajuda na edição de vídeo. Figuras do manuscrito foram criadas com BioRender.com.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Advanced DMEM/F-12Gibco12634010DMEM/F-12
AggreWell400STEMCELL Technologies Inc34425Placa de cultura de 24 poços com micropoços
Suplemento B-27SuplementoGibco 17504044Neuronal B
Suplemento GlutaMAXGibco35050061200 mM L-alanil-L-glutamina
BDNF humanoMiltenyi Biotec130-096-285
Humano FGF-2Miltenyi Biotec130-093-839
Humano GDNFMiltenyi Biotec130-096-290
KnockOut Substituiçãode Soro Gibco10828028Substituição de Soro
mTESR1STEMCELL Technologies Inc85850Meio de células-tronco pliripotentes
N2 SuplementoGibco
Meio NeurobasalGibco21103049Meio basal para manutenção das células neuronais
Solução de Penicilina-EstreptomicinaGibco15140130
PlasmocinInvivoGenant-mpt-1Antimicrobianos
PurmorlaminaEMD Millipore540220
StemMACS Y27632Miltenyi Biotec130-106-538Y27632
StemMACS DorsomorphinMiltenyi Biotec130-104-466Dorsomorphin
StemMACS LDN-193189Miltenyi Biotec130-106-540LDN-193189
StemMACS SB431542Miltenyi Biotec130-106-543SB431542
Solução Trypan BlueGibco15250061
Solução VersenGibco15040066EDTA 0,48 mM em PBS
β-mercaptoetanolGibco31350010
17502001

Referências

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