Este protocolo apresenta imagens de refletância interferométrica de partícula única projetadas para medições abrangentes e multinível de tamanho de vesículas extracelulares (EV), contagem de EV, fenótipo EV e colocalização de biomarcadores EV.
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Artigo de método
Caracterização de imagens de refletância interferométrica de partícula única de vesículas extracelulares individuais e dinâmica populacional
Neste artigo
Resumo
Resumo
As vesículas extracelulares (EVs) são vesículas de tamanho nanométrico com uma bicamada lipídica que são secretadas pela maioria das células. Os EVs carregam uma infinidade de moléculas biológicas diferentes, incluindo proteínas, lipídios, DNA e RNA, e são postulados para facilitar a comunicação célula a célula em diversos tecidos e órgãos. Recentemente, os EVs têm atraído atenção significativa como biomarcadores para diagnósticos e agentes terapêuticos para várias doenças. Muitos métodos foram desenvolvidos para caracterização de EV. No entanto, os métodos atuais para análise de VE têm limitações diferentes. Assim, o desenvolvimento de métodos eficientes e eficazes para isolamento e caracterização de EV continua sendo uma das etapas cruciais para este campo de pesquisa de ponta à medida que amadurece. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado descrevendo um sensor de imagem de refletância interferométrica de partícula única (SP-IRIS), como um método capaz de detectar e caracterizar EVs de fontes biológicas não purificadas e EVs purificadas por outras metodologias. Essa técnica avançada pode ser usada para medições abrangentes e de vários níveis para a análise do tamanho do EV, contagem de EV, fenótipo de EV e colocalização de biomarcadores.
Introdução
As vesículas extracelulares (EVs) são vesículas de membrana de tamanho nanométrico de origem celular que podem ser isoladas de vários fluidos biológicos, incluindo sangue, leite materno, saliva, urina, bile, suco pancreático e fluidos cefalorraquidianos e peritoneais. A derivação de EVs ocorre por meio de três mecanismos principais: apoptose, liberação via fusão de corpos multivesiculares com a membrana plasmática e bolhas da membrana plasmática1. Evidências de transferência EV de componentes de células doadoras para células e tecidos vizinhos ou distantes sugerem que esses pacotes fechados por membrana podem desempenhar papéi....
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Protocolo
Amostras de soro foram coletadas de camundongos de acordo com um protocolo aprovado pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) no Centro Médico da Universidade do Kansas (KUMC). O uso dessas amostras biológicas nesses experimentos também foi aprovado pelo KUMC.
1. Preparação da amostra (Dia 1)
- Determine a concentração de EV usando rastreamento de nanopartículas ou uma técnica equivalente.
- Diluir a amostra com a solução de incubação até uma concentração de 5 x 107-5 x 108 EVs/mL; é necessário um mínimo de 50 μL.
NOTA: Para amostras em que a concentração de....
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Resultados
A Figura 7 (painel esquerdo) mostra uma imagem composta de três cores de EVs derivadas de mídia condicionada HEK293 ligada ao ponto CD63 no chip e corada para CD81, CD63 e CD9 nos seguintes canais verde, vermelho e azul, respectivamente. A Figura 7 (painel superior direito) é uma imagem ampliada que mostra que cada um dos EVs capturados pode exibir a colocalização de uma ou mais cores com intensidades variadas em cada canal. A diferença na coloração das EVs capt.......
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Discussão
Os métodos atuais de caracterização de EV dependem em grande parte de EVs purificados, o que é restrito pelas limitações experimentais atuais dos métodos de purificação de EV 9,10,11,12,13. A imagem de refletância interferométrica de partícula única (SP-IRIS) é uma tecnologia eficaz que pode eliminar as etapas de purificação n.......
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Divulgações
Clayton Deighan e George Daaboul são funcionários e acionistas da NanoView Biosciences Inc.
Agradecimentos
Este trabalho foi patrocinado em parte pelo Programa de Prêmio de Aquisição de Recursos e Equipamentos de Pesquisa da Escola de Medicina da Universidade do Kansas. PCG, LKC, FD e AR foram apoiados com fundos do NIA R21 AG066488-01.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de Petri estéril de 10 cm | Fisher | FB0875712 | |
| tubo estéril de 15mL | n/a | várias | |
| placas de cultura de células de 24 poços, fundo plano | Fisher | 08-772-1 | |
| Solução de Bloqueio | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Pode ser encontrado no ExoView Kit de Tetraspanina Humana. |
| Chipfiles | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Pode ser encontrado no ExoView Kit de tetraspanina humana. |
| Chips | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Pode ser encontrado no Kit de Tetraspanina Humana ExoView. |
| Chuck | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Pode ser encontrado no Kit de Tetraspanina Humana ExoView. |
| Garrafas Estéreis de Poliestireno Descartáveis Corning Easy Grip 250 ml | Fisher | 09-761-4 | |
| Garrafas Estéreis de Poliestireno Descartáveis Corning Easy Grip 500 ml | Fisher | 09-761-10 | |
| Água Deionizada (DI) | Pinças | ||
| EMS com pontas de Fibra de Carbono | Fisher | 50-193-0842 | |
| ExoView Kit | de Tetraspanina HumanaNanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Capture para hCD81, hCD9, hCD63, IgG Control + colorações para hEV-A (hEV-CD63-647, hEV-CD81-555, hEV-CD9-488) 16 Chips por kit |
| ExoView R100 Imager | NanoView Biosciences | EV-R100 | incluindo câmera de alta especificação incluindo fluorescência de 3 cores e dimensionamento e contagem de vesículas extracelulares sem rótulo |
| Anticorpo huma CD9 IgG com etiqueta fluorescente | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Pode ser encontrado no Kit de Tetraspanina Humana ExoView. |
| O anticorpo humano CD63 IgG com etiqueta fluorescente | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | pode ser encontrado no kit de tetraspanina humana ExoView. |
| O anticorpo humano CD81 IgG com etiqueta fluorescente | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | pode ser encontrado no kit de tetraspanina humana ExoView. |
| Solução de incubação | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Pode ser encontrado no ExoView Kit de tetraspanina humana. |
| Agitador orbital ou agitador de microplacas com configurações digitais capazes de agitar a 500 rpm | n/a | vários | |
| Vedação de Placa | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Pode ser encontrado no Kit ExoView Tetraspanina Humana. |
| Solução A | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | pode ser encontrada no Kit de Tetraspanina Humana ExoView. |
| Solução B | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | pode ser encontrado no ExoView Human Tetraspanin Kit. |
| Solução C | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Pode ser encontrado no ExoView Kit de tetraspanina humana. |
| Solução D | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Pode ser encontrado no ExoView Kit de tetraspanina humana. |
| Pinça de ponta quadrada / plana | Fisher | 50-239-62 | |
| Pinça de ponta forte reta estilo Boley | Fisher | 16-100-124 | |
| Selos de placa de PCR adesiva Thermo Scientific | Fisher | AB-0558 |
Referências
- Maas, S. L. N., Breakefield, X. O., Weaver, A. M. Extracellular vesicles: Unique intercellular delivery vehicles. Trends in Cell Biology. 27 (3), 172-188 (2017).
- Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. The New E....
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Reimpressões e permissões
