Pinças magnéticas em formato de microplaca

Resumo

Aqui, descrevemos o uso de um novo ensaio de microplacas para permitir a manipulação mecânica de biomoléculas durante a realização de ensaios bioquímicos conjuntos. Isso é conseguido usando uma tampa de microplaca modificada com ímãs para criar várias pinças magnéticas estáticas através da microplaca.

Resumo

A mecanobiologia descreve como as forças físicas e as propriedades mecânicas do material biológico contribuem para a fisiologia e a doença. Normalmente, essas abordagens são métodos limitados de molécula única, o que restringe sua disponibilidade. Para atender a essa necessidade, foi desenvolvido um ensaio de microplaca que permite a manipulação mecânica durante a realização de ensaios bioquímicos padrão. Isso é conseguido usando ímãs incorporados em uma tampa de microplaca para criar várias pinças magnéticas. Nesse formato, a força é exercida através de biomoléculas conectadas a esferas paramagnéticas, equivalente a uma pinça magnética típica. O estudo demonstra a aplicação desta ferramenta com ensaios baseados em FRET para monitorar a conformidade de proteínas. No entanto, essa abordagem é amplamente aplicável a diferentes sistemas biológicos, desde a medição da atividade enzimática até a ativação de vias de sinalização em células vivas.

Introdução

A mecanobiologia se concentra em entender como a propagação de forças físicas dentro e entre as células regula a atividade celular ^1,2 e como isso se correlaciona com a organização e a dinâmica de proteínas e células.

As medições de força de molécula única revelaram como a força é usada em sistemas biológicos, de proteínas únicas a células e tecidos inteiros 3,4,5,6,7. Esses experimentos desafiadores exigem equipamentos especializados e conhecimento técnico. Por outro lado, os ensaios bioquímicos padrão podem ser realizados com maior rendimento em equipamentos comerciais prontamente disponíveis.

Aqui, o estudo descreve um ensaio mecanobiológico que permite que a manipulação baseada em pinça magnética e ensaios bioquímicos sejam realizados juntos⁸. Os ímãs são colocados em uma tampa de microplaca impressa em 3D (Figura 1A-D), permitindo o uso de leitores de placas comerciais para os ensaios. A força é aplicada através da biomolécula de interesse, acoplando a molécula a partículas paramagnéticas. Os ímãs então exercem tensão através da molécula. Alterar a distância entre as partículas e os ímãs ajusta a força exercida através da biomolécula (Figura 1E).

Representamos o uso deste ensaio usando o motor molecular à base de actina, Miosina VI. A miosina VI é regulada por retrodobramento intramolecular⁹. Demonstrou-se que a miosina VI existe em um estado auto-inibido, em que a ligação de proteínas parceiras, como a NDP52, desencadeia o desdobramento da miosina VI ^10,11. Para realizar esses ensaios, usaremos uma construção duplamente marcada do domínio da cauda da miosina VI com uma GFP N-terminal e uma RFP C-terminal em que o backfolding da proteína gera Transferência de Energia de Ressonância de Fluorescência (FRET) entre GFP e RFP. O terminal N também carrega uma etiqueta de biotinilação para imobilizar a proteína na superfície. Usamos este ensaio em combinação com medições de FRET para mostrar como a força pode afetar o dobramento traseiro da miosina VI.

Protocolo

Amostras de proteínas necessárias para este experimento e uma lista de reagentes são encontradas na Tabela de Materiais. Proteínas equivalentes devem ser produzidas para o sistema de estudo do usuário para medir as mudanças de conformação.

1. 3D tampa magnética impressa

1. Projete uma tampa de microplaca para abrigar os ímãs dentro de uma microplaca de 24 poços. Um exemplo de arquivo CAD pode ser baixado do GitHub¹². As medidas são mostradas na Figura 1.
   NOTA: A altura do pedestal pode ser alterada para alterar a distância entre os ímãs e a superfície para alterar a força aplicada. Além disso, a força final exercida sobre a partícula depende do tamanho da partícula e da lacuna entre o par de ímãs. Equações para calcular a força aplicada para partículas de 1 μm e 2,8 μm em intervalos de 0,5 mm, 1 mm e 2 mm são fornecidas em Dos Santos et ^al.8. Para os experimentos descritos aqui com partículas de 2,8 μm e uma lacuna de 2 mm, use a Equação 1.
   Equação 1:
2. Imprima em 3D uma tampa de microplaca usando Polietileno Tereftalato Glicol (PETG) em um sistema de impressora 3D.
   NOTA: Use uma impressora com resolução de camada de 0,02 mm para permitir precisão e reprodutibilidade. O impacto da precisão da impressora foi discutido em Dos Santos et ^al.8.
3. Prenda pares de ímãs de neodímio N42 cúbicos de 5 mm usando adesivo nos pedestais com os pólos magnéticos orientados para criar o campo direcionado para a parte inferior da microplaca.
4. Deixe pelo menos 1 posição vazia para atuar como um controle sem ímã.
5. Armazene em um recipiente lacrado de tamanho suficiente para colocar e remover prontamente a tampa.

2. Modificação da superfície da microplaca

1. Pegue uma microplaca limpa e não tratada com fundo de vidro de 24 poços.
2. Lave os poços 3x com 500 μL de tampão de lavagem (50 mM Tris-HCl (pH 7,5) e 50 mM NaCl) à temperatura ambiente.
3. Adicione 200 μL de biotina-BSA (0,2 mg/mL) no tampão de lavagem e deixe-o intacto por 15 min em temperatura ambiente.
   NOTA: A biotina-BSA é usada tanto para passivação quanto para fixação. Outras estratégias de passivação e fixação de superfície podem ser usadas. Para uso e otimização pela primeira vez, a concentração de biotina-BSA pode ser variada até 1 mg/mL.
4. Lave os poços 3x com 500 μL de tampão de lavagem.
5. Adicione 200 μL de estreptavidina (20 μg/mL) no tampão de lavagem e deixe-o intacto por 15 min em temperatura ambiente.
   NOTA: Para o primeiro uso, a concentração de estreptavidina pode variar até 1 mg / mL.
6. Remova a solução e lave os poços 3x com tampão de lavagem.
7. Cubra os poços com 500 μL de tampão de lavagem.
8. Conservar a 4 °C até estar pronto a utilizar. As placas devem ser usadas no mesmo dia.

3. Preparação da amostra: Imobilização de proteínas

1. Deixe a microplaca modificada na superfície atingir a temperatura ambiente.
2. Lave os poços com 500 μL de tampão de lavagem.
3. Adicione 100 nM de biotina-eGFP-Miosina VI Cauda-mRFP (proteína de amostra de estoque) e incube por 15 min em temperatura ambiente em tampão de lavagem.
   NOTA: Este exemplo de proteína é produzido conforme descrito por Dos Santos et ^al.8. As concentrações e os tempos de incubação podem variar dependendo da proteína.
4. Lave os poços 3x com 500 μL de tampão de lavagem.
5. Configure o leitor de placas para registrar espectros de fluorescência para GFP (excitação 490 nm e emissão 510-600 nm) e RFP (excitação 560 nm e emissão 580-650nm) para confirmar a presença das proteínas de fusão.
6. Se houver falta de proteína, aumentar a concentração no passo 3.3.
   NOTA: A má ligação pode estar relacionada à ligação inadequada de biotina-BSA e / ou estreptavidina e, portanto, as quantidades podem ser aumentadas em 10 vezes.
7. Se possível, realize uma medição de varredura de poço para determinar se a proteína de fusão está ligada à microplaca (Figura 2).
   NOTA: Esta medição registrará a intensidade de fluorescência em pontos específicos do poço da microplaca. Ele revelará se a proteína está ligada ao poço.
8. Certifique-se de que o sinal seja uniforme (dentro de 5%) no centro do poço onde ocorre a medição do ensaio.

4. Preparação magnética do grânulo

1. Vortex o frasco de grânulos paramagnéticos de 2,8 μm com Proteína A recombinante (Tabela de Materiais) por 30 s para ressuspender os grânulos.
2. Transferir o volume correspondente a 1 mg de grânulos paramagnéticos para um tubo de 1,5 ml.
3. Coloque o tubo em um isolador magnético (Tabela de Materiais) e remova o sobrenadante.
4. Ressuspenda os grânulos em 200 μL de PBS pipetando suavemente a solução para cima e para baixo.
5. Coloque o tubo no isolador magnético e remova o sobrenadante.
6. Repita a etapa de lavagem 3x.
7. Diluir 10 μg de anticorpo anti-RFP em 200 μL de PBS.
8. Isole as esferas no isolador magnético e ressuspenda novamente na solução de anticorpos.
9. Gire a 20 rpm por 10 min em temperatura ambiente em um rotador de bancada.
10. Coloque o tubo no isolador magnético e remova o sobrenadante.
11. Lave 3x em PBS.
12. Ressuspenda os grânulos em 200 μL de tampão de lavagem.
13. Para confirmar a imobilização de anticorpos nos grânulos, incube os grânulos carregados com anticorpos com uma solução de proteína de fusão RFP de >1 μM.
    NOTA: Confirme visualmente se a proteína está isolada pelas contas.
14. Alternativamente, meça a intensidade de fluorescência do sobrenadante (excitação 560 nm e emissão 580-650nm) para RFP em um espectrômetro de fluorescência.

5. Preparação da amostra: Acessório do grânulo

1. Adicione 10 μg da fusão paramagnética de grânulo-anticorpo diluída em tampão de lavagem (200 μL) aos poços de microplacas ligados às proteínas.
2. Não coloque grânulos em um poço de controle para verificar o efeito dos grânulos no sinal fluorescente. Preparar uma amostra de controlo sem anticorpos para determinar quaisquer interacções não específicas com os grânulos.
3. Incube a microplaca em temperatura ambiente por 30 min.
4. Lave os poços 3x com 500 μL de tampão de lavagem.
5. Se disponível localmente, verifique se as esferas estão presas à superfície em um microscópio de campo claro. Se houver falta de grânulos, aumente a concentração na etapa 5.1 para 500 μg/mL.

6. Aquisição de dados

1. Coloque a microplaca, sem tampa, em um leitor de placas fluorescentes a 25 °C.
2. Configure o leitor de placas para registrar espectros de fluorescência para GFP (excitação 490 nm e emissão 510-600 nm) e RFP (excitação 560 nm e emissão 580-650 nm) para confirmar a presença das proteínas de fusão.
   NOTA: Meça/registre os espectros de fluorescência através da parte inferior da microplaca para colocar a tampa na parte superior. Portanto, um leitor de microplacas adequado deve ser selecionado.
3. Registre um espectro de fluorescência FRET (excitação 490 nm e emissão 510-650 nm) ou monitore a fluorescência em 510 nm e 610 nm com excitação em 490 nm. Isso é configurado de acordo com as orientações do fabricante.
4. Remova a microplaca do leitor e adicione a tampa magnética.
5. Retorne ao leitor de placas e deixe a amostra por 2 min.
6. Repita a medição FRET, como na etapa 6.3.

7. Análise dos dados

1. Exporte os dados para importação em uma planilha (por exemplo, Excel).
2. Extraia manualmente os dados para GFP do doador a 510 nm e RFP do aceitador a 610 nm.
3. Calcule o FRET relativo usando a Equação 2 para cada condição.
   Equação 2:
   A: intensidade do aceptor (RFP 610 nm), D: intensidade do doador (GFP 510 nm).
   NOTA: Use o RFP recombinante sob as mesmas condições de excitação e emissão para controlar a excitação de fundo do aceitador.

Resultados

A Figura 2 mostra um exemplo de uma medição de varredura de poço em que a intensidade de fluorescência de GFP foi registrada em intervalos de 1 mm no poço da microplaca. As medições típicas de fluorescência são realizadas na posição central do poço da microplaca (posição 8,8 na Figura 2); É, portanto, importante que haja proteína ligada neste local. Conforme mostrado na Figura 2, a intensidade é maior no centro do poço em um raio de...

Discussão

Essa abordagem permite que medições baseadas em força sejam prontamente aplicadas em uma microplaca usando leitores de placas fluorescentes. É importante ressaltar que esse formato de ensaio pressupõe que há proteína funcional quando ela está ligada a uma superfície. Portanto, é necessário conhecimento prévio antes de iniciar essas medições para garantir que haja atividade proteica. Também é benéfico garantir que a ligação das moléculas aos grânulos e à superfície paramagnética seja otim...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microplaca com fundo de vidro de 24 poços	Cellvis	P24-1.5H-N	Estão disponíveis várias fontes. A menos que seja necessário, é melhor evitar superfícies tratadas e usamos vidro de grau de imagem N1.5.
Anticorpo anti-RFP	Abcam	ab290	Várias fontes estão disponíveis, mas devem garantir que haja reatividade mínima com GFP.
Microscópio óptico de bancada	Optika	IM-3
Rotador de bancada	Cole-Palmer-Stuart	SB3
Biotina-BSA	Sigma Aldrich	A8549
Software CAD - Sketch Up Educator	Sketch Up		Softwares CAD alternativos podem ser usados. Os usuários devem garantir que os formatos de arquivo sejam compatíveis com sua impressora 3D.
Dynabeads Proteína A	Fisher Scientific	10746713	2.8 µ m grânulos paramagnéticos com adesivo de contato de impacto Proteína A recombinante
	EVO-STIK
MagnaRack rack de separação magnética	ThermoFisher Scientific	CS15000	Isolador Magnético
NaCl	Fisher Scientific	10316943
Neodímio N42 Ímãs de cubo de 5 mm	Supermagnete	W-05-N
- ClarioStar	BMG Labtech		Todos os sistemas de leitura de placas podem ser usados onde as medições são possíveis sob a microplaca. A tampa do ímã exclui as medidas padrão acima
Streptavidin	Sigma Aldrich	189730
Tris-HCl	Fisher Scientific	10142400
Ultimaker PETG Filament	Ultimaker Ultimaker
S3 - impressora 3D	Ultimaker