Este protocolo apresenta um ensaio de captação de aminoácidos radiomarcado, que é útil para avaliar o consumo de aminoácidos em células primárias ou em ossos isolados.
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Artigo de método
Avaliação do Consumo de Aminoácidos em Células Ósseas Cultivadas e Eixos Ósseos Isolados
Neste artigo
Resumo
Resumo
O desenvolvimento ósseo e a homeostase dependem da diferenciação e da atividade dos osteoblastos formadores de ossos. A diferenciação de osteoblastos é caracterizada sequencialmente por proliferação seguida de síntese proteica e, finalmente, secreção da matriz óssea. A proliferação e a síntese de proteínas requerem um fornecimento constante de aminoácidos. Apesar disso, muito pouco se sabe sobre o consumo de aminoácidos em osteoblastos. Aqui descrevemos um protocolo muito sensível que é projetado para medir o consumo de aminoácidos usando aminoácidos radiomarcados. Este método é otimizado para quantificar as mudanças na absorção de aminoácidos que estão associadas à proliferação ou diferenciação de osteoblastos, tratamentos com drogas ou fatores de crescimento ou várias manipulações genéticas. É importante ressaltar que este método pode ser usado de forma intercambiável para quantificar o consumo de aminoácidos em linhagens celulares cultivadas ou células primárias in vitro ou em eixos ósseos isolados ex vivo. Finalmente, nosso método pode ser facilmente adaptado para medir o transporte de qualquer um dos aminoácidos, bem como glicose e outros nutrientes radiomarcados.
Introdução
Os aminoácidos são compostos orgânicos que contêm um grupo funcional amino (-NH2) e carboxila (-COOH) com uma cadeia lateral variável que é específica para cada aminoácido. Em geral, os aminoácidos são bem conhecidos como o constituinte básico da proteína. Mais recentemente, novos usos e funções dos aminoácidos foram elucidados. Por exemplo, aminoácidos individuais podem ser metabolizados para gerar metabólitos intermediários que contribuem para a bioenergética, funcionam como cofatores enzimáticos, regulam espécies reativas de oxigênio ou são usados para sintetizar outros aminoácidos 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10
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Protocolo
Todos os procedimentos de camundongos aqui descritos foram aprovados pelos Comitês de Estudos Animais do Centro Médico do Sudoeste da Universidade do Texas, em Dallas. O protocolo de radiação foi aprovado pelo Comitê Consultivo de Segurança de Radiação do Centro Médico do Sudoeste da Universidade do Texas, em Dallas.
1. Absorção de aminoácidos nas células (Protocolo I)
- Placa 5 x 104 células ST2 em cada poço de uma placa de cultura de tecido de 12 poços. Células de placa em α-MEM contendo 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina e 0,1 μg/mL de estreptomicina (Pen/Strep). Placas de poços extras de células para ....
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Resultados
O transporte de aminoácidos é regulado por muitos transportadores de aminoácidos ligados à membrana que foram categorizados em sistemas de transporte distintos com base em inúmeras características, incluindo especificidade do substrato, cinética, bem como dependência de íons e pH25. Por exemplo, a absorção de glutamina pode ser mediada pelos sistemas de transporte dependentes de Na+ A, ASC, γ+L e N ou pelo Sistema L independente de Na+. Os sistemas dependentes de Na+
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Discussão
O protocolo aqui descrito fornece uma abordagem rápida e sensível para avaliar a absorção de aminoácidos em resposta a várias permutações experimentais in vitro ou ex vivo. Quando comparado aos kits comercialmente disponíveis (por exemplo, Kit de Determinação de Glutamina e Glutamato), esse método é muito mais sensível, mais rápido e menos trabalhoso16,17,25. Em nosso protocolo, avaliamos a captação no buffer K.......
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Divulgações
Os autores não têm divulgações.
Agradecimentos
O laboratório Karner é apoiado por subsídios R01 do Instituto Nacional de Saúde (AR076325 e AR071967) para C.M.K.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,25% de tripsina | Gibco | 25200 | |
| Placa de 12 poços | Corning | 3513 | |
| Seringa de 1 mL | precisão 309628 | ||
| 30G Agulha | BD precisão | 305106 | |
| Cloridrato de arginina L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 contador de cintilação | |||
| Cloreto de cálcio | Sigma | C1016 | |
| Cloreto de colina | Sigma | C7077 | |
| Solução de D-(+)-glicose | Sigma | G8769 | |
| Ferramenta | Fórceps, tesouras, escapos | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ácido etilenodiaminotetracético | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamina | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Frascos de cintilação líquida | Sigma | Z190535 | |
| Solução de cloreto de lítio, | 8M Sigma | L7026 | |
| Cloreto de magnésio | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| , 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Cloreto de potássio | Sigma | P3911 | |
| Bicarbonato de sódio | Sigma | S6014 | |
| Cloreto de sódio | Sigma | S9888 | |
| Desoxicolato de sódio | Sigma | D6750 | |
| Dodecil sulfato de sódio | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic& Materiais | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (solução de cintilação) | PerkinElmer | 6013329 | |
| &alfa; - (Metilamino) ácido isobutírico | Sigma | M2383 |
Referências
- Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
- Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V.
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Reimpressões e permissões
