Avaliar a fosforilação oxidativa usando respirômetros de alta resolução tornou-se parte integrante da análise funcional das mitocôndrias e do metabolismo de energia celular. Aqui, apresentamos protocolos para a análise do metabolismo de energia celular usando respirômetros de alta resolução baseados em câmara e microplatos e discutimos os principais benefícios de cada dispositivo.
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Artigo de método
Respirometria de alta resolução para avaliar bioenergésicos em células e tecidos usando respirômetros baseados em câmara e placas
Neste artigo
Resumo
Resumo
A respirometria de alta resolução (HRR) permite monitorar a fosforilação oxidativa em tempo real para análise de estados de energia celular individuais e avaliação de complexos respiratórios usando protocolos diversificados de titulação inibidora de substrato-uncoupler (SUIT). Aqui, demonstra-se o uso de dois dispositivos de respirometria de alta resolução, e uma coleção básica de protocolos aplicáveis para a análise de células cultivadas, fibras musculares esqueléticas e cardíacas, e tecidos moles como o cérebro e o fígado são apresentados. Protocolos para células e tecidos cultivados são fornecidos para um respirômetro baseado em câmara e células cultivadas para um respirômetro à base de microplato, ambos abrangendo protocolos de respiração padrão. Para fins comparativos, as células HEK293 projetadas pelo CRISPR deficientes na tradução mitocondrial que causam deficiência múltipla do sistema respiratório são usadas com ambos os dispositivos para demonstrar defeitos celulares na respiração. Ambos os respirômetros permitem uma medição abrangente da respiração celular com seus respectivos méritos técnicos e adequação dependente da questão da pesquisa e do modelo em estudo.
Introdução
Mitocôndrias cumprem a oferta-chave de energia e são uma organela compartimentalizada contribuindo para processos bioenergetics celulares essenciais e metabólicos, como anabolismo de nucleotídeos, lipídios e aminoácidos, biogênese do aglomerado de enxofre de ferro e estão implicados em sinalização como morte celular controlada 1,2,3 . A bioenergeticia mitocondrial através da fosforilação oxidativa contribui para quase todos os processos celulares dentro da célula e, consequentemente, disfunções mitocondriais de origem primária ou secundária estão associadas a um amplo espectr....
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Protocolo
Toda a experimentação animal é realizada de acordo com o National Animal Experiment Review Board e a Agência Regional De Administração Estadual para o Sul da Finlândia. Foram utilizados neste estudo camundongos C57BL/6JOlaHsd masculinos (4-6 meses de idade). O consentimento para o uso de linhas celulares humanas foi obtido do comitê de ética institucional da Universidade de Helsinque.
1. Respirometria de alta resolução: respirômetro baseado em câmara (cHRR)
NOTA: Os experimentos nesta seção do protocolo foram realizados utilizando-se o Oroboros O2k-Core: Oxygraph-2k (Tabela de Materiais
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Resultados
Aqui, fornecemos protocolos para determinar os bioenergetics mitocondriais em células eucarióticas, tecido não fibroso (por exemplo, cerebelo) e tecido fibroso (por exemplo, músculo esquelético). Para células eucarióticas, hek293 com nocaute projetado por CRISPR de duas proteínas diferentes associadas à tradução mitocondrial resultando em múltiplas (CRISPRKO1) e deficiência oxphos grave/completa (CRISPRKO2) foram medidas com cHRR (Figura 3A-C
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Discussão
Tradicionalmente, bioenergetics mitocondriais tem sido estudado com eletrodos de oxigênio do tipo Clark. A falta de resolução e throughput, no entanto, justificava o avanço tecnológico. Até o momento, o O2k (conhecido como cHRR) e o Seahorse XF96 Flux Analyzer (conhecido como mHRR) foram amplamente adotados no campo dos bioenergésicos celulares. Aqui, apresentamos uma coleção compreensível de protocolos para análise do metabolismo de energia celular através da avaliação da respiração mitocondrial usando cHRR ou mHRR, dis.......
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Divulgações
Nenhum conflito de interesses para revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por financiamento da Academia da Finlândia (C.B.J), da Fundação Magnus Ehrnroot (C.B.J), e de uma bolsa de doutorado da Integrated Life Sciences Graduate School (R.A.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2 mL Potter-Elvehjem Vidro/PTFE Moedor/Homogeneizador de Tecidos | Omni International | 07-358029 | |
| 95% O2, 5% CO2 mistura | Potter para moagem de tecidos | ||
| ADP | Sigma | A 4386 | |
| Antimicina A | Sigma | A 8674 | |
| Ascorbato | Merck | PHR1279-1G | Chemical, dissolver em etanol |
| BSA (livre de ácidos gordos) | Sigma | A 6003 | Chemical |
| CaCO3 | Sigma | C 4830 | Chemical |
| Cytochrome c | Sigma | C 7752 | |
| Chemical Digitonin | Sigma | D 5628 | Chemical |
| Dithiothreitol | Sigma | D 0632 | Chemical, dissolver em DMSO |
| D-Sacarose | Roth | 4621.1 | |
| Dulbecco Químico ' s Águia modificada' s meio (glicose alta) | Fisher Scientific | 41965-039 | |
| Chemical Dulbecco' s Águia modificada' s médio (Sem glicose) | Fisher Scientific | A14430-01 | |
| EGTA | Sigma E 4378 | ||
| Etomoxir | Sigma | E1905 | Chemical |
| Falcon 15 ml Tubos de Centrífuga Cônicos | Fisher Scientific | AM12500 | |
| Chemical Falcon 50 ml Tubos de Centrífuga Cônicos | Fisher Scientific | AM12501 | |
| FCCP | Sigma | C 2920 | |
| Glicose | Sigma | G7021 | Química, dissolver em etanol |
| Glutamato | Sigma | G 1626 | Química |
| GlutaMax ( 100x) (200 nM L-alanil-L-glutamina dipeptídeo) | Fisher Scientific | 35050061 | Chemical |
| HEK293 células | ATTC | CRL-1573 | |
| Hemocitômetro | Fisher Scientific | 0267151B | Instrumento para contagem de células |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Químico |
| Imidazol | Fluka | 56750 | Químico |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| L-carnitina | Sigma | C0283 | Malato químico |
| Sigma | M 1000 | Hidrato químico | |
| MES Sigma | M8250 | ||
| MgCl químico < sub>2< / sub> | Sigma | M 9272 | Químico |
| Na2< / sub>ATP | Sigma | A 2383 | Químico |
| Na2Fosfocreatina | Sigma | P 7936 | |
| Na-piruvato químico ( 100 mM) (100x) | Fisher Scientific | 11360070 | |
| NEAA ( Aminoácidos não essenciais) 100x | Fisher Scientific | 11140035 | |
| FBS Normal ( 10x) | Fisher Scientific | 10500064 | |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | Instrumento de respirometria de alta resolução |
| O2k-Conjunto de titulação | Oroboros Instruments | 20820-03 | Seringas Hamilton para injeções químicas |
| Oligomicina | Sigma | O 4876 | Química, dissolver em etanol |
| Palmitoilcarnitina | Sigma | P 4509 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce BCA Kit | de Ensaio de Proteína Fisher Scientific | 23227 | |
| Piruvato | Sigma | P 2256 | Químico |
| RIPA-Buffer | Fisher Scientific | 89900 | Rotenona Química |
| Sigma | R 8875 | Chemical, dissolver em etanol | |
| Saponina | Sigma | S7900 | Chemical |
Seahorse XF DMEM assay medium pack, pH 7.4 | Agilent, Santa Clara, CA | 103680-100 | |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | Instrumento de respirometria de alto rendimento | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent, Santa Clara, CA | br/> Inclui placas de ensaio, cartuchos, guias de carregamento para transferência de compostos para o cartucho de ensaio e solução calibrante. | |
| Tesoura pequena | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Azida de sódio | Sigma | S2002 | |
| Succinato | Sigma | S 2378 | Taurina química |
| Sigma | T 8691 | Químico | |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Solução química |
| de azul de tripano | Merck | 72-57-1 | Químico |
| Tripsina 0,25% EDTA | Fisher Scientific | 25200056 | |
| Duas pinças de bordas finas | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Estoque de uridina (500x) | Sigma | U3750 | Chemical |
Referências
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), 551-560 (2006).
- Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity. Beyond ATP. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 608-620 (2017).
- Spi....
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Reimpressões e permissões
