Detecção indel seguindo CRISPR/Cas9 Mutagenesis usando análise de derretimento de alta resolução no mosquito Aedes aegypti

Como vetores de patógenos como os vírus da ^dengue1, ^zika2 e ^chikungunya3, bem como parasitas maláricos4, os mosquitos representam uma ameaça significativa à saúde pública para os seres humanos. Para todas essas doenças, há um foco substancial de intervenção de transmissão no controle de mosquitos vetores. O estudo dos genes importantes, por exemplo, na permissividade aos patógenos, na aptidão dos mosquitos, na sobrevivência, na reprodução e na resistência aos inseticidas é fundamental para o desenvolvimento de novas estratégias de controle de mosquitos. Para tais efeitos, a edição de genomas em mosquitos está se tornando uma prática comum, especialmente com o desenvolvimento de tecnologias como HEs, ZFNs, TALENs e, mais recentemente, CRISPR com Cas9. O estabelecimento de cepas editadas por genes normalmente envolve o backcrossing de indivíduos que carregam as mutações desejadas por algumas gerações para minimizar efeitos fora do alvo e fundador (gargalo), seguido pela travessia de indivíduos heterozigosos para gerar linhas homozigosas ou trans-heterozigosas. Na ausência de um marcador dominante, a genotipagem molecular é necessária nesse processo porque, em muitos casos, não podem ser detectados traços fenotípicos claros para mutantes heterozigosos.

Embora o sequenciamento seja o padrão-ouro para a caracterização genotipípica, realizar isso em centenas, ou possivelmente milhares de indivíduos, representa custos significativos, mão-de-obra e tempo necessários para obter resultados, o que é especialmente crítico para organismos com vida útil curta, como mosquitos. Alternativas comumente utilizadas são Surveyor nuclease ^assay5 (SNA^{), ensaio} T7E1 e análise de derretimento de alta resolução (HRMA, revisado ⁱⁿ⁷). Tanto o SNA quanto o T7E1 usam endonucleases que apenas se descompatem bases incompatíveis. Quando uma região mutante mutante mutada do genoma mutante heterozigoso é amplificada, fragmentos de DNA de alelos mutantes e do tipo selvagem são enais para fazer DNA de dupla cadeia incompatível (dsDNA). A SNA detecta a presença de incompatibilidades via digestão com uma endonuclease específica de incompatibilidade e eletroforese de gel de agarose simples. Alternativamente, o HRMA utiliza as propriedades termodinâmicas do dsDNA detectadas por corantes fluorescentes de ligação dsDNA, com a temperatura de dissociação do corante variando com base na presença e tipo de mutação. O HRMA tem sido utilizado para a detecção de polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs)⁸, genotipagem mutante de peixe-zebra9, aplicações microbiológicas10 e pesquisa genética ^vegetal11, entre outros.

Este artigo descreve o HRMA, um método simples de genotipagem molecular para mosquitos mutantes gerado pela tecnologia CRISPR/Cas9. As vantagens do HRMA sobre técnicas alternativas incluem 1) flexibilidade, pois tem sido comprovadamente útil para vários genes, uma ampla gama de tamanhos indel, bem como a distinção entre diferentes tamanhos indel e heterozigous, homozygous e trans-heterozygous diferenciação12,13,14, 2) custo, pois é baseado em reagentes PCR comumente usados, e 3) economia de tempo, como pode ser realizado em apenas algumas horas. Além disso, o protocolo utiliza uma pequena parte do corpo (uma perna) como fonte de DNA, permitindo que o mosquito sobreviva ao processo de genotipagem, permitindo o estabelecimento e manutenção de linhas mutantes.

1. Digitalização para polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs), projeto de primer HRMA e validação do primer

1. Identificação do SNP em mosquitos de colônia de laboratório silvestre
   1. Selecione o exon de destino para interromper a tradução adequada do polipeptídeo.
      NOTA: O alvo deve estar próximo do códon inicial ou entre os principais resíduos necessários para a função proteica. Quanto menor o exon (por exemplo, ≤200 bases), mais difícil é mirar e analisar. Evite editar perto dos limites de um exon, pois isso força um dos primers do HRMA a atravessar um intron ou estar em um intron. Isso é indesejável porque as taxas de SNP tendem a ser muito maiores nessas regiões.
   2. Design primer
      1. Vá para o site NCBI Blast - Primer ^Blast15, copie e cole o exon escolhido na caixa no topo da página | escolher o tamanho do produto PCR (certifique-se de que engloba a maior parte do exon) | escolher o organismo.
      2. Clique em Parâmetros Avançados | Opte (por PCR Product Tm) e adicione 60 (para uma temperatura ótima de 60 °C) | Pegue primers. Mantenha os outros parâmetros como padrão.
   3. Obtenha DNA genômico (gDNA) da colônia de laboratório silvestre. Reserve 10 mosquitos, anestesia-os com _CO2, e coloque-os em uma placa de Petri no gelo para mantê-los inativos. Configure 10 tubos contendo 0,5 μL do reagente para liberação de DNA do tecido e 20 μL de tampão de diluição, ambos fornecidos no kit de liberação de DNA sugerido na Tabela de Materiais.
   4. Remova uma perna de um único mosquito usando fórceps e coloque-a em um tubo correspondente de uma solução diluída do reagente de liberação de DNA (a partir da etapa 1.1.3), submergindo completamente a perna na solução. Repita esta etapa com os mosquitos restantes, limpando os fórceps com 70% de etanol antes de prosseguir para o próximo.
   5. Incubar a solução contendo perna à temperatura ambiente por 2-5 min, depois a 98 °C por 2 min, e deixe esfriar durante a configuração da reação do PCR.
      NOTA: As placas contendo o gDNA liberado podem ser armazenadas a -20 °C, e o protocolo pode ser pausado neste momento.
   6. Prepare 10 tubos contendo 10 μL de 2x PCR Master Mix, primers para uma concentração final de 0,5 μM e água de grau molecular para um volume final de 20 μL, e transfira 1 μL da amostra diluída para cada tubo. Executar PCR seguindo estes parâmetros de ciclismo: 98 °C 5 min, 40 ciclos de 98 °C para 5 s, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s por kb; prorrogação final de 72 °C para 1 min.
   7. Purifique os produtos PCR com uma enzima para degradar os primers PCs residuais e desfosforilar o excesso de dNTPs ou qualquer kit de limpeza de coluna. Continue sequenciando as amostras.
   8. Analise cada eletroferograma para a presença de picos duplos/bases ambíguas e ajuste as chamadas base manualmente em cada sequência usando o código base degenerado apropriado.
      NOTA: Esta etapa deve ser executada antes do alinhamento de sequência múltipla, pois é comum que o software de chamada base selecione o pico mais proeminente como a chamada base "verdadeira", dando a falsa impressão de uma ausência de SNPs.
   9. Execute um alinhamento de sequência múltipla usando o software de alinhamento, SeqMan Pro, listado na Tabela de Materiais ou outro software de alinhamento de código aberto, como ClustalW16 ou T-Coffee17.
      1. Abra o software de alinhamento | clique em Adicionar sequências | selecione as sequências desejadas e clique em Adicionar | uma vez que todas as sequências são escolhidas, clique em Done.
      2. Clique em Montar para executar o alinhamento. Para abrir o alinhamento, clique em Contig 1 e analise o alinhamento e identifique os SNPs (Figura 1).
         NOTA: Como alternativa às etapas 1.1.3-1.1.6, o PCR pode ser realizado a partir de DNA genômico isolado obtido a partir de amostras a granel (derivadas de indivíduos >10). Amplicons sequenciados podem ser analisados diretamente para a presença de SNPs que aparecem como picos duplos no eletroferograma, embora SNPs raros sejam mais difíceis de detectar.
   10. Projeto 3-5 rnas de guia único (sgRNAs), evitando regiões contendo qualquer SNP identificado acima, seguindo o protocolo descrito em ¹⁸.
2. Design de primer HRMA
   1. Teste a sequência de exon para a possível formação de estruturas secundárias durante a PCR usando ^mFold19.
      1. Vá para o | do Servidor Web do UNAFold clique em mFold | no menu suspenso, clique em Aplicativos | Forma dobrável de DNA.
      2. Digite o nome da sequência na caixa e cole o exon.
      3. Alterar a temperatura dobrável para 60 °C; nas condições Iônicas, alterar [Mg⁺⁺] para 1,5 e mudar unidades para mM; clique no DNA do Fold.
      4. Em Saída, abaixo Estrutura 1, clique em pdf para abrir os Lotes de Estrutura Circular.
   2. Vá para NCBI Blast - Primer ^Blast15 para design primer.
   3. Copie e cole a sequência de exon selecionada determinada pelo sequenciamento na etapa 1.1 (a sequência que contém o menor número de SNPs ou nenhum SNPs) na caixa na parte superior da página.
   4. Use o símbolo < > para marcar e excluir sequências que contenham SNPs, o local de destino e regiões com possível formação de estrutura secundária.
   5. Selecione o tamanho do produto PCR entre 80 e 150 bp e escolha o organismo.
      NOTA: Tamanhos de fragmentos maiores podem ser usados com sucesso (~300 bp). No entanto, amplicons mais longos podem diminuir a sensibilidade entre sequências diferentes em um ou apenas alguns pares de base.
   6. Clique em Obter Primers. Selecione 2-3 pares de primers a serem testados (idealmente, os sites primer estão ≥20-50 bp de qualquer local alvo CRISPR).
3. Validação do primer
   1. Execute um PCR gradiente usando gDNA de um único indivíduo.
      1. Prepare uma mistura mestre e remova uma amostra para o controle não-modelo (NTC) em um tubo separado. Adicione o modelo à mistura principal restante e aliquot em uma placa de 96 poços.
      2. Siga os parâmetros de ciclismo: 98 °C 30 s, 34 ciclos de 98 °C para 10 s, 55-65 °C 30 s, 72 °C 15 s; prorrogação final de 72 °C para 10 min.
      3. Gerar perfis de derretimento térmico seguindo os parâmetros: etapa de desinaturação 95 °C por 1 min, ressarem 60 °C por 1 min, detecção de curva de derretimento entre 75 °C e 95 °C em incrementos de 0,2 °C, com tempo de espera de 10 s a cada temperatura.
         NOTA: Apenas temperaturas de resaramento com um único perfil de derretimento térmico devem ser usadas.
4. Prossiga para gerar as linhas mutantes com injeções de embriões como descrito em ¹².

2. Preparação de DNA genômico a partir de pernas de mosquito

1. Separe os mosquitos _G1 por sexo na fase pupal para que eles não acasalem antes da genotipagem, e certifique-se de que mosquitos de controle do tipo selvagem e combinados com a idade estarão disponíveis para serem usados para referências e backcrosses. Sexo-separá-los da mesma forma.
2. Reúna os materiais necessários (Figura 2A) e prepare uma placa PCR de 96 poços com 0,5 μL do reagente de liberação de DNA e 20 μL de tampão de diluição (do kit de liberação gDNA) por indivíduo para ser genótipado (Figura 2B) e deixe-o no gelo. Reserve duas reações para ntc.
3. Rotule uma bandeja para frascos de mosquito (frascos de Drosophila ) para que cada poço na placa de 96 corresponde ao respectivo frasco de mosquito na bandeja.
4. Anestesiar os mosquitos _G1 com _CO2 e colocá-los em uma placa de vidro petri para mantê-los sedados (Figura 2C,D). Anestesiar e colocar 8 mosquitos selvagens em uma segunda placa de Petri.
5. Limpe um par de pinças com 70% de etanol e remova uma das pernas traseiras do mosquito (Figura 2E,F).
6. Submergir a perna na solução de reagente de liberação de DNA, colocar o mosquito no frasco correspondente e fechá-lo com uma esponja (Figura 2G,H).
7. Limpe as pinças novamente com 70% de etanol e proceda com a remoção da perna do próximo mosquito. Repita as etapas 2.5-2.7 até que a placa de 96 poços esteja concluída.
   NOTA: É importante limpar a pinça com 70% de etanol. Isso minimiza a contaminação cruzada do DNA.
8. Sele a placa com uma vedação óptica de placa PCR (Figura 2I) e incubar a placa de 96 poços contendo as pernas em temperatura ambiente (RT) por 2-5 min e depois a 98 °C por 2 min. Deixe a placa esfriar para RT durante o preparo da mistura PCR.
   NOTA: Todo o processo normalmente leva de 3 a 4 horas. Se os mosquitos devem ser mantidos nos frascos por mais tempo do que a duração esperada (especialmente ≥1 dia), coloque um pequeno pedaço de passa (ou fonte de açúcar e água) com cada mosquito para garantir a sobrevivência dos mosquitos durante incubações prolongadas.

3. HRMA

1. Executar PCR.
   1. Prepare uma mistura mestre contendo os seguintes componentes por cada reação: 10 μL de tampão de 2x (do kit de liberação gDNA), 0,5 μM de cada primer, 1 μL de corante EvaGreen, 0,4 μL de polimerase (do kit de liberação gDNA) e completo a 19 μL com água de grau molecular.
   2. Usando um pipet multicanal, transfira 19 μL da mistura mestre em cada poço. Transferir 1 μL da solução de liberação de DNA contendo DNA de mosquito preparado na seção 2 para a placa (Figura 3A). Sele a placa com uma vedação óptica de placa PCR.
   3. Realize o PCR seguindo os parâmetros de ciclismo: 98 °C para 5 min, 39 ciclos de 98 °C para 10 s, a temperatura de ressarcial escolhida (72 °C) para 30 s; prorrogação final 72 °C por 2 min.
2. Gerar perfis de derretimento térmico seguindo os parâmetros: etapa de desinaturação 95 °C por 1 min, ressarem 60 °C por 1 min, detecção de curva de derretimento entre 75 °C e 95 °C em incrementos de 0,2 °C, com tempo de espera de 10 s a cada temperatura. Consulte o Material Suplementar e a Figura Suplementar S1-S5 para obter uma descrição detalhada da configuração do software para execução do HRMA usando o sistema cfx96 em tempo real.
3. Examine os perfis de derretimento (Figura 3B). Atribua controle de tipo selvagem ao cluster de referência.
   NOTA: O software (ver a Tabela de Materiais) normaliza automaticamente os dados e designa clusters com cores para diferentes curvas de fusão.
4. Marque os diferentes clusters com cores correspondentes no modelo de 96 poços (Figura 3C).
5. Selecione os indivíduos com curvas de interesse, remova-os dos tubos e backcross (Figura 3D). Alimentam as fêmeas acasaladas e coletam ovos _G2 .

4. Verificação de sequência por sequenciamento Sanger

1. Purifique o produto PCR dos poços com mosquitos selecionados (a partir da placa preparada na seção 3.1), utilizando uma enzima para degradar os primers de PCR residuais e desfosforilarar o excesso de dNTPs. Alternativamente, use qualquer kit de limpeza de coluna e proceda com o sequenciamento das amostras.
   NOTA: O sequenciamento direto pode ser mais desafiador quando o tamanho do produto PCR é pequeno (≤200 bp). Nesses casos, projete primers para amplificar fragmentos maiores que englobam o local alvo (≥250 bp) e amplificar por PCR usando o DNA na placa de 96 poços (etapa 2.2).
2. Analisar e identificar os indels usando o software de visualização de rastreamento (Figura 4). Alternativamente, o software Poly Peak ^Parser20 pode ajudar a detectar a mutação em indivíduos heterozigosos.
   1. Acesse o site do Poly Peak Parser, selecione a sequência dos indivíduos mutantes no menu Procurar e copie e cole a sequência de referência na caixa.
      NOTA: O alinhamento entre o alelo alternativo e a referência aparecerá automaticamente no lado direito da tela.

Mosquitos contendo mutações nos genes AaeZIP11 (transporte de ferro putativo21) e mio-fem (gene de miosina tendenciosa da fêmea relacionado aos músculos de voo13) foram obtidos utilizando a tecnologia CRISPR/Cas9, genótipo usando HRMA e sequência verificada (Figura 5). As amostras mutantes Figura 5A e Figura 5C mostram a intensidade de fluorescência normalizada das curvas HRM das amostras mutantes de AaeZIP11 e mio-fem, respectivamente, juntamente com controles do tipo selvagem. As figuras 4B e Figura 4D mostram a ampliação das curvas de diferença (das amostras mutantes AaeZIP11 e myo-fem, respectivamente) entre os perfis de derretimento dos diferentes clusters atribuídos pelo software após subtrair cada curva da referência do tipo selvagem. Indivíduos heterozigosos e homozigos mutantes AaeZIP11 foram colocados em diferentes aglomerados e são facilmente distinguidos dos controles do tipo selvagem (Figura 5B). Os indivíduos mô-fem mutantes heterozigosos também são distintos dos controles (Figura 5D). Observe que dois clusters dentro dos controles do tipo selvagem estavam presentes em ambos os casos, provavelmente devido à presença de SNPs na região alvo (Figura 5), destacando a necessidade de usar múltiplas amostras de controle para evitar a categorização de controles como mutantes quando os SNPs não podem ser evitados.

A Figura 4A mostra a análise sequencial do mutante AaeZIP11 . O eletroferograma de AaeZIP11 mutantes heterozigosos indica a posição nucleotídea onde o indel ocorreu. Isso é representado por uma mudança de picos únicos para duplos, pois as posições polimórficas mostrarão ambos os nucleotídeos concomitantemente (Figura 4A). O número de pares de base excluídos ou inseridos foi calculado contando os picos únicos no final da execução (Figura 4B) como um dos fios de DNA será menor ou mais longo do que o outro pelo número de pares de base excluídos ou inseridos, respectivamente. Recomenda-se o uso de gDNA verificado por sequência dos mutantes como referência para a identificação das heterozygotes para ajudar nas análises do HRMA para as gerações subsequentes. A atribuição manual para as curvas pode ser necessária quando curvas semelhantes são automaticamente atribuídas a diferentes clusters. Isso pode ser feito comparando as curvas de mudança de temperatura e as curvas de diferença. O ajuste manual do software pode ser necessário para atribuir adequadamente amostras a clusters. Os resultados do HRMA de AaeZIP11 e de um mutante chamado Aeflightin mostram que análises de amostras individuais foram necessárias para categorizar com sucesso heterozygotes, homozygotes e trans-heterozygotes. Inicialmente, a atribuição automática de cluster do software não poderia fazer uma distinção adequada entre os grupos (Figura 6A, Figura 6C, Figura 6E e Figura 6G). Cada amostra foi então analisada individualmente e atribuída aos grupos corretos com base na similaridade com amostras de referência de heterozigotes, homozygotes e trans-heterozygotes (previamente verificadas por sequenciamento) (Figura 6B, Figura 6D, Figura 6F e Figura 6H).

Figura 1: Identificação do SNP. Representação esquemática do alinhamento de sequência múltipla do fragmento AaeZIP11 do tipo selvagem. Em vermelho estão os SNPs, e em verde estão os fragmentos livres de SNPs; esta região livre de SNP é sugerida para o design sgRNA e primer. Abreviaturas: SNP = polimorfismo de nucleotídeo único; sgRNA = RNA guia único; LVP = Tensão de Liverpool. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Procedimento experimental para obtenção de DNA genômico de pernas de mosquito para HRMA. (A) Materiais para obtenção de DNA genômico, incluindo pipetas, pontas, placa PCR, vedação óptica, reservatório, tampão de diluição e solução de liberação de DNA. (B) Preparação da placa PCR contendo reagente de liberação de DNA e tampão de diluição. (C) Anestesia de mosquitos com CO2. (D) Limpar a pinça com 70% de etanol para evitar contaminação entre as amostras. (E) Configuração experimental incluindo pinças, rack para frascos de mosquito, placa de Petri em cima de um recipiente de gelo com mosquitos anestesiados, e a placa PCR previamente preparada. (F) Remoção da perna do mosquito. (G) Visão de zoom da perna do mosquito sendo submersa na solução de reagente de liberação de DNA. (H) Mosquito único colocado no frasco. (I) Selar a placa PCR contendo as pernas do mosquito. Abreviação: HRMA = análise de derretimento de alta resolução. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Procedimento experimental para análises de HRM. (A) Transferir o gDNA liberado para uma placa de 96 poços contendo a mistura PCR. (B) Inspeção visual das curvas de diferença. (C) Marcando cada amostra no modelo de 96 poços com a mesma cor da sua respectiva cor de curva de diferença. (D) Retroamendo os indivíduos do mesmo aglomerado. Abreviaturas: HRM = derretimento de alta resolução; gDNA = DNA genômico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Análise sequencial de um mutante AaeZIP11 . (A) Alinhamento nucleotídeo do mutante AaeZIP11Δ56. Traços destacados em amarelo são as bases excluídas. Na caixa, o eletroferograma passa de picos únicos para picos duplos, representando a posição onde ocorreu a exclusão (seta). (B) Eletroferograma do final da corrida de sequenciamento e da transição de picos duplos para picos únicos. Observe que o número de picos únicos representa o número de bases excluídas (retângulo cinza). As sequências de primer são fornecidas na Tabela Suplementar S1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: HRMA de DNA extraído de pernas de mosquito. O DNA foi extraído de uma única perna dos mosquitos AaeZIP11 (A e B) e myo-fem (C e D) e analisado pelo HRMA. A e C denotam os sinais de fluorescência normalizados das amostras a valores relativos de 1,0 a 0. B e D denotam a ampliação das diferenças de curva subtraindo cada curva da referência do tipo selvagem (tensão de Liverpool). Abreviaturas: HRMA = análise de derretimento de alta resolução; LVP = Tensão de Liverpool; RFU = unidades de fluorescência relativa. As sequências de primer são fornecidas na Tabela Suplementar S1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Exemplos de atribuições manuais de grupo. (A-D) HRMA para mutantes de Aeflightin. (A e C) As curvas de derretimento (curvas de escala linear normalizadas e curvas de diferença, respectivamente) são agrupadas automaticamente pelo Software de Análise de Derretimento de Precisão. (B) Normalização das curvas diferenciais alteradas manualmente. (D) Após alterar a normalização das curvas diferenciais, cada amostra foi atribuída individualmente pelas temperaturas máximas nas curvas de diferença para controles positivos correspondentes (amostras anteriormente sequenciadas identificadas por heterozygotes Δ4 e Δ5 e Δ4Δ5 trans-heterozygotes), permitindo a identificação clara dos 3 grupos. Setas vermelhas e marrons são adicionadas para destacar os picos em diferentes temperaturas. (E-H) HRMA para mutantes AaeZIP11. (E e G) As curvas de derretimento são automaticamente atribuídas pelo software. (F e H) Mutantes na segunda auto-cruz heterozigagous foram apropriadamente atribuídos aos grupos corretos pela semelhança das curvas normalizadas e de diferença com referências previamente determinadas (codificadas por cores em curvas). Heterozygotes asg, Homozygotes asg e Trans-heterozygotes asg: curvas de derretimento atribuídas pelo Software de Análise de Derretimento de Precisão. Abreviaturas: HRMA = análise de derretimento de alta resolução; LVP = Tensão de Liverpool; RFU = unidades de fluorescência relativa. As sequências de primer são fornecidas na Tabela Suplementar S1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Material Suplementar: Protocolo detalhado para configurar o HRMA no Sistema em Tempo Real CFX96 (por exemplo, Bio-rad). Por favor, clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar S1: Instruções passo a passo para configurar o protocolo de ciclismo no Gerenciador CFX Bio-rad. Consulte Material Suplementar 2.1-2.3. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura Suplementar S2: Instruções passo a passo para uma configuração de placa no Gerenciador CFX Bio-rad. Consulte Material Suplementar 3.1-3.4. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar S3: Instruções passo a passo para uma configuração de placa no Gerenciador CFX Bio-rad. Consulte Material Suplementar 3.5-3.6. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar S4: Instruções passo a passo para a configuração de execução no Gerenciador CFX Bio-rad. Consulte Material Suplementar 4.1. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar S5: Instruções passo a passo para análise de HRMA no Gerenciador CFX Bio-rad. Consulte Material Suplementar 5.1-5.3. Abreviação: HRMA = análise de derretimento de alta resolução. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Tabela Suplementar S1: Lista de primers. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.