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Artigo de método

Detecção de vírus e proteínas salivares de um vetor cigarrinha no hospedeiro vegetal

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DOI:

10.3791/63020

⸱

14 de setembro de 2021

 ,  ,  , 
1Vector-borne Virus Research Center, Fujian Province Key Laboratory of Plant Virology, Institute of Plant Virology, Fujian Agriculture and Forestry University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo demonstra como utilizar o hospedeiro vegetal para detectar proteínas salivares de cigarrinhas e proteínas virais de plantas liberadas por vetores cigarrinhas.

Resumo

Insetos vetores transmitem horizontalmente muitos vírus de plantas de importância agrícola. Mais da metade dos vírus de plantas são transmitidos por insetos hemípteros que têm partes bucais sugadoras de perfuração. Durante a transmissão viral, a saliva do inseto faz a ponte vírus-vetor-hospedeiro porque os vírus vetores da saliva e as proteínas do inseto desencadeiam ou suprimem a resposta imune das plantas dos insetos para os hospedeiros das plantas. A identificação e análise funcional de proteínas salivares estão se tornando uma nova área de foco no campo de pesquisa das interações arbovírus-hospedeiro. Este protocolo fornece um sistema para detectar proteínas na saliva de cigarrinhas usando o hospedeiro da planta. O vetor cigarrinha Nephotettix cincticeps infectado com o vírus anão do arroz (RDV) serve como exemplo. A vitelogenina e a proteína P8 do capsídeo externo principal do RDV vetorado pela saliva de N. cincticeps podem ser detectadas simultaneamente na planta de arroz da qual N. cincticeps se alimenta . Este método é aplicável para testar as proteínas salivares que são temporariamente retidas no hospedeiro da planta após a alimentação do inseto. Acredita-se que este sistema de detecção beneficiará o estudo das interações hemiptera-vírus-planta ou hemiptero-planta.

Introdução

O modo de transmissão vetor-hospedeiro das arboviroses, um problema fundamental, está na fronteira das ciências biológicas. Muitos vírus de plantas de importância agrícola são transmitidos horizontalmente por insetos vetores1. Mais da metade dos vírus de plantas são vetores por insetos hemípteros, incluindo pulgões, moscas-brancas, cigarrinhas, cigarrinhas e tripes. Esses insetos possuem características distintas que lhes permitem transmitir eficientemente vírus de plantas1. Possuem partes bucais sugadoras de piercing e se alimentam da seiva do floema e do xilema, e secretam sua saliva 1,2,3,4. Com o desenvolvimento e aprimoramento de técnicas, a identificação e análise funcional de componentes salivares vem se tornando um novo foco de intensas pesquisas. As proteínas salivares conhecidas na saliva incluem inúmeras enzimas, como pectinesterase, celulase, peroxidase, fosfatase alcalina, polifenoloxidase, sacarose,entre outras5,6,7,8,9,10,11,12,13 . As proteínas presentes na saliva também incluem eliciadores que desencadeiam a resposta de defesa do hospedeiro, alterando o desempenho dos insetos, e efetores que suprimem a defesa do hospedeiro, o que aumenta a aptidão dos insetos e componentes indutores de respostas patológicas do hospedeiro14,15,16,17. Portanto, as proteínas da saliva são materiais vitais para a comunicação entre insetos e hospedeiros. Durante a transmissão de vírus, a saliva secretada pelas glândulas salivares de insetos virulíferos sugadores de piercing também contém proteínas virais. Os componentes virais utilizam o fluxo de saliva para liberá-los do inseto para o hospedeiro da planta. Portanto, a saliva do inseto faz a ponte entre a interação tritrófica vírus-vetor-hospedeiro. Investigar a função biológica das proteínas da saliva secretadas por insetos virulíferos ajuda a entender a relação vírus-vetor-hospedeiro.

Para vírus animais, é relatado que a saliva de mosquitos medeia a transmissão e patogenicidade dos vírus do Nilo Ocidental (WNV) e Dengue vírus (DENV). A proteína da saliva AaSG34 promove a replicação e transmissão do vírus da dengue-2, enquanto a proteína da saliva AaVA-1 promove a transmissão do vírus DENV e Zika (ZIKV) por ativar a autofagia18,19. A proteína D7 da saliva de mosquitos pode inibir a infecção por DENV in vitro e in vivo via interação direta com os virions DENV e proteína recombinante do envelopeDENV 20. Em vírus de plantas, o begomovírus tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) induz a proteína salivar Bsp9 da mosca-branca, que suprime a imunidade mediada por WRKY33 do hospedeiro vegetal, para aumentar a preferência e o desempenho da mosca-branca, eventualmente aumentando a transmissão de vírus21. Como os estudos sobre o papel que as proteínas salivares de insetos desempenham em hospedeiros vegetais ficaram atrás daqueles de hospedeiros animais, um sistema estável e confiável para detectar as proteínas salivares em hospedeiros vegetais é urgentemente necessário.

O vírus da planta conhecido como vírus anão do arroz (RDV) é transmitido pela cigarrinha Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) com alta eficiência e de forma persistentemente propagativa22,23. O RDV foi relatado pela primeira vez como transmitido por um inseto vetor e causa uma doença grave do arroz na Ásia24,25. O virion é icosaédrico e esférico de camada dupla, e a camada externa contém a proteína P8 do capsídeoexterno 22. O período de transmissão circulativa do RDV em N. cincticeps é de 14 dias 26,27,28,29,30. Quando o RDV chega às glândulas salivares, os virions são liberados em cavidades armazenadas nas glândulas salivares por meio de um mecanismo semelhante à exocitose23. A vitelogenina (Vg) é o precursor da proteína da gema essencial para o desenvolvimento oocitário em fêmeas de insetos31,32,33. A maioria das espécies de insetos tem pelo menos um transcrito Vg de 6-7 kb, que codifica uma proteína precursora de aproximadamente 220 kDa. Os precursores proteicos da Vg geralmente podem ser clivados em fragmentos grandes (140 a 190 kDa) e pequenos (<50 kDa) antes de entrarem no ovário18,19. Análises proteômicas prévias revelaram a presença dos peptídeos derivados da Vg na saliva secretada da cigarrinha Recilia dorsalis, embora sua função seja desconhecida (dados não publicados). Recentemente é relatado que o Vg, que é secretado por via oral a partir de cigarrinhas, funciona como um efetor para danificar as defesas das plantas34. Não se sabe se o Vg de N. cincticeps também poderia ser liberado para o hospedeiro da planta com fluxo salivar, e então poderia desempenhar um papel na planta para interferir com as defesas da planta. Para determinar se N. cincticeps explora proteínas salivares, como Vg, para inibir ou ativar as defesas da planta, o primeiro passo é identificar as proteínas liberadas para a planta durante a alimentação. O entendimento do método de identificação das proteínas salivares presentes na planta é potencialmente essencial para explicar a função das proteínas da saliva e as interações entre Hemiptera e plantas.

No protocolo aqui apresentado, N. cincticeps é usado como exemplo para fornecer um método para examinar a presença de proteínas salivares no hospedeiro vegetal introduzidas através da alimentação de insetos. O protocolo detalha principalmente a coleta e detecção de proteínas salivares e é útil para investigações adicionais na maioria dos hemípteros.

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Protocolo

As cigarrinhas adultas não virulíferas foram propagadas no Centro de Pesquisa de Vírus Transmitidos por Vetores da Universidade de Agricultura e Florestas de Fujian, China.

1. Criação de insetos não virulíferos

  1. Recuar os adultos em mudas de arroz em uma gaiola cúbica de 40 cm x 35 cm x 20 cm (comprimento x largura x altura). Mantenha um lado da gaiola coberto com uma rede à prova de insetos para ventilação.
    1. Mantenha as gaiolas com cigarrinhas em uma incubadora que contenha um controlador de umidade embutido a 26 °C com uma umidade relativa de 60-75% sob um fotoperíodo de 16 h claro e 8 h escuro.
  2. Use um aspirador para transferir suavemente todos os adultos de sua gaiola para uma nova gaiola que contenha mudas de arroz fresco a cada semana.
    1. Deixe mais de 200 adultos acasalar e colocar ovos no arroz.
    2. Retenha as mudas velhas de arroz para que as ninfas surjam. Leve essas novas ninfas não virulíferas para o estágio de 2 ínstares.

2. Aquisição de vírus e coleta de insetos virulíferos

  1. Transfira cuidadosamente as ninfas não virulíferas de 2 ínstares para um tubo de cultura de vidro (2,5 cm de diâmetro por 15 cm de altura) por 1-2 h para inanição usando o aspirador.
    1. Solte as ninfas em uma gaiola que contém uma planta de arroz infectada por RDV cultivada em um vaso.
    2. Deixe as ninfas se alimentarem da planta de arroz infectada por 2 dias.
      NOTA: Regue cuidadosamente a planta de arroz e evite lavar as ninfas. As ninfas de 2 ínstares têm aproximadamente 1,6-2 mm de comprimento.
  2. Transfira cuidadosamente essas ninfas para uma nova gaiola que contenha mudas frescas de arroz livres de vírus com umidade relativa de 60-75% sob fotoperíodo de 16 h claro e 8 h escuro. Permitir que as ninfas se alimentem da planta de arroz infectada por 12 dias para completar o período de transmissão circulativa do RDV.

3. Coleta de proteínas salivares utilizando gaiola de alimentação

  1. Prepare cinco pequenas gaiolas de alimentação semelhantes a tubos (2,5 cm de diâmetro por 4 cm de altura) nas quais uma extremidade é coberta com rede à prova de insetos.
  2. Confine 15-20 cigarrinhas em cada gaiola de alimentação e, em seguida, cubra a outra extremidade da gaiola com uma esteira de espuma fina.
    1. Fixe uma muda de arroz (5-6 cm de altura) entre a extremidade da gaiola e uma esteira de espuma com fitas. Certifique-se de que as cigarrinhas na gaiola de alimentação possam se alimentar das mudas de arroz expostas ao interior da gaiola.
  3. Mergulhe as raízes da muda em água para que a planta de arroz permaneça viva. Deixe as cigarrinhas se alimentarem delas por 2 dias.
  4. Retire as cigarrinhas de suas gaiolas de alimentação e colete as mudas de arroz nas quais elas se alimentaram. Corte as partes das mudas fora da gaiola e recupere as regiões alimentícias das mudas.
    NOTA: Esta amostra pode ser armazenada a -80 °C durante no máximo 3 meses, se não for utilizada instantaneamente para detecção.

4. Preparação dos reagentes

  1. Dissolva 15,1 g de Tris-base, 94 g de glicina e 5 g de SDS em 1 L de água estéril para preparar o tampão 5xTris-glicina. Diluir 200 ml de tampão 5xTris-glicina com 800 ml de água estéril para preparar tampão 1xTris-glicina (ver Tabela 1 para composição do tampão).
  2. Dissolver 80 g de NaCl, 30 g de Tris-base e 2 g de KCl em 1 L de água estéril para preparar tampão salino tamponada com 10xTris (TBS). Autoclave a solução a 121 °C durante 15 min.
  3. Dissolver 8 g de SDS, 4 mL de ß-mercaptoetanol, 0,02 g de azul de bromofenol e 40 mL de glicerol em 40 mL de Tris-HCl 0,1 M (pH 6,8) para preparar 4x tampão de amostra de proteína.
  4. Misturar 800 mL de tampão Tris-glicina com 200 mL de metanol para preparar o tampão de transferência.
  5. Adicionar 100 mL de solução de 10xTBS e 3 mL de Tween 20 a 900 mL de água estéril para preparar o tampão TBS com solução de Tween 20 (TBST).

5. Western blotting para detectar a saliva e proteínas virais

  1. Triture 0,1 g das amostras de arroz com nitrogênio líquido até que o tecido se torne um pó. Adicionar 200 μL de tampão de amostra de proteína 4x à amostra e fervê-la por 10 min. Centrifugar as amostras a 12.000 x g por 10 min à temperatura ambiente.
    1. Retire o sobrenadante e coloque-o num frasco novo. Carregar 10 μL da amostra em um gel SDS-PAGE e executá-lo em tampão Tris-glicina a 150 V por 45-60 min.
      OBS: O resíduo após centrifugação pode ser descartado.
  2. Coloque uma membrana de nitrocelulose de 0,45 μm e outros suprimentos de sanduíche no tampão de transferência por 30 min.
    NOTA: Esta etapa pode ser feita antes que o gel tenha concluído sua execução.
  3. Sanduíche o gel e transfira-o por 90-120 min a 100 V no buffer de transferência.
  4. Pegue a membrana e coloque-a em solução de bloqueio de leite seco a 7% sem gordura em solução de TBST por 20 min. Adicionar o anticorpo específico contra RDV P8 ou Vg a uma solução a 7% de leite em pó desnatado em TBST. Incubar com o anticorpo para colorir a membrana por 2 h ou durante a noite.
  5. Lave a membrana com solução de TBST três vezes, com 5 min de lavagem de cada vez.
  6. Adicionar a IgG anti-coelho de cabra como anticorpo secundário a 7% de leite em pó desnatado com TBST. Incubar com o anticorpo por 60-90 min à temperatura ambiente.
  7. Lave a membrana com solução de TBST três vezes por 5 min de cada vez.
  8. Use o kit ECL Western para o método quimioluminescente. Misture os reagentes de detecção 1 e 2 no kit na proporção de 1:1 em um tubo. Coloque o reagente misto na membrana e incube a mancha por 5 min.
  9. Escorra o excesso de reagente e tire uma foto colorimétrica da imagem quimioluminescente. Combine-os para ver a escada com bandas de proteínas.

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Resultados

A Figura 1 ilustra todas as etapas desse protocolo: criação de insetos, aquisição de vírus, coleta de proteínas salivares via alimentação do arroz e western blot. Os resultados de western blots mostraram que bandas específicas e esperadas de aproximadamente 220 kDa foram observadas nas amostras de arroz alimentado e glândulas salivares de insetos na membrana incubada com anticorpos contra Vg. Em contraste, nenhuma banda foi observada na amostra de arroz não alimentado. O resultado d...

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Discussão

A saliva secretada diretamente pelas glândulas salivares dos insetos perfurocortantes desempenha um papel fundamental, pois predigere e desintoxica os tecidos do hospedeiro e os fatores biológicos cruzados dos vetores nos hospedeiros 1,3,4. Os fatores biológicos entre reinos, incluindo eliciadores, efetores e pequenos RNAs, são críticos para a comunicação inseto-hospedeiro14,15,16

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31772124 e 31972239) e da Fujian Agriculture and Forestry University (Grant KSYLX014).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagents
Tris baseRocheD609K69032Para 5× Tampão de tris-glicina e 10 vezes; Preparação de tampão TBS
glicinaSigma-AldrichWXBD0677VPara 5&vezes; Preparação de tampão de tris-glicina
SDSSigma-AldrichSLCB4394Para 5&vezes; Reagente
NaClSinopharm da10019318para 10×
KClSinopharm da10016318para 10× TBS preparação de tampão
ß-mercaptoetanolXiya ReagenteB14492Para 4&vezes; preparação de tampão de amostra de
proteína azul de bromofenolSigma-AldrichSHBL3668Para 4&vezes; preparação de tampão de amostra de proteína
glicerolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10010618Para 4&vezes; preparação de tampão de amostra de proteína
metanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10014118para preparação do tampão de transferência
Tween 20Coolaber CIÊNCIA & TeCHNoLoGYCT30111220Para preparação de TBST
em pó desnatadoBecton.Dickinso e companhia252038Para bloqueio de membrana, diluição de anticorpos
cabra anti-coelho IgGSangon BiotechD110058-0001Reconhecimento do kit ocidental ECL primário
ThermoFisher Scientific32209Substrato quimioluminescente
nitrocelulose membranaPall Corporation25312915Para transferência de proteínas
Buffers and Solutions
BufferComposiçãoComentários/Descrição
  5&vezes; Tampão tris-glicina15,1 g Tris base
94 g glicina
  5 g de SDS em 1 L de água		  Solução de estoque
1 e vezes; Tampão Tris-glicina200 mL de 5× Tampão de tris-glicina
800 mL de água		Solução de trabalho, para SDS-PAGE
10&vezes; Tampão salino tamponada com Tris (TBS)80 g NaCl
30 g Tris base
2 g KCl
em 1 L de água		Solução de estoque
TBS com solução Tween 20 (TBST)100 mL 10&vezes; Solução TBS
3 mL Tween 20
900 mL de água		Solução de trabalho
4× tampão de amostra de proteína8 g SDS
4 mL de ß-mercaptoetanol
0,02 g azul de bromofenol
40 mL de glicerol
em 40 mL 0,1 M Tris-HCl (pH 6,8)		Para extração de proteínas
Tampão de transferência800 mL Tampão trisglicina
200 mL de metanol		Para transferência de
proteínasInstruments
Bromophenol blueSigma-AldrichSHBL3668Para preparação de tampão de amostra de proteína 4x
Incubadora de temperatura constanteNingbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.PRX-1200BPara criação de cigarrinhas
EletroforeseTanon Science & Tecnologia Co., Ltd.Tanon EP300Para SDS-PAGE
Módulo de núcleo de transferência eletroforéticaBIO-RAD1703935Para SDS-PAGE
glicerolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10010618Para 4x preparação de tampão de amostra de proteína
glicinaSigma-AldrichWXBD0677VPara 5x preparação de tampão de tris-glicina
cabra anti-coelho IgGSangon BiotechD110058-0001Reconhecimento do instrumento de
moagem de tecido passa-altade corpo de alta qualidade Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.JXFSIPRP-24Para moagem de tecidos vegetais
KClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10016318Para 10x TBS preparação de
tampão metanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10014118Para preparação de tampão de transferência
Mini calha de transferência de calor úmidoBIO-RAD1703930Para SDS-PAGE
NaClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019318Para 10x TBS tampão preparação
membrana de nitrocelulosePall Corporation25312915Para transferência de proteínas
em pó desnatadoBecton.Dickinso e companhia252038Para bloqueio de membrana, diluição de anticorpos
Pierce ECL Western kitThermoFisher Scientific32209Substrato quimioluminescente
Instrumento de cor de proteínaGE Biociências da saúde ABAmersham lmager 600Para detectar proteínas
SDSSigma-AldrichSLCB4394Para 5x preparação de tampão de tris-glicina
Base de trisRoche D609K69032Para 5x tampão de tris-glicina e 10&vezes; Preparação do tampão TBS
Tween 20Coolaber SCIENCE& CT30111220 de TeCHNoLoGYpara preparação de TBST
Tanque de eletroforese de placa verticalBIO-RAD1658001para SDS-PAGE Banho-maria
Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd.XMTD-8222Para ferver as amostras de proteínas
β-mercaptoetanolReagente XiyaB14492Para preparação de tampão de amostra de proteína 4x
químico Co. de preparação do tampão do Tris-glicina, Ltd Reagente químico Co. de preparação do amortecedor de TBS, Ltd leite estéril estéril estéril estéril primário leite

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