Detecção de vírus e proteínas salivares de um vetor cigarrinha no hospedeiro vegetal

Resumo

Este protocolo demonstra como utilizar o hospedeiro vegetal para detectar proteínas salivares de cigarrinhas e proteínas virais de plantas liberadas por vetores cigarrinhas.

Resumo

Insetos vetores transmitem horizontalmente muitos vírus de plantas de importância agrícola. Mais da metade dos vírus de plantas são transmitidos por insetos hemípteros que têm partes bucais sugadoras de perfuração. Durante a transmissão viral, a saliva do inseto faz a ponte vírus-vetor-hospedeiro porque os vírus vetores da saliva e as proteínas do inseto desencadeiam ou suprimem a resposta imune das plantas dos insetos para os hospedeiros das plantas. A identificação e análise funcional de proteínas salivares estão se tornando uma nova área de foco no campo de pesquisa das interações arbovírus-hospedeiro. Este protocolo fornece um sistema para detectar proteínas na saliva de cigarrinhas usando o hospedeiro da planta. O vetor cigarrinha Nephotettix cincticeps infectado com o vírus anão do arroz (RDV) serve como exemplo. A vitelogenina e a proteína P8 do capsídeo externo principal do RDV vetorado pela saliva de N. cincticeps podem ser detectadas simultaneamente na planta de arroz da qual N. cincticeps se alimenta . Este método é aplicável para testar as proteínas salivares que são temporariamente retidas no hospedeiro da planta após a alimentação do inseto. Acredita-se que este sistema de detecção beneficiará o estudo das interações hemiptera-vírus-planta ou hemiptero-planta.

Introdução

O modo de transmissão vetor-hospedeiro das arboviroses, um problema fundamental, está na fronteira das ciências biológicas. Muitos vírus de plantas de importância agrícola são transmitidos horizontalmente por insetos vetores¹. Mais da metade dos vírus de plantas são vetores por insetos hemípteros, incluindo pulgões, moscas-brancas, cigarrinhas, cigarrinhas e tripes. Esses insetos possuem características distintas que lhes permitem transmitir eficientemente vírus de plantas¹. Possuem partes bucais sugadoras de piercing e se alimentam da seiva do floema e do xilema, e secretam sua saliva 1,2,3,4.

Protocolo

As cigarrinhas adultas não virulíferas foram propagadas no Centro de Pesquisa de Vírus Transmitidos por Vetores da Universidade de Agricultura e Florestas de Fujian, China.

1. Criação de insetos não virulíferos

1. Recuar os adultos em mudas de arroz em uma gaiola cúbica de 40 cm x 35 cm x 20 cm (comprimento x largura x altura). Mantenha um lado da gaiola coberto com uma rede à prova de insetos para ventilação.
   1. Mantenha as gaiolas com cigarrinhas em uma incubadora que contenha um controlador de umidade embutido a 26 °C com uma umidade relativa de 60-75% sob um fotoperíodo de 16 h claro e 8 h escuro.
2. Use um....

Resultados

A Figura 1 ilustra todas as etapas desse protocolo: criação de insetos, aquisição de vírus, coleta de proteínas salivares via alimentação do arroz e western blot. Os resultados de western blots mostraram que bandas específicas e esperadas de aproximadamente 220 kDa foram observadas nas amostras de arroz alimentado e glândulas salivares de insetos na membrana incubada com anticorpos contra Vg. Em contraste, nenhuma banda foi observada na amostra de arroz não alimentado. O resultado d.......

Discussão

A saliva secretada diretamente pelas glândulas salivares dos insetos perfurocortantes desempenha um papel fundamental, pois predigere e desintoxica os tecidos do hospedeiro e os fatores biológicos cruzados dos vetores nos hospedeiros ^1,3,4. Os fatores biológicos entre reinos, incluindo eliciadores, efetores e pequenos RNAs, são críticos para a comunicação inseto-hospedeiro^14,15,16

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagents
Tris base	Roche	D609K69032	Para 5× Tampão de tris-glicina e 10 vezes; Preparação de tampão TBS
glicina	Sigma-Aldrich	WXBD0677V	Para 5&vezes; Preparação de tampão de tris-glicina
SDS	Sigma-Aldrich	SLCB4394	Para 5&vezes; Reagente
NaCl	Sinopharm da	10019318	para 10×
KCl	Sinopharm da	10016318	para 10× TBS preparação de tampão
ß-mercaptoetanol	Xiya Reagente	B14492	Para 4&vezes; preparação de tampão de amostra de
proteína azul de bromofenol	Sigma-Aldrich	SHBL3668	Para 4&vezes; preparação de tampão de amostra de proteína
glicerol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010618	Para 4&vezes; preparação de tampão de amostra de proteína
metanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10014118	para preparação do tampão de transferência
Tween 20	Coolaber CIÊNCIA & TeCHNoLoGY	CT30111220	Para preparação de TBST
em pó desnatado	Becton.Dickinso e companhia	252038	Para bloqueio de membrana, diluição de anticorpos
cabra anti-coelho IgG	Sangon Biotech	D110058-0001	Reconhecimento do kit ocidental ECL primário
	ThermoFisher Scientific	32209	Substrato quimioluminescente
nitrocelulose membrana	Pall Corporation	25312915	Para transferência de proteínas
Buffers and Solutions
Buffer	Composição		Comentários/Descrição
5&vezes; Tampão tris-glicina	15,1 g Tris base 94 g glicina   5 g de SDS em 1 L de água		Solução de estoque
1 e vezes; Tampão Tris-glicina	200 mL de 5× Tampão de tris-glicina 800 mL de água		Solução de trabalho, para SDS-PAGE
10&vezes; Tampão salino tamponada com Tris (TBS)	80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl em 1 L de água		Solução de estoque
TBS com solução Tween 20 (TBST)	100 mL 10&vezes; Solução TBS 3 mL Tween 20 900 mL de água		Solução de trabalho
4× tampão de amostra de proteína	8 g SDS 4 mL de ß-mercaptoetanol 0,02 g azul de bromofenol 40 mL de glicerol em 40 mL 0,1 M Tris-HCl (pH 6,8)		Para extração de proteínas
Tampão de transferência	800 mL Tampão trisglicina 200 mL de metanol		Para transferência de
proteínasInstruments
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	SHBL3668	Para preparação de tampão de amostra de proteína 4x
Incubadora de temperatura constante	Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.	PRX-1200B	Para criação de cigarrinhas
Eletroforese	Tanon Science & Tecnologia Co., Ltd.	Tanon EP300	Para SDS-PAGE
Módulo de núcleo de transferência eletroforética	BIO-RAD	1703935	Para SDS-PAGE
glicerol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010618	Para 4x preparação de tampão de amostra de proteína
glicina	Sigma-Aldrich	WXBD0677V	Para 5x preparação de tampão de tris-glicina
cabra anti-coelho IgG	Sangon Biotech	D110058-0001	Reconhecimento do instrumento de
moagem de tecido passa-alta	de corpo de alta qualidade Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.	JXFSIPRP-24	Para moagem de tecidos vegetais
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10016318	Para 10x TBS preparação de
tampão metanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10014118	Para preparação de tampão de transferência
Mini calha de transferência de calor úmido	BIO-RAD	1703930	Para SDS-PAGE
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10019318	Para 10x TBS tampão preparação
membrana de nitrocelulose	Pall Corporation	25312915	Para transferência de proteínas
em pó desnatado	Becton.Dickinso e companhia	252038	Para bloqueio de membrana, diluição de anticorpos
Pierce ECL Western kit	ThermoFisher Scientific	32209	Substrato quimioluminescente
Instrumento de cor de proteína	GE Biociências da saúde AB	Amersham lmager 600	Para detectar proteínas
SDS	Sigma-Aldrich	SLCB4394	Para 5x preparação de tampão de tris-glicina
Base de tris		Roche D609K69032	Para 5x tampão de tris-glicina e 10&vezes; Preparação do tampão TBS
Tween 20	Coolaber SCIENCE& CT30111220 de TeCHNoLoGY		para preparação de TBST
Tanque de eletroforese de placa vertical	BIO-RAD	1658001	para SDS-PAGE Banho-maria
	Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd.	XMTD-8222	Para ferver as amostras de proteínas
β-mercaptoetanol	Reagente Xiya	B14492	Para preparação de tampão de amostra de proteína 4x

químico Co. de preparação do tampão do Tris-glicina, Ltd Reagente químico Co. de preparação do amortecedor de TBS, Ltd leite estéril estéril estéril estéril primário leite