Registro de pressão intracavernosa em um modelo de rato com lesão do nervo cavernoso

Resumo

Este protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo de lesão bilateral estável do nervo cavernoso em ratos de prostatectomia radical associada à disfunção erétil e medição da pressão intracavernosa.

Resumo

O modelo de lesão bilateral do nervo cavernoso (NC) em ratos tem sido amplamente utilizado para simular lesão clínica do nervo cavernoso associada à disfunção erétil (DE) para avaliar o efeito de métodos terapêuticos clínicos. No entanto, os métodos de construção do modelo de lesão do NC são falhos e variados no campo de pesquisa do DE. É a lesão por esmagamento do NC que é o método mais comumente usado nos últimos anos. Este estudo tem como objetivo fornecer uma descrição detalhada do procedimento de construção do modelo bilateral de lesão do NC no rato e medição do registro da pressão intracavernosa (PIC), fornecendo um modelo confiável e reprodutível do rato com lesão do NC. Este trabalho desenvolveu com sucesso o método de lesão por esmagamento do hemostático usando uma agulha de seringa como suporte rígido e um hemostático com uma manga de borracha. Além disso, este método conclui que uma tensão de 1,0 V, frequência de 20 Hz e largura de pulso de 5 ms são os parâmetros de estimulação otimizados para o registro da PIC em um modelo de rato com lesão bilateral do NC.

Introdução

A disfunção erétil é uma das doenças comuns em homens adultos. Estima-se que o número de pacientes com disfunção erétil no mundo chegará a 322 milhões até 2025¹. Uma extensa pesquisa multicêntrica na China mostra que a proporção de disfunção erétil causada por cirurgia pélvica ou trauma é de cerca de 8%². Apesar do aprimoramento contínuo das técnicas cirúrgicas e dos instrumentos cirúrgicos, a incidência de disfunção erétil ainda é alta. Considerou-se que o desenvolvimento e a progressão da disfunção erétil após a prostatectomia radical (FR) poupadora de nervos contribuem para a lesão do nervo cavernoso, resultando em atrofia do músculo liso do corpo cavernoso, apoptose das células endoteliais e remodelamento patológico ^3,4.

Para estudar o mecanismo de alterações hemodinâmicas e histopatológicas da lesão do NC associada à DE, vários tipos diferentes de modelos animais de lesão do NC foram desenvolvidos e avaliados, incluindo roedores, cães, gatos e macacos ^5,6,7. Baseando-se nas vantagens em gastos e reprodutibilidade, o modelo de rato com lesão bilateral do NC tornou-se o modelo mais comum para avaliar a disfunção erétil após cirurgia pélvica radical⁸. No entanto, várias formas de lesão nervosa têm sido relatadas em numerosas literaturas, cujas principais diferenças são as abordagens de lesão nervosa (esmagamento, congelamento, transecção e excisão)^9,10,11. Além disso, a diversidade de abordagens de lesão nervosa pode levar à inconsistência nos parâmetros de registro da pressão intracavernosa (PIC) no modelo de rato, o que determina a precisão e a avaliação da PIC⁸. No entanto, ainda não existe um método padronizado para induzir lesão nervosa e registro da PIC do modelo.

Portanto, este estudo visa construir um modelo de rato com lesão bilateral do NC mais confiável e reprodutível. Este método fornece uma descrição detalhada do procedimento de construção do modelo e medição da PIC, o que pode ser benéfico para estudar os mecanismos da disfunção erétil e desenvolver tratamentos eficazes no futuro.

Protocolo

Quinze ratos Sprague-Dawley machos adultos (3 meses de idade) pesando entre 300-350 g foram utilizados neste estudo. Todos os procedimentos em animais foram realizados seguindo as Diretrizes do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e com a aprovação do quinto hospital afiliado do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Sun Yat-Sen. Os animais foram alojados em instalações confortáveis com temperatura e luz controladas.

1. Preparação para materiais de procedimentos cirúrgicos

1. Prepare os seguintes instrumentos: bisturi, tesoura de tecido, tesoura de linha, pinça de dobra, pinça de tecido, pinça de microcirurgia, pinça hemostática de mosquito Hartman, folhas cirúrgicas estéreis, porta-microagulhas, afastadores abdominais de ratos e sistema de aquisição e processamento de sinais biológicos (ver Tabela de Materiais).
   1. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos antes da operação. Use lenços umedecidos com álcool (etanol 70%) para limpar a área cirúrgica.
      NOTA: Os instrumentos cirúrgicos devem ser esterilizados por imersão em álcool durante a noite.
2. Prepare o sistema de registro de pressão
   1. Conecte uma seringa de 10 mL contendo solução salina de heparina e uma agulha hipodérmica de 25 G a uma torneira de 3 vias com um tubo (20 cm de comprimento). Lave o tubo esterilizado com solução salina de heparina estéril (200 U / mL).
      NOTA: Encher o tubo com solução salina de heparina evita a introdução de bolhas de ar no sistema.
3. Levante a agulha de 25 G 20 cm (apenas o comprimento do tubo) acima da almofada de operação do animal. Em seguida, examine a precisão da medição do sistema de registro de pressão lavando ou rosqueando.

2. Preparação do animal

1. Anestesiar ratos com injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (60 mg / kg) (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Para confirmar a profundidade suficiente da anestesia, foi realizada uma avaliação do ritmo respiratório espontâneo e dos reflexos de um rato por meio de pinçamento da pata traseira.
2. Aplique pomada nos olhos bilaterais para evitar o ressecamento da córnea.
3. Depois de confirmar uma anestesia adequada, raspe a metade inferior do abdômen, pescoço e períneo usando um barbeador elétrico. Coloque o rato em decúbito dorsal sobre uma almofada de aquecimento (37 °C). Use luvas médicas para manter as condições estéreis durante os procedimentos cirúrgicos.

3. Procedimento de isolamento NC e de lesão

1. Use um bisturi para fazer uma incisão de 4 cm através da pele na linha média inferior do abdômen. Para expor totalmente a bexiga e a próstata, use tesouras de tecido e pinças de tecido para fazer uma incisão de comprimento adequado através da fáscia subcutânea, do tecido muscular e do peritônio.
2. Use um afastador abdominal de rato para ampliar o mapa do campo operatório. Use cotonetes absorventes para separar a próstata dos tecidos adjacentes, como ligamentos.
   NOTA: O gânglio pélvico maior (MPG) e o NC podem ser encontrados em uma das duas áreas dorsolaterais da próstata.
3. Use uma microtesoura angular para incisar a fáscia sobreposta ao CN 1-6 mm distal ao MPG. Em seguida, deslize uma sutura 9-0 sob o NC com o uso de pinças de microcirurgia.
4. Coloque uma agulha de seringa (25 G) embaixo do NC, 5 mm distal ao MPG. Em seguida, coloque o hemostático à luz da estrutura sanduíche "ponta do hemostático-seringa agulha-nervo-ponta do hemostático" (Figura 1 e Figura 2).
   NOTA: A agulha da seringa precisa ser retificada.
5. Aplique o hemostático com fechamento total da ponta a 5 mm distal do gânglio por 1 min, depois retire o hemostático e a agulha da seringa (Figura 2).
6. Eleve ligeiramente o nervo por meio de uma sutura 9-0 e coloque os ganchos do eletrodo bipolar (consulte a Tabela de Materiais) ao redor do NC 2-4 mm distal ao MPG (Figura 3).
   NOTA: Dois pares de MPG e CN foram operados da mesma maneira.

4. Cateterização do corpo cavernoso e estimulação do NC para medição da PIC

1. Lave o tubo com solução salina de heparina estéril (200 U / mL) antes de introduzi-lo no corpo cavernoso.
2. Segure a agulha de 25 G e mantenha a direção do inserto paralela ao curso do corpo cavernoso (Figura 3).
   NOTA: A túnica albugínea deve ser esticada para facilitar a inserção.
3. Empurrar a agulha de 25 G 6 mm para dentro do corpo cavernoso (figura 3). Lave o tubo e pressione levemente o corpo cavernoso para avaliar a sensibilidade do transdutor (Figura 4). Para evitar quedas acidentais, fixe o tubo na mesa de trabalho com fita adesiva.
4. Use os seguintes parâmetros para estimulação CN: tensão a 1,0 V, frequência a 20 Hz, largura de pulso a 5 ms. Aplique 1 min de estimulação com 5 min de descanso entre as seguintes estimulações.
   NOTA: Gire a torneira de 3 vias para o canal do transdutor de pressão ao iniciar a medição.

5. Cuidados pós-operatórios

1. Coloque os ratos em uma almofada aquecida (37 ° C) e monitore-os cuidadosamente para a recuperação da anestesia.
2. Para o controle da dor pós-operatória, forneça anti-inflamatórios não esteróides (como carprofeno, 0,5 mg / kg, injeção subcutânea) (consulte a Tabela de Materiais) quando os ratos se recuperarem totalmente.
3. Mova os ratos para a gaiola asséptica e monitore-os por 2 dias para avaliar o estado de nutrição, estado mental e infecção da ferida incisional.

Resultados

O procedimento cirúrgico produziu uma curva de resposta típica da PIC usando este protocolo com as configurações de estimulação recomendadas. A curva de resposta da PIC aumenta instantaneamente ao estimular o nervo e diminui quando a estimulação é retirada (Figura 5). É essencial examinar a linha de pressão intracavernosa antes de medir a PIC, o que afeta a avaliação do aumento dos valores de PIC (Figura 4).

Discussão

A disfunção erétil é uma complicação grave da cirurgia pélvica ou trauma. Apesar de ser submetido a uma operação poupadora de nervos, a taxa de incidência de disfunção erétil é de aproximadamente 14-90% na prostatectomia radical (FR)¹². Devido à regeneração problemática da lesão NC, o efeito curativo clínico é menos do que satisfatório. Assim, um modelo animal estável de lesão CN para explorar tratamentos de disfunção erétil é essencial. Quinlan et al. relataram p...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agulha 25 G	BD em Biociências	367391
Retrator abdominal	Ciências da Vida RWD	R22009-01
Plataforma de operação para animais	Fornecido pelo Laboratório Chave Provincial de Imagem Biomédica de Guangdong	NA
Flexão de pinças	Ciências da Vida RWD	F12011-10
Sistema de aquisição e processamento de sinais biológicos	Techman Software	BL-420S
Eletrodo bipolar	Techman Software	AC0047
Carprofeno	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
Pinças hemostáticas de mosquito HARTMAN	Ciências da Vida RWD	F22002-10
Heparina	Tecnologia Bioquímica de Xangai Aladdin	2608411
Suporte micro para agulhas	Ciências da Vida RWD	F31047-12
Pinças de microcirurgia	Ciências da Vida RWD	F11001-11
Bisturi	Ciências da Vida RWD	S32003-12
Pentobarbital sódico	Laboratório-Chave Provincial de Imagem Biomédica de Guangdong	NA
Sprague– Rato-de-Dawley	Centro Médico de Animais de Laboratório de Guangdong	GDMLAC-035
Tesoura de fio	Ciências da Vida RWD	S15001-11
Pinças teciduais	Ciências da Vida RWD	F13019-12
Tesoura de tecido	Ciências da Vida RWD	S13029-14