Reconstrução 3D e Análise de Estruturas Neuronais Subcelulares Finas usando Dados de Microscopia Eletrônica de Varredura por Feixe de Íons Focalizados

Summary

Um pipeline metodológico flexível para identificar, visualizar e quantificar processos neuronais subcelulares finos dentro de volumes de imagens de microscopia eletrônica de varredura por feixe de íons focalizados usando pacotes de software de código aberto fáceis de usar.

Abstract

Avanços recentes nas tecnologias de microscópio eletrônico de varredura agora permitem a rápida análise tridimensional (3D) de processos subcelulares ultrafinos. Aqui, um pipeline metodológico é apresentado para identificar, visualizar e analisar processos neuronais finos, como aqueles que se projetam nos botões pré-sinápticos de outros neurônios (denominados 'espínulas'). Usando pacotes de software disponíveis gratuitamente, este protocolo demonstra como usar uma árvore de decisão para identificar estruturas subcelulares neuronais comuns usando critérios morfológicos dentro de volumes de imagem de microscopia eletrônica de varredura por feixe de íons focalizados (FIB-SEM), com atenção especial na identificação de uma diversidade de espínulos projetando-se em botões pré-sinápticos. Em particular, este protocolo descreve como rastrear espínulas dentro das sinapses neuronais para produzir reconstruções 3D dessas finas projeções subcelulares, seus neuritos parentais e parceiros pós-sinápticos. Além disso, o protocolo inclui uma lista de programas de software de código aberto disponíveis gratuitamente para analisar dados FIB-SEM e oferece dicas (por exemplo, suavização, iluminação) para melhorar as reconstruções 3D para visualização e publicação. Este protocolo adaptável oferece um ponto de entrada para a análise rápida em nanoescala de estruturas subcelulares dentro de volumes de imagem FIB-SEM.

Introduction

As investigações sobre as relações estrutura-função de componentes subcelulares nanométricos geralmente se beneficiam da visualização e análise 3D¹. No entanto, os estudos de microscopia eletrônica de transmissão de seção serial foram limitados temporal e espacialmente pela necessidade de usar uma faca de diamante para cortar e alinhar centenas a milhares de seções ultrafinas seriais de ≥40 nm. Essas restrições limitaram a capacidade de amostrar e analisar efetivamente estruturas subcelulares finas (<40 nm de diâmetro), e a necessidade de se tornar proficiente em seccionamento serial ultrafino dificultou a apli....

Protocol

1. Dados de volume de imagem e tamanho do objeto subcelular: considerações e registro

1. Obtenha um volume de imagem FIB-SEM de qualidade da área de interesse que contém os objetos subcelulares de interesse.
   NOTA: Este protocolo usa segmentos de um volume de imagem FIB-SEM do córtex visual primário do furão adolescente tardio (24,2 x 16,2 x 2,4 μm, voxels isotrópicos de 4 nm) e um volume FIB-SEM de acesso livre do hipocampo CA1 de rato adulto (10,2 x 7,7 x 5,3 μm; voxels isotrópicos de 5 nm) disponibilizados pelo laboratório Knott (https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/). É fundamental preparar blocos de tecido para ....

Results

Quantificando a porcentagem de espínulos sinápticos dentro da população de botões pré-sinápticos excitatórios no córtex visual primário do furão
Embora protrusões semelhantes a espínulas de neuritos em botões pré-sinápticos excitatórios tenham sido observadas por décadas^19,26, sua importância potencial para a função sináptica permaneceu obscura. Esses experimentos foram projetados para determinar a proporção de botões pré-sinápticos excitatóri.......

Discussion

Este pipeline de análise de volume de imagem FIB-SEM pode produzir reconstruções 3D confiáveis e medições quantitativas de estruturas subcelulares finas. Embora as técnicas semiautomatizadas atuais usando redes neurais profundas e algoritmos de segmentação possam aumentar a velocidade e a eficiência na reconstrução de estruturas celulares que possuem contraste de membrana relativamente alto em grandes volumes^{de imagem 33}, muitas estruturas subcelulares (por exempl.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fiji (ImageJ)			https://imagej.net/software/fiji/downloads
Reconstruir			https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0
Blender	Blender Foundation		https:/www.blender.org