Reconstrução 3D e Análise de Estruturas Neuronais Subcelulares Finas usando Dados de Microscopia Eletrônica de Varredura por Feixe de Íons Focalizados

Summary

Um pipeline metodológico flexível para identificar, visualizar e quantificar processos neuronais subcelulares finos dentro de volumes de imagens de microscopia eletrônica de varredura por feixe de íons focalizados usando pacotes de software de código aberto fáceis de usar.

Abstract

Avanços recentes nas tecnologias de microscópio eletrônico de varredura agora permitem a rápida análise tridimensional (3D) de processos subcelulares ultrafinos. Aqui, um pipeline metodológico é apresentado para identificar, visualizar e analisar processos neuronais finos, como aqueles que se projetam nos botões pré-sinápticos de outros neurônios (denominados 'espínulas'). Usando pacotes de software disponíveis gratuitamente, este protocolo demonstra como usar uma árvore de decisão para identificar estruturas subcelulares neuronais comuns usando critérios morfológicos dentro de volumes de imagem de microscopia eletrônica de varredura por feixe de íons focalizados (FIB-SEM), com atenção especial na identificação de uma diversidade de espínulos projetando-se em botões pré-sinápticos. Em particular, este protocolo descreve como rastrear espínulas dentro das sinapses neuronais para produzir reconstruções 3D dessas finas projeções subcelulares, seus neuritos parentais e parceiros pós-sinápticos. Além disso, o protocolo inclui uma lista de programas de software de código aberto disponíveis gratuitamente para analisar dados FIB-SEM e oferece dicas (por exemplo, suavização, iluminação) para melhorar as reconstruções 3D para visualização e publicação. Este protocolo adaptável oferece um ponto de entrada para a análise rápida em nanoescala de estruturas subcelulares dentro de volumes de imagem FIB-SEM.

Introduction

As investigações sobre as relações estrutura-função de componentes subcelulares nanométricos geralmente se beneficiam da visualização e análise 3D¹. No entanto, os estudos de microscopia eletrônica de transmissão de seção serial foram limitados temporal e espacialmente pela necessidade de usar uma faca de diamante para cortar e alinhar centenas a milhares de seções ultrafinas seriais de ≥40 nm. Essas restrições limitaram a capacidade de amostrar e analisar efetivamente estruturas subcelulares finas (<40 nm de diâmetro), e a necessidade de se tornar proficiente em seccionamento serial ultrafino dificultou a aplicação de análises estruturais 3D ^2,3. No entanto, avanços recentes na microscopia eletrônica de varredura por feixe de íons focalizado (FIB-SEM) revolucionaram a velocidade e a resolução dos volumes de imagem obtidos e agora permitem a análise quantitativa de estruturas subcelulares finas, como retícula endoplasmática lisa ^4,5, sinapses neuronais ^3,6 e vesículas sinápticas ^7,8 em escala. Além disso, o uso mais amplo de volumes de imagem FIB-SEM acelerou o desenvolvimento de repositórios de volume de imagem FIB-SEM de acesso livre⁹ e software de análise 3D (por exemplo, Espina¹⁰, IMOD¹¹, Neuromorph¹², Reconstruct¹³, TrakEM¹⁴) que expandem o alcance dessa tecnologia e agora permitem investigações sobre a estrutura e função de estruturas subcelulares finas.

Uma dessas características subcelulares em nanoescala é a 'espínula' sináptica neuronal. Os espínulos são finos (~ 0,06-0,15 μm de largura, 0,1-1 μm de comprimento), projeções semelhantes a dedos que emanam de um neurônio e são encapsuladas pelo neurite (por exemplo, botão pré-sináptico) de outro neurônio^15,16. Espínulos embutidos em processos neuronais têm sido relatados na literatura de microscopia eletrônica há quase 60 anos¹⁷, e saliências semelhantes a espínulas são uma característica conservada 18,19,20 e onipresente^21,22 das sinapses excitatórias. No entanto, apesar da difusão dos espínulos sinápticos, sua(s) função(ões) permanece(m) obscura(s) e há uma escassez de dados necessários para explicar sua abundância e conservação estrutural. Essa falta de caracterização experimental das espínulas deve-se principalmente à dificuldade em analisar quantitativamente a prevalência e o tamanho das espiínulas. Suas pequenas dimensões são mais adequadas para análises usando uma resolução z (profundidade) anteriormente inatingível (ou seja, ≤15 nm).

Aqui, um pipeline de análise FIB-SEM é apresentado para identificar, visualizar e analisar estruturas subcelulares finas (com seções transversais ≤40 nm de largura) que podem servir como um ponto de entrada para recém-chegados e especialistas em FIB-SEM. Este protocolo serve como uma cartilha para identificar estruturas subcelulares neuronais dentro de um volume de imagem 3D FIB-SEM, enfatizando como usar critérios específicos para reconhecer e classificar subtipos de espínulos e sinapses. Além disso, o protocolo demonstra como importar volumes de imagem para uma plataforma de software de análise 3D gratuita (Reconstruct), usar este software para rastrear espínulos dentro de sinapses neuronais excitatórias e produzir reconstruções 3D dessas projeções subcelulares, seus neuritos parentais e botões pré-sinápticos encapsulados. Por fim, o protocolo mostra como usar um software de rending 3D gratuito e de código aberto (Blender) para suavizar a 'pele' em reconstruções 3D para visualização e publicação potencial, detalhando as vantagens e possíveis armadilhas dessa técnica.

Protocol

1. Dados de volume de imagem e tamanho do objeto subcelular: considerações e registro

1. Obtenha um volume de imagem FIB-SEM de qualidade da área de interesse que contém os objetos subcelulares de interesse.
   NOTA: Este protocolo usa segmentos de um volume de imagem FIB-SEM do córtex visual primário do furão adolescente tardio (24,2 x 16,2 x 2,4 μm, voxels isotrópicos de 4 nm) e um volume FIB-SEM de acesso livre do hipocampo CA1 de rato adulto (10,2 x 7,7 x 5,3 μm; voxels isotrópicos de 5 nm) disponibilizados pelo laboratório Knott (https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/). É fundamental preparar blocos de tecido para FIB-SEM usando um protocolo que preserve detalhes ultraestruturais e produza alto contraste sob condições de imagem FIB-SEM^23,24. É importante ressaltar que o tecido deve ser visualizado de forma que a resolução do voxel da imagem FIB-SEM resultante seja <0,5 × o tamanho do diâmetro da menor estrutura subcelular de interesse. Por exemplo, como os locais de protrusão da espínula em botões pré-sinápticos podem ser tão pequenos quanto 30 nm de diâmetro, um tamanho de voxel de <15 nm seria apropriado para amostrar essas estruturas acima do critério de Nyquist. Além disso, é útil obter imagens de tecido em resolução isotrópica (igual em todas as dimensões) (por exemplo, voxels de 5 x 5 x 5 nm) para permitir a visualização e reconstrução de estruturas finas que têm dimensões iguais em todos os planos x/y/z.
2. Baixe e instale a distribuição Fiji do ImageJ²⁵ (https://imagej.net/software/fiji/downloads).
3. Alinhe o volume da imagem.
   NOTA: Embora os sistemas FIB-SEM modernos produzam volumes de imagem alinhados aproximadamente, o registro de imagem para imagem ainda pode sofrer com o desvio de subpixel.
   1. Em Fiji, navegue até Plugins | Registre-se e escolha Registrar fatias de pilha virtual. Consulte o Manual do Usuário para obter assistência (https://imagej.net/Register_Virtual_Stack_Slices). Comece com um registro rígido e, em seguida, use uma técnica afim, se necessário.
4. Dimensione o volume da imagem.
   1. Abra o volume da imagem alinhada em Fiji clicando em Arquivo | Importação | Sequência de imagens e navegar até a pasta com as imagens alinhadas.
   2. Na janela de diálogo, clique em Classificar nomes numericamente se as imagens forem nomeadas em ordem numérica. Clique em Usar pilha virtual para um desempenho mais rápido de Fiji.
   3. Quando a imagem estiver aberta, clique em Imagem | Propriedades e insira o tamanho físico dos pixels de volume da imagem em micrômetros nas caixas de altura, largura e profundidade de pixels. Digite um OR μm em cada uma das caixas mais à direita. Salve este volume de imagem alinhado como um arquivo .tiff clicando em Arquivo | Salvar como | Tiff.
      NOTA: Se a imagem foi dimensionada, a parte superior da imagem agora deve indicar o tamanho da imagem em micrômetros (por exemplo, 9.82 x 8.65 μm).

2. Identificação de neurite e espínulos sinápticos

1. Ao rolar pela pilha (usando as teclas de seta ou a roda do mouse), consulte a árvore de decisão de identificação de neuritos (Figura 1) e exemplos de neuritos seccionados (Figura 2) para localizar e identificar os objetos de interesse.
   1. Identifique os espínulos sinápticos como saliências ligadas à membrana de um neurite que se torna totalmente envolto em um neurite pré-sináptico ou pós-sináptico.
      NOTA: A identificação positiva da espínula sináptica requer evidência visual da membrana do objeto que projeta a espínula invaginando na membrana invertida de uma estrutura pré-sináptica ou pós-sináptica e a presença da espínula ligada à membrana totalmente encapsulada pela membrana da estrutura pré ou pós-sináptica em pelo menos uma imagem.
2. Fazendo regiões de interesse (ROIs) em Fiji
   1. Clique em uma ferramenta apropriada na barra de ferramentas Fiji (por exemplo, ferramenta oval) e, em seguida, clique e arraste a imagem para formar um ROI. Registre esse ROI no ROI Manager digitando a letra "T".
      NOTA: O ROI Manager agora deve aparecer com as coordenadas da imagem como seu nome padrão.
   2. Renomeie o ROI conforme desejado clicando no botão Renomear no ROI Manager e digitando o nome desejado na caixa de texto exibida. Renomeie as ROIs com base em critérios quantitativos (por exemplo, o^12º botão pré-sináptico que é analisado e tem duas sinapses com espinhas pós-sinápticas pode ser denominado B12_s,s).
      NOTA: Para associar cada ROI a uma "fatia" de imagem (em vez de tê-la presente em toda a pilha de imagens) e tornar os nomes de ROI visíveis em imagens únicas, clique nestas opções no ROI Manager | Saiba mais | Opções e clique nas caixas de seleção Mostrar tudo e rótulos na parte inferior do ROI Manager. Observe que essa etapa é crucial ao salvar ROIs em um volume de imagem, pois associar ROIs a todo o volume da imagem, em vez de imagens individuais, pode levar à contagem dupla de objetos dentro do volume.
   3. Para salvar todas as ROIs atualmente no gerenciador de ROI como um arquivo, primeiro clique no botão Desmarcar no ROI Manager, clique no botão Mais e role para baixo até Salvar.
      NOTA: Este arquivo de .zip salvo agora pode ser aberto em Fiji para recarregar todas essas ROIs no ROI Manager.

3. Determine a área de interesse e transfira o volume da imagem para o software de análise 3D

1. Determine se é desejável transferir todo o volume da imagem para o software de reconstrução e análise 3D ou se uma subpilha menor (consulte 3.3.2) deve ser criada para analisar um número menor de imagens e/ou região de interesse da pilha original.
2. Execute um pequeno estudo 'piloto' em uma área relativamente pequena contendo o(s) objeto(s) de interesse para estimar o tamanho do efeito e o número de objetos de interesse necessários para obter o poder desejado para comparações estatísticas. Use uma estimativa conservadora do tamanho do volume da imagem necessário para amostrar os objetos de interesse se esses objetos subcelulares estiverem distribuídos de maneira não uniforme dentro do volume da imagem.
3. Para usar uma parte do volume da imagem para análise 3D, primeiro duplique o volume da imagem clicando em Imagem | Duplicar.
   1. Para usar uma parte cortada da imagem para análise, escolha a ferramenta retângulo na barra de ferramentas de Fiji e desenhe a região de interesse desejada; Se isso não for desejado, continue para a próxima etapa.
   2. Ir para a imagem | Pilhas | Ferramentas | Faça Substack. Digite o intervalo de imagens a serem incluídas na subpilha (por exemplo, inclua imagens de 1 a 500 digitando de 1 a 500) na caixa de texto.
   3. Consulte as considerações de amostragem acima (nota após 1.1) para determinar a resolução z necessária com base no tamanho do(s) objeto(s) de interesse. Por exemplo, se o volume da imagem tiver uma profundidade de voxel de 5 nm, é possível amostrar o objeto de interesse em intervalos de 10 nm na dimensão z para que Fiji retenha todas as outras imagens na subpilha. Para fazer isso, digite o número da enésima imagem após o intervalo (por exemplo, para incluir apenas todas as outras imagens em um intervalo de 1 a 500 imagens, digite 1 a 500 a 2).
      NOTA: Cada pacote de software de análise 3D (consulte a Tabela 1) terá seus próprios requisitos de importação de arquivo. Este protocolo se concentra na importação de volumes de imagem salvos como arquivos .tiff para o software de volume de imagem, Reconstruct.

4. 3D reconstruções e análise de estruturas subcelulares finas em Reconstruct

NOTA: É altamente vantajoso usar um mouse equipado com uma roda ao usar Reconstruir. Além disso, se a maioria ou todos os traços forem realizados manualmente, usar uma caneta para desenhar contornos em um computador com tela sensível ao toque pode aumentar drasticamente a eficiência do rastreamento.

1. Baixe e instale o Reconstruct (https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) para uso em um computador que executa o Microsoft Windows em um ambiente nativo ou virtual.
2. Inicie uma nova reconstrução criando uma nova pasta para os arquivos de reconstrução, clicando em Série | Novo, e salvando essa reconstrução (arquivo .ser) com o nome do arquivo desejado na pasta que acabou de ser criada.
3. Importe o volume de imagem .tiff salvo em Reconstruir.
   1. Navegue até Série | Importação | Imagens, clique em Selecionar na janela Importar Imagens e localize o arquivo de volume da imagem. Na janela Importar Imagens , procure os arquivos de volume de imagem que aparecem como uma linha separada para cada imagem no volume.
   2. Importante: Digite o tamanho de pixel correto na caixa de texto Tamanho do pixel para corresponder ao tamanho de pixel x/y (em μm) do volume da imagem. Feito isso, clique no botão Importar na janela Importar imagens .
      NOTA: Depois que as imagens forem importadas, deve haver uma imagem no meio da janela Reconstruir e a lista Importar imagens deve estar vazia.
   3. Se houver uma imagem no meio da janela Reconstruir e a lista Importar Imagens estiver vazia, clique em Sair na janela Importar Imagens .
   4. Defina a espessura da seção (ou seja, altura do voxel ou dimensão z) clicando em Seção | Liste as seções, destacando todas as seções listadas e clicando em Modificar | Espessura no menu Lista de seções e digitando a espessura da seção (em μm) na caixa de texto (por exemplo, 0,005 para uma seção de 5 nm de espessura).
      NOTA: Lembre-se de que, se estiver trabalhando com uma subpilha de um volume de imagem original maior que inclui apenas todas as enésimas seções (consulte a etapa 3.3.3), é necessário levar em conta essas seções "ausentes" na espessura total da seção. Por exemplo, se a espessura da seção do volume da imagem original (também conhecida como altura do voxel) for de 0,005 μm e a subpilha incluir apenas cada terceira seção (por exemplo, 1-500-3), a espessura da seção dessa subpilha será de 0,015 μm (ou seja, 0,005 μm x 3 seções).
4. Faça traços dos objetos de interesse.
   1. Ir para a série | Opções | Nomes/Cores para dar um nome ao novo objeto. Escolha uma cor para o contorno e o preenchimento interno dos traços do objeto e clique em OK.
      NOTA: Reconstruct tentará conectar todos os rastreamentos com o mesmo nome de um objeto. Consulte o manual de reconstrução para convenções de nomenclatura de rastreamento (por exemplo, não inclua espaços em nomes). As cores dos traços são apenas para visualizar traços; a cor da reconstrução 3D deste objeto pode ser facilmente alterada posteriormente.
   2. Na barra de ferramentas, selecione a ferramenta Desenhar à mão livre que se parece com um lápis. Mantenha pressionado o botão esquerdo do mouse e arraste o mouse para traçar a membrana do objeto; Solte o botão esquerdo do mouse para completar automaticamente o rastreamento. Clique em Page Up / Page Down ou use a roda do mouse para avançar para a próxima seção óptica no volume da imagem e fazer traços progressivamente até que a estrutura esteja completa.
5. Rastreando espínulos sinápticos
   NOTA: Espínulos embutidos dentro de botões pré-sinápticos aparecem como estruturas transparentes ligadas à membrana, ocasionalmente com material opaco de elétrons semelhante à actina e / ou dobras semelhantes a membranas em seu interior.
   1. Avance pelo volume da imagem e localize o local da invaginação do espínulo no botão pré-sináptico, tendo o cuidado de diferenciar os espínulos dos retículos endoplasmáticos, vacúolos, endossomos, autofagossomos e outras organelas subcelulares.
      NOTA: Ao contrário das organelas ligadas à membrana, certifique-se de que os espínulos sinápticos sempre se projetem de (ou seja, membrana evertida) de uma neurite / glia e sejam recebidos por (ou seja, membrana invertida) uma estrutura pré ou pós-sináptica. Essa evidência visual de invaginação do espínulo deve ocorrer em imagens ≥2, e um espínulo totalmente encapsulado ligado à membrana deve estar presente dentro da estrutura pré ou pós-sináptica na imagem ≥1. Pequenas espínulas podem ser revestidas com clatrina. Para diferenciar eventos de invaginação de espínulos de endocitose revestida de clatrina no neurite pré ou pós-sináptico, certifique-se de que a identificação positiva de espínulos revestidos de clatrina requer confirmação visual da membrana evertida coincidente do objeto pai da espinula projetando-se na membrana inversora de uma estrutura pré ou pós-sináptica dentro da mesma imagem.
   2. Avance pelo volume da imagem para localizar o local de projeção/origem da espínula de sua neurite/glia parental; consulte a Figura 1 e a Figura 2 para ajudar a identificar essas estruturas pai.
   3. Comece o traço da espinula no local da protrusão da membrana na estrutura receptora (por exemplo, botão pré-sináptico) e continue desenhando a espínula enquanto ela aparecer como uma estrutura ligada à membrana dentro do neurite pré ou pós-sináptico encapsulado.
   4. Continue mantendo pressionado o botão esquerdo do mouse (ou continue desenhando ao longo da membrana da espínula com uma caneta se estiver usando um computador com tela sensível ao toque) enquanto traça a membrana da espínula com o ponteiro do mouse.
   5. Quando o ponto em que o rastreamento começou for alcançado, solte o botão esquerdo do mouse.
      NOTA: Soltar o botão esquerdo do mouse muito cedo completará automaticamente o rastreamento, geralmente com resultados indesejáveis. Se isso acontecer, basta pressionar delete enquanto esse rastreamento estiver destacado na Lista de Rastreamento.
   6. Repita as etapas 4.5.2 a 4.5.5 para cada seção em que a espínula aparece.
      NOTA: Lembre-se de traçar a espínula como uma estrutura encapsulada ligada à membrana dentro do botão, quando apropriado. Como o Reconstruct não permite a subtração automatizada de estruturas subcelulares encapsuladas (por exemplo, espínulas, organelas subcelulares) do volume da estrutura encapsulante, isso pode ser realizado post-hoc (por exemplo, simplesmente subtraindo o volume da espínula do volume total do botão pré-sináptico).
6. Reconstruindo objetos em 3D em Reconstruct
   1. Navegue até Série | Opções | 3D e certifique-se de que o botão de opção Traços esteja clicado.
   2. Abra a Lista de Objetos clicando em Objetos | Listar objetos.
   3. Depois que os nomes dos objetos rastreados forem carregados na janela, clique duas vezes no nome do(s) objeto(s) na Lista de objetos para visualizá-los em 3D. Aguarde até que a janela Cena 3D apareça.
   4. Certifique-se de que o início, o fim e as contagens dos rastreamentos estejam corretos na Lista de Objetos para cada objeto, de modo que a Contagem = Fim - Início. Se a Contagem ≠ Fim - Início para um objeto, um ou mais rastreamentos desse objeto podem ter sido omitidos por engano.
   5. Gire os traços 3D do(s) objeto(s) mantendo pressionado o botão esquerdo do mouse e movendo o mouse e/ou mantendo pressionado o botão direito do mouse e movendo o mouse para frente e para trás para aumentar e diminuir o zoom. Certifique-se de que os traços do objeto estejam alinhados adequadamente e que pareça haver uma transição suave entre cada traço sucessivo.
   6. Se necessário, refaça traços individuais para remover erros que levam a arestas afiadas e/ou transições entre rastreamentos.
   7. Coloque uma pele de malha tetraédrica no objeto navegando até Série | Objeto | 3D e clicando no botão de opção da superfície Boissonnat .
   8. Na janela Cena 3D , clique em Cena | Desmarque e clique duas vezes no nome do objeto desejado na Lista de objetos.
   9. Gire o(s) objeto(s) para garantir transições suaves entre os traços e redesenhe os traços, se necessário.
   10. Para alterar as cores e a transparência do objeto, clique no nome do objeto na Lista de Objetos e, em seguida, clique em Cena | Cor/transparência... no menu Lista de objetos . Clique duas vezes no nome do objeto na Lista de objetos para visualizar essa alteração na janela Cena 3D .
       NOTA: A cor, a transparência e a suavização do objeto podem ser alteradas com um maior grau de controle e especificidade usando o Blender (consulte 5.4-5.6).
7. Análise quantitativa de objetos 3D
   1. Navegue até Série | Opções | Listas e clique em todas as medidas desejadas nas seções Lista de objetos e Lista de rastreamento desta janela.
   2. Exporte as medidas do objeto abrindo a Lista de Objetos (Objeto | Listar objetos...) e, em seguida, clicando em Lista | Salve.
   3. Salve as medidas do objeto conforme exibidas na Lista de objetos como um arquivo delimitado por vírgulas (.csv).
   4. Importe o arquivo .csv para o software de análise de dados de sua escolha. Para importar para uma planilha (por exemplo, Microsoft Excel), basta clicar duas vezes no arquivo ou abrir uma nova pasta de trabalho em branco, clicar em Arquivo | Importação | CSV e siga as instruções.
   5. Para medir as distâncias entre objetos em 3D (por exemplo, para medir a distância de projeção de um espínulo sináptico dentro de um botão pré-sináptico), use a função Z-trace em Reconstruir.
   6. Primeiro, dê um novo nome ao rastreamento navegando até a série | Opções | Guia Nomes/Cores e digitando um nome para o Z-trace.
   7. Em seguida, clique na ferramenta Z-trace na barra de ferramentas.
   8. Para desenhar o traço Z da distância de projeção de uma espínula sináptica, clique no início da espínula sináptica clicando com o botão esquerdo do mouse e, em seguida, pressione os botões Page Up ou Page Down para avançar pelo volume da imagem enquanto clica em pontos sucessivos ao longo da membrana da espínula sináptica dentro de cada seção.
   9. Complete este Z-trace clicando com o botão direito do mouse.
   10. Exporte medições de Z-trace clicando em Trace | Listar rastreamentos... para abrir a Lista de Rastreamento e, em seguida, clicando em Lista | Salve para salvar as medidas da lista de rastreamento como um arquivo .csv.
8. Adicionando um cubo de escala
   1. Navegue até uma das primeiras ou últimas imagens da pilha
   2. Ir para a série | Opções | Nomes/Cores e digite um nome para o cubo de escala.
   3. Na barra de ferramentas, escolha a ferramenta Desenhar retângulo e desenhe um pequeno quadrado (tamanho sem importância) adjacente aos objetos, mas sem obscurecê-los. Ir para a série | Opções | 3D, clique na opção de botão de opção Caixa na área Gerar e especifique o tamanho do cubo de escala (em μm) digitando suas dimensões nas caixas A:, B:, C: na área Tamanho (por exemplo, digite 0,5 para A, B e C para gerar um cubo de escala de 0,5 μm/lado).
      NOTA: Antes de tentar reconstruir o cubo de escala em 3D, certifique-se de ter os objetos 3D desejados já reconstruídos na cena 3D usando a opção Traços ou superfície de Boissonnat . Lembre-se de alterar a opção Gerar de volta para a superfície de Boissonnat e os tamanhos de A, B e C de volta para -1 após reconstruir o cubo de escala (ou seja, após a etapa 4.8.5).
   4. Abra a Lista de Objetos e clique duas vezes no nome do cubo de escala; aguarde até que o cubo de escala apareça na janela de cena 3D .
   5. Para mover o cubo de escala em relação aos outros objetos, vá para a barra lateral Série | Opções | 3D e digite o número de μm desejado para mover o cubo de escala para as caixas X, Y e/ou Z . Clique em OK para fechar a janela e, em seguida, clique duas vezes no nome do cubo de escala na Lista de Objetos.
      NOTA: Alternativamente, isso pode ser feito usando o Blender (veja abaixo).

5. Importando, recolorindo, suavizando e adicionando transparência a reconstruções 3D no Blender

NOTA: Para obter assistência detalhada no uso do Blender, consulte o manual do Blender e/ou a miríade de vídeos de "como fazer" sobre como usar cada função do Blender (basta fazer uma pesquisa na web por Blender E Função Desejada). O que se segue é uma pequena cartilha sobre como recolorir, suavizar e adicionar transparência às reconstruções 3D.

1. Baixe e instale a versão mais recente do Blender, o pacote de software 3D gratuito e de código aberto (www.blender.org).
2. Em Reconstruir, salve as reconstruções 3D exibindo o(s) objeto(s) desejado(s) na janela de cena 3D e clicando em Cena | Exportar como | VRML 2.0.
3. No Blender, navegue até Arquivo | Importação | X3D Extensível 3D (.x3d/.wrl). Clique no arquivo VRML 2.0 que foi salvo em Reconstruir e, em seguida, clique no botão Importar X3D/VRML2 .
4. Recolorir as reconstruções.
   1. Na janela Coleção de cenas , no canto superior direito, clique para desmarcar/desmarcar o ícone de olho para o objeto Cubo padrão e clique nos nomes dos objetos individuais para destacar cada objeto na cena. Renomeie esses objetos conforme apropriado.
   2. Clique no nome do primeiro objeto a ser recolorido na janela Coleção de cenas .
   3. Clique no contexto circular. Material na parte inferior da faixa de ícones à direita e clique em Adicionar material. Uma lista de opções deve aparecer abaixo. Em seguida, clique na barra ao lado da opção Cor base e escolha a luminância e o matiz desejados para o objeto.
   4. Para alterar a aparência metálica, o brilho e as qualidades reflexivas do objeto, ajuste as opções Metálico, Especular, Rugosidade e Brilho para produzir o efeito desejado.
      NOTA: Para que certas opções apareçam na cena (por exemplo, transparência, brilho), pode ser necessário estar na configuração Viewport Shading: Look Dev ou Viewport Shading: Renderizado viewport. Para alterar para qualquer uma das configurações da janela de visualização, passe o mouse sobre os ícones do globo no canto superior direito e clique na configuração da janela de visualização desejada.
   5. Para alterar o ângulo de iluminação, clique no objeto Luz na janela Coleção de cenas , clique no ícone Mostrar gizmo no canto superior direito e arraste a luz ao redor da cena para obter o efeito de iluminação desejado. Altere a intensidade da luz na janela Dados do objeto que aparece abaixo da janela Coleção de cenas quando o objeto Luz é selecionado.
   6. Para girar objetos em eixos selecionados separadamente, clique nos nomes dos objetos na janela Coleção de cenas , pressione a tecla R , clique na letra do eixo de rotação (tecla x, y ou z ) e mova o mouse para produzir a rotação desejada. Para pegar e mover objetos, selecione-os na janela Coleção de cenas , pressione a tecla G e use o mouse para mover objetos pela cena.
5. Refazer a malha (ou seja, suavizar) as reconstruções.
   1. Clique no nome do objeto de interesse na janela Coleção de cenas e, em seguida, use o gimball e a roda do mouse para centralizar e ampliar o objeto.
   2. Clique no ícone de chave inglesa Context.Modifiers na faixa de ícones à direita, clique em Adicionar modificador e, em seguida, em Refazer a malha (sob o título Gerar). Use o menu suspenso para selecionar Suave, clique no botão Suavizar sombreamento e altere a profundidade e a escala do octreo para obter a suavidade desejada.
      NOTA: É útil estar na janela Viewport Shading: Wireframe (opção de ícone de globo no canto superior direito) durante a recriação da malha para visualizar os resultados diretamente. A nova malha criará malhas tetraédricas de tamanhos diferentes no objeto. Ao alisar o objeto para remover artefatos de seccionamento ou traçado, tome cuidado para manter sua forma e contornos originais. Comece em uma profundidade de octreo = 7 e uma escala = 0,95 e, em seguida, diminua esses números lentamente, se necessário. Preste atenção especial a objetos pequenos e finos, como espínulos e densidades pós-sinápticas, pois o pequeno volume desses objetos diminui a faixa de suavização que pode ser feita sem alterar sua forma original.
6. Adicione transparência aos objetos.
   NOTA: Tornar os objetos transparentes é importante quando é desejável mostrar a relação 3D de um objeto (por exemplo, espínulas, vesículas pré-sinápticas, mitocôndrias, endossomos) que residem dentro de outro objeto (por exemplo, um botão pré-sináptico).
   1. Clique no nome do objeto desejado na janela Coleção de cenas . Role até a parte inferior do Contexto. Material (ícone inferior direito na lista à direita), abra a seção Configurações e use o menu suspenso para alterar o Blend Mode para Alpha Blend. Em seguida, abra a seção Superfície , role para cima até Alfa e altere o número para um valor menor que um (1 = totalmente opaco, 0 = totalmente transparente).
7. Exporte instantâneos das reconstruções 3D.
   1. Uma vez que a coloração, suavização e iluminação ideais para as reconstruções 3D tenham sido obtidas, salve a imagem dentro da cena clicando no cabeçalho do menu Janela, e selecionando Salvar captura de tela.
   2. Nas opções Salvar captura de tela no canto inferior esquerdo, escolha o tipo de arquivo, o formato de cor e a compactação desejada.
   3. Digite o nome da nova captura de tela na caixa de texto do nome do arquivo acima e salve a captura de tela no local desejado.

Results

Quantificando a porcentagem de espínulos sinápticos dentro da população de botões pré-sinápticos excitatórios no córtex visual primário do furão
Embora protrusões semelhantes a espínulas de neuritos em botões pré-sinápticos excitatórios tenham sido observadas por décadas^19,26, sua importância potencial para a função sináptica permaneceu obscura. Esses experimentos foram projetados para determinar a proporção de botões pré-sinápticos excitatóri...

Discussion

Este pipeline de análise de volume de imagem FIB-SEM pode produzir reconstruções 3D confiáveis e medições quantitativas de estruturas subcelulares finas. Embora as técnicas semiautomatizadas atuais usando redes neurais profundas e algoritmos de segmentação possam aumentar a velocidade e a eficiência na reconstrução de estruturas celulares que possuem contraste de membrana relativamente alto em grandes volumes^{de imagem 33}, muitas estruturas subcelulares (por exempl...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fiji (ImageJ)			https://imagej.net/software/fiji/downloads
Reconstruir			https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0
Blender	Blender Foundation		https:/www.blender.org