Método DE GOTÍcula Digital PCR para quantificação da eficiência de transdução AAV em Murine Retina

Resumo

Este protocolo apresenta como quantificar a eficiência de transdução AAV na retina do mouse usando PCR de gotícula digital (dd-PCR) juntamente com produção de AAV de pequena escala, injeção intravitreal, imagem da retina e isolamento do DNA genômico da retina.

Resumo

Muitos laboratórios de biologia de células da retina agora usam rotineiramente vírus associados ao Adeno (AAVs) para edição de genes e aplicações regulatórias. A eficiência da transdução AAV é geralmente crítica, o que afeta os resultados experimentais globais. Um dos principais determinantes para a eficiência da transdução é o sorotipo ou variante do vetor AAV. Atualmente, vários sorotipos e variantes artificiais de AAV estão disponíveis com diferentes afinidades para hospedar receptores de superfície celular. Para a terapia genética da retina, isso resulta em diferentes graus de eficiência de transdução para diferentes tipos de células da retina. Além disso, a rota de injeção e a qualidade da produção de AAV também podem afetar a eficiência de transdução AAV da retina. Portanto, é essencial comparar a eficiência de diferentes variantes, lotes e metodologias. O método digital gotlet PCR (dd-PCR) quantifica os ácidos nucleicos com alta precisão e permite realizar a quantificação absoluta de um determinado alvo sem qualquer padrão ou referência. Usando dd-PCR, também é viável avaliar a eficiência de transdução de AAVs por quantificação absoluta dos números de cópia do genoma AAV dentro de uma retina injetada. Aqui, fornecemos um método simples para quantificar a taxa de transdução de AAVs em células de retina usando dd-PCR. Com pequenas modificações, essa metodologia também pode ser a base para a quantificação do número de cópia do DNA mitocondrial, bem como avaliar a eficiência da edição de base, fundamental para várias doenças da retina e aplicações de terapia genética.

Introdução

Os vírus associados ao Adeno (AAVs) são agora comumente usados para uma variedade de estudos de terapia genética da retina. Os AAVs fornecem uma maneira segura e eficiente de entrega de genes com menos imunogenicidade e menos integrações de genomas. A entrada de AAV na célula alvo ocorre através da endocitose, que requer a ligação de receptores e co-receptores na superfície celular^1,2. Portanto, a eficiência de transdução de AAVs para diferentes tipos de células depende principalmente do capsídeo e suas interações com os receptores de células hospedeiras. Os AAVs possuem sorotipos e cada sorotipo pode ter tropismos celulares/tecidos distintos e eficiências de transdução. Há também sorotipos artificiais de AAV e variantes geradas pela modificação química do vírus capsid, produção de capsídeos híbridos, inserção de peptídeos, embaralhamento capsídeo, evolução direcionada e mutagênese racional³. Mesmo pequenas alterações na sequência de aminoácidos ou estrutura capsíide podem influenciar as interações com fatores celulares hospedeiros e resultar em diferentes tropismos⁴. Além das variantes capsid, outros fatores como a rota de injeção e a variação em lote da produção de AAV podem afetar a eficiência de transdução de AAVs na retina neuronal. Portanto, são necessários métodos confiáveis para a comparação das taxas de transdução para diferentes variantes.

A maioria dos métodos para determinar a eficiência da transdução AAV depende da expressão genética dos repórteres. Estes incluem imagens fluorescentes, imunohistoquímica, mancha ocidental ou análise histoquímica do produto genético repórter^5,6,7. No entanto, devido à restrição de tamanho dos AAVs, nem sempre é viável incluir genes de repórteres para monitorar a eficiência de transdução. O uso de promotores fortes como o melhorador de CMV híbrido/frango beta-actin ou woodchuck hepatite pós-transcrição elemento regulatório (WPRE) como uma sequência estabilizadora mRNA complica ainda mais o problema de tamanho⁸. Portanto, também será benéfico definir a taxa de transdução de AAVs injetados com uma metodologia mais direta.

O PCR de gotícula digital (dd-PCR) é uma técnica poderosa para quantificar o DNA alvo a partir de quantidades minúsculas de amostras. A tecnologia dd-PCR depende do encapsulamento da mistura de dna alvo e reação PCR por gotículas de óleo. Cada reação dd-PCR contém milhares de gotículas. Cada gotícula é processada e analisada como uma reação independente do PCR⁹. A análise das gotículas permite calcular o número absoluto de cópias de moléculas de DNA alvo em qualquer amostra simplesmente usando o algoritmo Poisson. Como a eficiência de transdução dos AAVs está correlacionada com o número de cópia de genomas AAV na retina neuronal, usamos o método dd-PCR para quantificar genomas AAV.

Aqui, descrevemos uma metodologia dd-PCR para calcular a eficiência de transdução dos vetores AAV a partir do DNA genômico da retina^6,10. Primeiro, os AAVs que expressam o repórter tdTomato foram gerados usando o protocolo de pequena escala, e titered pelo método dd-PCR¹¹. Em segundo lugar, os AAVs foram injetados intravitrealmente na retina neuronal. Para demonstrar a eficiência da transdução, primeiro quantificamos a expressão tdTomato usando microscopia fluorescente e software ImageJ. Isso foi seguido pelo isolamento do DNA genômico para a quantificação de genomas AAV em retinas injetadas usando dd-PCR. A comparação dos níveis de expressão tdTomato com os genomas AAV transduzidos quantificados pelo dd-PCR mostrou que o método dd-PCR quantificou com precisão a eficiência de transdução dos vetores AAV. Nossos protocolos demonstraram uma descrição detalhada de uma metodologia baseada em dd-PCR para quantificar a eficiência de transdução AAV. Neste protocolo, também mostramos o número absoluto de genomas AAV que são transduzidos após injeções intravitais simplesmente usando o fator de diluição após o isolamento genômico do DNA e os resultados do DD-PCR. No geral, este protocolo fornece um método poderoso, que seria uma alternativa à expressão dos repórteres para quantificar a eficiência de transdução dos vetores AAV na retina.

Protocolo

Todos os protocolos experimentais foram aceitos pelo comitê de ética da Universidade de Sabanci e os experimentos foram realizados de acordo com a declaração da "Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia" para o uso de animais em pesquisas

1. Produção de AAV em pequena escala¹²

1. Cultura CÉLULAS HEK293T utilizando placas de 15 cm em 10 mL completo de DMEM/10% FBS até 70-80% de confluência.
2. Prepare a mistura de transfecção com 20 μg de plasmídeo auxiliar (pHGT1-Adeno1), 7 μg de plasmídeo capsídeo e 7 μg de vetor AAV2-CBA-tdTomato-WPRE e 136 μL de solução PEI (1 mg/mL) em 5 mL de DMEM.
3. Adicione a mistura de transfecção preparada de 5 mL em um prato de cultura celular contendo 10 mL de mídia cultural e incubar as células transfecidas por 48-60 h a 37 °C.
4. Colete a mídia em 48-60 h após a transfecção e digerir-a com DNase I em uma concentração final de 250 U/mL por 30 min a 37 °C.
5. Centrifugar a mídia digerida a 4000 x g,4 °C por 30 min e depois filtre-a com um filtro de seringa de 0,22 μm na membrana de celulose regenerada pré-molhada por 100 kDa.
6. Centrifugar a membrana de celulose regenerada a 4000 x g,4 °C por 30 min e descartar a mídia.
7. Lave e centrifule a membrana de celulose regenerada com PBS contendo F-68 plurônico de 0,001% três vezes a 4000 x g,4 °C por 30 min. Descarte o PBS em cada etapa.
8. Colete AAVs concentrados da parte superior da membrana de celulose regenerada e alíquota para usos posteriores.
9. Digerir 5 μL de AAV recém-feito com DNase I (0,2U/μl) por 15 min a 37 °C para titering. Isso é seguido por 10 min a incubação de 95 °C para tanto inativar o DNase I quanto degradar os capsídeos virais.
10. Prepare uma diluição serial de 10 vezes a partir de AAVs digeridas usando F-68 plurônicos de 0,05%. Use primers AAV2-ITR e WPRE para titulação(Tabela 1). Os títulos foram calculados multiplicando-se os resultados dd-PCR com os fatores de diluição. Os resultados foram convertidos em cópia do genoma/mL (GC/mL).
    NOTA: As concentrações de AAV para produção de AAV em pequena escala devem ser em torno de 1 x 10¹² GC/mL. Este protocolo não é aplicável para cepas AAV que não liberam AAVs eficientemente em mídias como a AAV2¹³.

2. Injeção intravitreal de AAV

1. Preparação de equipamentos
   1. Antes de começar, prepare 10 μL de microsiringe com uma agulha cega de 36 G. Enxágüe cinco vezes com 70% de EtOH, cinco vezes em ddH₂O, e finalmente cinco vezes com PBS.
   2. Carregue a quantidade apropriada de AAV no microsinge para cada injeção.
   3. Prepare a agulha cirúrgica (sutura, seda, 6/0), fita, fórceps e tesoura.
2. Injeção intravitreal
   1. Aplique 1 queda de 0,5% de tropicamida e 2,5% de cloridrato de fenilefrina (por exemplo, Mydfrin) contendo colírio antes da anestesia para dilatar pupilas.
   2. Anestesize camundongos com isoflurane 5% (1 L/min) e continue com 1,5% de isoflurane (1 L/min) durante o procedimento. Uma pequena câmara isoflurano é usada para a primeira indução.
   3. Verifique a profundidade da anestesia pela perda do reflexo de direito, o reflexo de abstinência e a resposta de pinça da cauda.
   4. Aplique 0,3% de tobramicina e 0,1% de solução oftalmómica estéril de dexametasona a cada olho antes do procedimento de injeção. A aplicação do olípero previne o ressecamento e exerce efeitos anti-inflamatórios e antibacterianos.
   5. Use o gancho cirúrgico para estabilizar a pálpebra superior. Puxe ligeiramente para trás para expor a parte dorsal do olho. Grave o gancho no banco para mantê-lo em posição.
   6. Remova a conjuntiva (menos de 1 mm²) com a tesoura de íris curvada para expor a esclera do olho sob o microscópio dissecando. Use uma seringa de insulina fresca e estéril (30 G) para perfurar a esclera.
   7. Insira a agulha da microsinga através da mesma punção usando um micromanipulador. Coloque a ponta da agulha atrás da lente no meio da xícara de olho.
   8. Injete 1 μL de AAV2/BP2 e AAV2/PHP. S vetores com concentrações de 1,63 x 10¹² GC/mL e 1,7 x 10¹² GC/mL lentamente no vítreo do olho. O controle de volume de injeção é feito manualmente. Deixe a agulha no lugar por 1 minuto e retire lentamente a agulha.
   9. Libere a pálpebra e aplique tratamento de gel tópico anti-inflamatório e antibacteriano contendo 0,3% de tofilicina e 0,1% dexametasona na púbis. Monitore e avalie os camundongos nos dias seguintes de acordo com a folha de pontuação em termos de aparência (olhos brilhantes, casaco arrumado, curvamento), comportamento (atividade, imobilização, automutilação) e peso corporal em uma escala de 0 a 3. Cada condição tem um placar de 0-3 e uma pontuação total de 3 ou mais é um critério de rescisão.
   10. Coloque os animais na gaiola após a recuperação.

3. Fluorescência e imagem de fundus

1. Coe o camundongo e dilatar a pupila colocando gotas de 0,5% de tropamida e 2,5% de cloridrato de fenilefrina em cada olho.
2. Anestesiar o animal com o procedimento acima com isoflurano. Avalie cuidadosamente a profundidade da anestesia beliscando as patas.
3. Coloque o mouse no estágio de imagem e verifique a dilatação adequada verificando através da câmera do fundus. Aplique gel tópico (0,2% carbomer 980) na superfície dos olhos para proteger os olhos de desidratação sob anestesia e usá-lo como um gel de acoplamento para imagem.
4. Manipule o estágio de imagem para alinhar com a peça do nariz do objetivo. Ajuste o estágio conforme necessário para centralizar o olho do rato. Uma vez que o olho esteja centrado, mova lentamente o objetivo até fazer contato com o olho.
5. Realize imagens de fundus e fluorescência em ambos os olhos para acompanhar a expressão tdTomato em 1 semana e 2 semanas após a injeção intravitarreal(Figura 3B)¹⁴. Pegue imagens de fundus e fluorescência em configurações idênticas para comparação da expressão do repórter.

4. Isolamento da retina

1. Eutanize os animais após a imagem de fundus e fluorescência por inalação de CO₂ para coleta de retina em 2 semanas de ponto.
2. Mude o globo ocular para a frente com a ajuda de um fórceps divisor de 13,5 cm.
3. Remova a lente junto com a sobra vítrea aplicando pressão suave com os fórceps.
4. Corte a conexão do globo ocular com o nervo óptico com fórceps curvos de precisão e aperte suavemente a retina com os mesmos fórceps curvos.
5. Transfira retinas dissecadas em um tubo de microcentrífuga.
6. Encaixe a retina congelante colocando os tubos no nitrogênio líquido.

5. Isolamento genômico do dna do tecido

1. Isole o DNA genômico com um kit de DNA genômico de tecido baseado em digestão Proteinase K comercializado.
2. Digeste retina a 55 °C, 200 x g por 30 min com Proteinase K, que já é fornecida no kit.
3. Execute a etapa de incubação RNase, lave os passos com tampão de lavagem I e II e, finalmente, a etapa de elução de acordo com o protocolo do fabricante.
4. Adicione um passo extra de giro após a última lavagem para remover o etanol residual.
5. Meça a concentração de DNA genômico e armazene amostras a -20 °C.

6. Análise de PCR digital gotícula de amostras de retina de camundongos para quantificação de genomas virais

1. Diluir DNAs genômicas de retinas injetadas em solução Plurônica F-68 de 0,05% para atingir uma concentração final de 1 ng/μL para cada amostra.
2. Realize reações separadas para WPRE e 18S usando primers específicos de destino com uma concentração final de 125 nM para cada primer.
3. Realize a geração de gotículas em uma mistura de reação PCR de 20 μL, incluindo 1 ng de DNA genômico, primers de 125 nM e supermix evagreen 2x.
4. Carregue a mistura de amostras na parte média do cartucho para geração de gotículas.
5. Após o carregamento da amostra para o cartucho, adicione 70 μL do óleo de geração de gotículas na linha inferior do cartucho.
6. Coloque a junta em cima do cartucho e coloque-a no gerador de gotículas. Certifique-se de que não há diferença entre a junta e o cartucho.
7. Leve suavemente aproximadamente 40 μL de gotículas que são geradas no topo bem. Adicione a solução de gotícula à placa de reação PCR de 96 poços semi-contornada.
8. Sele a placa PCR com selador de placa PCR usando papel alumínio.
9. Coloque a placa PCR em um ciclo térmico selado a calor de 96 poços. Use o protocolo PCR; 95 °C para 5 min, 40 ciclos de 95 °C para 30 s, 60 °C para 1 min, 4 °C para 5 min, 90 °C para 5 min e 4 °C de espera infinita. Aplique a taxa de rampa de 2 °C/s em cada ciclo para garantir que as gotículas atinjam a temperatura correta para cada etapa durante o ciclismo
10. Coloque a placa PCR no leitor de gotículas para quantificar gotículas usando o software dd-PCR. Um modelo é configurado usando configurações específicas para evagreen.
11. Analise os dados usando um gráfico de gráfico de gráfico 1D com cada amostra para intensidade de fluorescência versus número de gotícula. O valor limiar é organizado para que as gotículas acima do limiar sejam atribuídas como positivas e as abaixo como negativas. Isso é seguido pela aplicação do algoritmo Poisson para determinar a concentração inicial do DNA alvo em unidades de cópias/μL. A razão entre WPRE versus 18S é calculada para medir a eficiência da transdução AAV.

Resultados

A produção de AAV em pequena escala é um método rápido e eficiente que fornece vetores para injeções intravitais(Figura 1). A produção de AAV em pequena escala geralmente dá titers dentro da faixa de 1 x 10¹² GC/ml que é suficiente para detectar a expressão do repórter na retina (Figura 2). Titering de AAV usando dd-PCR dá resultados consistentes. Primers específicos ITR2 e WPRE são usados rotineiramente e a concentração inicial de cada molécula alvo ...

Discussão

Neste protocolo, geramos dois vetores AAV que têm diferentes proteínas capsidas e, em seguida, titered-los em conformidade. Uma das etapas mais cruciais deste protocolo é produzir quantidades suficientes de AAVs que produzirão expressão detectável de repórteres após a transdução^12,13.

A titering de AAVs também é um fator importante para ajustar as doses de AAV para injeções intravitais. Uma vez alcançados esses critérios importantes...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas ddPCR semi-contornadas de 96 poços	BioRad	12001925	ddPCR
Amicon Filter	Millipore	UFC910096	AAV
C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS		BioRad 1851197	ddPCR
C57BL / 6JRj cepa de camundongos	Janvier	C57BL / 6JRj	Camundongos
DG8 juntas	BioRad	1863009	ddPCR
DG8 Cartuchos	BioRad	1864008	ddPCR
DMEM	Lonza	BE12-604Q	AAV
DPBS	PAN	BIOTECH L 1825	AAV
Óleo de geração de gotículas eva verde	BioRad	1864006	ddPCR
Óleo leitor de gotículas	BioRad	1863004	ddPCR
FBS	PAN BIOTECH	p30-3306	AAV
Selos de folha para PX1 Selador de placas PCR	BioRad	1814040	ddPCR
Seringas de insulina	BD Medical	320933	injeção intravítrea
Isoflurano	ADEKA ILAC SANAYI VE TICARET Microinjetor		anestésico
N01AB06 MM33	Instrumentos de Precisão Mundial	82-42-101-0000	Injeção intravítrea
Micron IV	Phoenix Research Labs	Micron IV	O sistema de microscopia baseado em câmera colorida 3-CCD, captura de quadros e software pronto para uso permite que os pesquisadores obtenham imagens de retinas de camundongos.
Mydfrin (%2.5 cloridrato de fenilefrina)	Alcon	S01FB01	dilatação da pupila
Seringa Nanofil 10 μ l	injeção intravítrea	Precision Instruments	NANOFIL
RN G36, 25 mm, PST 2	Injeção	intravítrea
PEI-MAX	Polyscience	24765-1	AAV
Penicilina-estreptomicina	PAN BIOTECH	P06-07100	AAV
Plasmídeo pHGT1-Adeno1	PlasmidFactory	PF1236	AAV
Pluronic F-68	Gibco	24040032	AAV
PX1 Sistema de selagem de placas PCR	BioRad	1814000	ddPCR
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	BioRad	1864034	ddPCR
QX200 Leitor de gotículas/QX200 Gerador de gotículas	BioRad	1864001	ddPCR
SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER - COMPRIMENTO = 13,5 CM	endostall medical	EJN-160-0155	Isolamento de retina
Filtro de seringa estéril	AISIMO	ASF33PS22S	AAV
Kit de DNA genômico de tecido	EcoSpin	E1070	isolamento de gDNA
Tobradex (0,3% tobramicina / 0,1% dexametasona)	Alcon	S01CA01	anti-inflamatório / antibiótico
Tropamida (% 0,5 tropicamida)	Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS.	dilatação da	pupila
Turbonuclease	Accelagen	N0103L	AAV
Viscotears (carbômero 2 mg/g)	Colírio	lubrificante S01XA20	Bausch+Lomb