Um Método Simples Modificado para Indução de Infarto do Miocárdio em Camundongos

O infarto do miocárdio (IAM) representa uma das principais causas de morte e incapacidade no mundo1,2,3,4,5. Apesar da reperfusão oportuna, atualmente há uma falta de terapias eficazes para tratar o remodelamento cardíaco pós-IM. Correspondentemente, esforços consideráveis têm sido feitos para a exploração mecanicista e terapêutica para a IM ^6,7,8. Vale ressaltar que o estabelecimento de modelos de MI é um pré-requisito para atender a esses fins.

Vários métodos (por exemplo, tratamento com isoproterenol, criolesão, ligadura da artéria coronária, etc.) têm sido propostos para induzir modelos de IM em pequenos animais. O tratamento com isoproterenol é um método simples para indução de IM, mas não pode induzir infarto da área-alvo⁹. A criolesão leva à necrose miocárdica através da geração de cristais de gelo e ruptura da membrana celular, em vez de isquemia direta¹⁰. Por outro lado, a ligadura da artéria coronária permite o controle preciso do local de oclusão e da extensão da área de infarto e recapitula fielmente a resposta de remodelamento após o infarto^11,12. A ligadura da artéria coronária é tipicamente realizada após intubação, ventilação mecânica e toracotomia, o que é tecnicamente desafiador^13,14. Vários protocolos modificados para ligadura arterial coronariana (por exemplo, ventilação livre) foram relatados e potencializaram a indução de IM, mas faltam demonstrações visuais detalhadas^15,16,17. Essas questões representam uma barreira financeira e técnica significativa para grupos que desejam se envolver em pesquisas usando modelos de MI. Este relato apresenta uma abordagem para indução de IM em camundongos. O método atual é fácil, rápido e utiliza ferramentas e equipamentos cirúrgicos encontrados prontamente na maioria dos laboratórios.

Os experimentos envolvendo trabalho com animais são realizados com todas as aprovações necessárias do Comitê de Ética de Bem-Estar Animal de Laboratório do Hospital Renji, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine (R52021-0506). Camundongos C57BL/6J fêmeas e machos com idade entre 8-10 semanas foram usados no estudo.

1. Preparo do aparelho de anestesia simplificado (OPCIONAL)

NOTA: Esta é uma configuração pré-operatória opcional e pode ser substituída por anestesia titulável, conforme mencionado na seção 2. O comité institucional de ética em matéria de animais e o(s) veterinário(s) devem ser consultados antes de adaptarem esta disposição estabelecida nos procedimentos relativos aos animais.

1. Pegue um tubo centrífugo de 15 mL e faça um corte perpendicular ao eixo longo do tubo a cerca de 3 cm da abertura.
   NOTA: Certifique-se de que o corte é maior que a metade da circunferência circular do lúmen do tubo para que a válvula possa ser inserida com sucesso.
2. Faça furos (diâmetro, 2 mm) na parede do tubo da centrífuga entre o corte e a abertura do tubo.
3. Corte um pedaço da válvula de tamanho adequado de uma folha de plástico e insira a válvula no corte na parede do tubo.
   NOTA: A válvula pode ser usada para controlar a taxa de liberação de isoflurano alterando a profundidade da inserção.
4. Dentro de um exaustor, abra o fundo do tubo e conecte-o à fonte de oxigênio. Coloque uma bola de algodão perto da extremidade inferior do tubo, adicione a carga de 0,5 mL de isoflurano (conforme obtido, consulte Tabela de Materiais) na esfera de algodão e feche a válvula.
5. Teste a eficácia da anestesia mascarando os camundongos com tubos preparados conforme descrito acima. Monitore a frequência respiratória e a profundidade da anestesia pela resposta da pinça dos dedos.
   NOTA: Uma frequência respiratória inferior a 10 vezes/10 s sugere anestesia excessiva, e a profundidade de inserção da válvula deve ser ajustada. Para todos os procedimentos que envolvem anestesia, deve-se utilizar filtro de gás preenchido com folhas de carvão ativado (Figura 1A-i) e a cirurgia dentro de uma coifa.

2. Preparo operatório e anestesia

1. Preparar e esterilizar todos os instrumentos necessários no dia da cirurgia, incluindo um par de pinças, um hemostático de micromosquito, uma tesoura cirúrgica, dois pares de porta-agulhas, sutura cirúrgica de seda 4-0, sutura cirúrgica de seda 6-0, filtro de gás e fonte de luz (ver Tabela de Materiais) (Figura 1A).
2. Coloque uma máscara cirúrgica e luvas estéreis.
3. Aplique o creme depilatório no peito do rato e aguarde 1 min. Limpe suavemente o creme depilatório e os cabelos com gaze molhada.
4. Segure o mouse com a mão dominante após a depilação. Induzir anestesia por inalação de isoflurano vaporizado (4%) com aporte de oxigênio (1L/min) e manter isoflurano a 2-3%.
5. Confirme a anestesia adequada pela falta de resposta de pinça dos dedos.
6. Aplique creme estéril para os olhos em ambos os olhos para evitar o ressecamento da córnea.
7. Fixe os ratos em uma plataforma de cirurgia na posição supina. Aplique cotonetes de iodopovidona (ver Tabela de Materiais) no peito três vezes e cubra o tórax desinfetado com um campo estéril.

3. Indução de infarto do miocárdio

1. Troque as luvas contaminadas para garantir a esterilidade.
2. Fazer um corte cutâneo de 0,5 cm ao longo da linha que liga o xifoide e a axila após o bloqueio local com lidocaína.
3. Separe os músculos peitoral maior e peitoral menor usando pinça e um micro-mosquito hemostático para expor o quarto espaço intercostal.
4. Abra o quarto espaço intercostal usando um hemostático de micromosquito.
5. Exteriorizar o coração empurrando o coração em direção ao quarto espaço intercostal com o dedo indicador da mão esquerda.
6. Fixar o coração com a mão esquerda e ligar o ramo descendente anterior esquerdo com sutura 6-0 a 3 mm de sua origem.
7. Coloque o coração de volta na cavidade torácica rapidamente.
   NOTA: É seguro exteriorizar o coração por menos de 30 s.
8. Evacue o ar para fora da cavidade torácica pressionando suavemente a cavidade torácica manualmente.
9. Feche a camada muscular sobre as costelas com uma sutura de seda 6-0.
10. Feche a pele com uma sutura de seda 4-0.
11. Coloque os ratinhos numa almofada (37 °C) imediatamente após a operação.
12. Injetar buprenorfina (0,05-0,1mg/kg) por via subcutânea a cada 4-6 horas para reduzir a dor pós-operatória por até 72 horas.
13. Retorne os camundongos operados para gaiolas quando totalmente recuperados.
    NOTA: Os ratos serão totalmente recuperados dentro de 3-5 minutos após a cirurgia.
14. Monitore cuidadosamente os ratos e forneça comida úmida por até 7 dias.

4. Colheita dos tecidos

1. Sacrificar os camundongos em diferentes momentos após o estabelecimento do IM por deslocamento cervical.
2. Fixar os camundongos sacrificados na plataforma cirúrgica na posição supina.
3. Faça uma incisão ventral (~3-4 cm) no abdome superior. Corte as costelas de ambos os lados da cavidade torácica e remova o diafragma.
4. Perfundir o coração com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (1x PBS, 4 °C) por injeção intraventricular.
5. Recolher o coração cortando a raiz da aorta e armazenar imediatamente o coração a -80 °C.
   OBS: De acordo com a nossa experiência, é factível realizar a coloração TTC em até duas semanas após o armazenamento.
6. Corar o coração com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC).
   1. Corte o coração congelado em seções de 1 mm de espessura no gelo usando lâminas de barbear.
   2. Incubar as fatias de coração preparadas em solução TTC a 1% (dissolvida em 1x PBS) a 37 °C durante 10-15 minutos.
      NOTA: Após 15 min de incubação, descarte a solução de TTC e mergulhe as fatias de coração coradas em 1x PBS.
7. Fotografe as fatias usando uma câmera digital.

O protocolo experimental e algumas das etapas críticas são mostrados na Figura 1. O aparelho de anestesia simplificado induziu a anestesia. Como mostrado na Figura 2A, a anestesia induzida foi estável, refletida pelas frequências respiratórias regulares (variando de 90-107 ciclos/min nos camundongos testados). Após a ligadura da artéria coronária, a análise da coloração TTC indicou indução bem-sucedida de infarto do miocárdio e mudanças temporais do tamanho da cicatriz pós-IM (Figura 2B). Enquanto isso, os resultados da análise de sobrevivência mostraram mortalidade evidente dentro de 7 dias após o IM em camundongos C57BL/6J machos e fêmeas (Figura 2C,D). A ruptura ventricular (56% em camundongos machos; 40% em camundongos fêmeas) foi uma razão comum para morte pós-IAM. Além disso, a avaliação ecocardiográfica pós-IM demonstrou indução bem-sucedida de disfunção contrátil e remodelamento ventricular (Figura 2E,F).

Figura 1: Materiais e etapas críticas dos métodos modificados para indução de IM . (A) Instrumental cirúrgico e materiais necessários para este protocolo. (a) Sutura de seda 4-0. (b) sutura de seda 6-0. c) Pinças. d) Tesoura. e-f) Porta-agulhas. g) Micro-mosquito hemostático. h) Fonte luminosa. i) Filtro de gás. (B) Imagens representativas mostrando os principais passos para a indução de IM em camundongos. (a) O camundongo foi fixado após a anestesia e iodopovidona foi aplicado no sítio cirúrgico. (b) O sítio cirúrgico é coberto. (c) Corte de 0,5 cm no sítio cirúrgico após anestesia local com lidocaína. d) Costelas expostas. A seta indica as costelas. (e) Dissecação dos músculos peitoral maior e peitoral menor para exposição do quarto espaço intercostal. (f) Coração exteriorizado. (g-h) LAD ligada com fio de seda 6-0. A seta indica LAD. (i) O coração é colocado de volta na cavidade torácica. j) O ar foi evacuado da cavidade torácica. (k) A camada muscular fechada sobre as costelas com fio de seda 6-0 e a pele fechada com fio de seda 4-0. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Alterações histológicas e funcionais após ligadura da artéria coronária. (A) Frequência respiratória em camundongos anestesiados pelo aparelho de anestesia simplificado (n=10). (B ) Os resultados da coloração TTC dos cortes cardíacos (4 cortes de cada coração) foram coletados em diferentes momentos pós-IM. A área branca indicava área infartada e a vermelha revelava miocárdio viável. (C) A curva de Kaplan-Meier mostra a taxa de mortalidade pós-IAM em camundongos machos (n=20 por grupo). (D) A curva de Kaplan-Meier mostra a taxa de mortalidade pós-IAM em camundongos fêmeas (n=20 por grupo). (E) Imagens representativas da análise ecocardiográfica em diferentes momentos após o IM (sham, 3 dias, 7 dias, 21 dias e 28 dias pós-IM). (F) Análise quantitativa dos valores da fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE), fração de encurtamento do ventrículo esquerdo (FEVE), diâmetro sistólico final do ventrículo esquerdo (VEsD) e dimensão diastólica final do ventrículo esquerdo (DMd) entre os grupos indicados (n=5 por grupo). **p<0,01 ou ***p<0,001 vs. Farsa; ##p<0.01 ou ###p<0.001 vs. 3 dias após o IM. Análise de variância one-way com teste post-hoc de Tukey HSD (Honestly Significant Difference) foi realizada para análise estatística. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.