Aprimoramento do relaxamento paramagnético para detecção e caracterização de auto-associações de proteínas intrinsecamente desordenadas

Resumo

Um protocolo para a aplicação de espectroscopia de RMN de realce por relaxação paramagnética para detectar interações inter e intramoleculares fracas e transitórias em proteínas intrinsecamente desordenadas é apresentado.

Resumo

Proteínas intrinsecamente desordenadas e regiões intrinsecamente desordenadas dentro das proteínas compõem uma grande e funcionalmente significativa parte do proteoma humano. A natureza altamente flexível dessas sequências permite que elas formem interações fracas, de longo alcance e transitórias com diversos parceiros biomoleculares. Interações específicas, mas de baixa afinidade, promovem ligação promíscua e permitem que um único segmento intrinsecamente desordenado interaja com uma infinidade de locais-alvo. Devido à natureza transitória dessas interações, elas podem ser difíceis de caracterizar por métodos de biologia estrutural que dependem de proteínas para formar uma única conformação predominante. A RMN de aumento por relaxação paramagnética é uma ferramenta útil para identificar e definir a base estrutural de interações fracas e transitórias. Um protocolo detalhado para o uso de aprimoramento de relaxamento paramagnético para caracterizar os complexos de encontro pouco povoados que se formam entre proteínas intrinsecamente desordenadas e sua proteína, ácido nucleico ou outros parceiros biomoleculares é descrito.

Introdução

A desordem intrínseca (DI) descreve proteínas (IDPs) ou regiões dentro de proteínas (IDRs) que não se dobram espontaneamente em estruturas secundárias ou terciárias estáveis, mas são biologicamente ativas. Geralmente, a função das IDPs/IDRs é facilitar interações específicas, porém reversíveis, com biomoléculas em condições fisiológicas¹. Assim, IDPs e IDRs estão envolvidas em uma variedade de funções celulares, incluindo recrutamento, organização e estabilização de complexos multiproteicos, por exemplo, a montagem e atividade do spliceossomo², recrutamento e organização de componentes em locais de dano ao DNA³, organização e estabilização do recrutamento de complexos de transcrição⁴, ou do remodelador de cromatina BAF⁵. Além disso, os IDPs são encontrados em nexos de sinalização, onde sua promiscuidade para diferentes parceiros de ligação lhes permite mediar a transferência de informações através de redes de proteínas celulares⁶. Trabalhos recentes também revelaram uma propensão para regiões IDR se auto-associarem formando condensados biomoleculares através do processo de separação de fases líquido-líquido⁷. Acredita-se que muitas das funções acima mencionadas envolvendo ID também envolvam algum aspecto da formação do condensado⁸. Apesar da importância do ID para montagem de complexos biomoleculares, estabilização, andaimes e transdução de sinal, os detalhes atômicos de suas interações específicas são difíceis de identificar, uma vez que IDPs e IDRs normalmente não são passíveis de investigações estruturais usando cristalografia de raios X ou microscopia eletrônica criogênica.

A ressonância magnética nuclear (RMN) é uma técnica ideal para investigar a DI, pois não depende da presença de conjuntos estruturais rígidos ou homogêneos, mas relata o ambiente local imediato de núcleos individuais. A frequência de ressonância, ou deslocamento químico, de um núcleo em uma dada molécula é influenciada por campos magnéticos fracos induzidos pela distribuição eletrônica local, que por sua vez é dependente de comprimentos de ligação, ângulos, proximidade de outros núcleos, interações com parceiros de ligação e outros fatores⁹. Assim, cada núcleo atua como uma sonda estrutural única, sítio-específica, sensível a mudanças em seu ambiente químico local. Apesar dessas vantagens, a RMN é uma técnica de massa, e o deslocamento químico observado é a média de todos os ambientes amostrados por um determinado núcleo. Uma série de técnicas de RMN, muitas das quais são descritas neste número, foi desenvolvida para recuperar informações estruturais, dinâmicas e cinéticas sobre conformações biomoleculares de alta energia e baixa densidade populacional contidas no deslocamento químico médio^10,11. Embora transitoriamente povoados, a identificação e quantificação desses estados são importantes para determinar os detalhes dos mecanismos funcionais¹². Por exemplo, no caso de IDPs e IDRs, o conjunto conformacional pode ser enviesado para amostras preferenciais de conformações que são produtivas para a formação de complexos de encontro com parceiros de ligação fisiológicos. A detecção desses estados, bem como a identificação das interações e dinâmicas inter e intramoleculares específicas do resíduo, são importantes para determinar os mecanismos estruturais subjacentes da função proteica e da formação de complexos.

Um protocolo para o uso de RMN de realce de relaxação paramagnética (PRE) para investigar estados transitórios e pouco povoados importantes para a formação de complexos biomoleculares mediados por IDP/IDR é descrito¹³. Essa abordagem é útil para estudar as interações proteína-proteína transitórias, como as que promovem a montagem de fibrilas amiloides a partir da α-sinucleína 14,15 ou a autoassociação de USF¹⁶, bem como para caracterizar interações proteína-proteína específicas^, como entre proteínas sinalizadoras¹⁷. Um exemplo de PDI auto-associado é apresentado, onde interações inter e intramoleculares específicas resultam em estados preferencialmente compactados, bem como interações sítio-específicas que impulsionam a auto-associação.

O PRE surge da interação dipolar magnética de um núcleo a um centro paramagnético com um tensor g isotrópico, comumente fornecido na forma de um elétron não pareado em um grupo de nitróxidos ou como um átomo de metal paramagnético¹⁸ (Figura 1). Enquanto átomos com tensores g anisotrópicos também produzem um efeito PRE, a análise desses sistemas é mais difícil devido aos efeitos de confusão contribuídos pelos deslocamentos de pseudocontato (PCS) ou acoplamento dipolar residual (RDC)^13,19. A força da interação entre um núcleo e o centro paramagnético é dependente da distância <^r-6> entre os dois. Essa interação resulta em um aumento nas taxas de relaxação nuclear, o que causa um alargamento detectável da linha mesmo para interações de longo alcance (~10-35 Å), porque o momento magnético do elétron não pareado é muito forte^20,21. A detecção de estados transitórios com o PRE é possível se as duas condições seguintes forem atendidas; (1) a interação transitória está em troca rápida na escala de tempo de RMN (o deslocamento químico observado é uma média ponderada pela população dos estados de troca); e (2) a distância núcleos/centro paramagnético é menor no estado transitoriamente povoado do que no estado^maior11. O PRE transversal é indicado Γ₂ e, para fins práticos, é calculado a partir da diferença nas taxas de relaxação transversal de ¹H entre uma amostra contendo um centro paramagnético e um controle diamagnético. Para um tratamento aprofundado da teoria da PRE e dos respectivos deslocamentos de pseudocontato em regimes de troca rápida e lenta, remete-se o leitor às revisões abrangentes de Clore e colaboradores ^13,22. Aqui, considera-se apenas a situação em que ¹H N-Γ₂ está no regime de troca rápida, onde devido à dependência ^r-6 do PRE, a taxa de relaxamento observada está relacionada tanto com a distância a que o centro paramagnético se aproxima do núcleo quanto com a quantidade de tempo que ele gasta nessa conformação. Portanto, conformações transitórias que não envolvem uma abordagem próxima produzem um PRE pequeno, enquanto interações mais próximas, mesmo que de curta duração, produzirão um PRE maior.

Para IDPs, o PRE é usado para medir e diferenciar as interações que ocorrem dentro de uma única molécula (intramolecular) e entre moléculas separadas (intermolecular). Ao anexar um centro paramagnético a uma proteína de RMN visível (por exemplo, ^{marcada com 15}N) ou invisível de RMN (por exemplo, abundância natural ^{de 14}N), a fonte (inter ou intramolecular) do PRE pode ser determinada (Figura 2). A mutagênese sítio-dirigida que introduz um resíduo de cisteína é uma abordagem conveniente para anexar um centro paramagnético (spin-label) a uma proteína²³. Vários tipos de moléculas têm sido propostos para uso como spin labels, incluindo quelantes de metais (à base de EDTA) e radicais livres (à base de nitróxido)²⁴. Vários marcadores de spin de nitroóxido foram descritos e estão disponíveis com diferentes químicas reativas à cisteína, como metanetiossulfonato, maleimida e iodoacetamida^25,26 (Figura 1). A flexibilidade inerente do tag ou do linker pode ser problemática para certas análises e, nessas situações, diferentes estratégias têm sido propostas para limitar o movimento do tag, como a adição de grupos químicos volumosos ou o uso de um segundo ligante para ancorar o tag à proteína (dois locais de fixação)^{27, 28º}. Além disso, etiquetas comercialmente disponíveis podem conter proteínas diastereoméricas, mas geralmente isso não contribuirá para a PRE observada²⁹. O uso do 3-Maleimido-PROXYL ligado a uma cisteína livre via química da maleimida é descrito por ser prontamente disponível, custo-efetivo, não reversível, e o agente redutor tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) pode ser mantido na solução durante toda a reação de marcação. Como o 3-Maleimido-PROXYL possui um tensor g isotrópico, nenhum PCS ou RDCs é induzido, e as mesmas atribuições de deslocamento químico podem ser usadas tanto para as amostras paramagnéticas quanto diamagnéticas¹³.

O ¹H_{N-T 2} é medido usando uma estratégia de dois pontos de tempo (T a, T_b) que já se mostrou tão precisa quanto coletar uma série completa de evolução consistindo de 8 _a 12 pontos de tempo³⁰. O primeiro ponto de tempo (T a) é definido tão próximo de zero quanto possível, e o comprimento ótimo do segundo ponto de tempo é dependente da magnitude do maior PRE esperado para uma dada amostra e pode ser estimado _a partir de: T_b ~ 1,15/(R 2,dia + Γ 2) onde R _2,dia representa o R ₂ da amostra diamagnética¹³. Se a magnitude dos maiores PREs é desconhecida, definir T _b para ~ uma vez o ¹H T 2 da proteína é uma boa estimativa inicial e ainda mais otimizada ajustando T₂ para melhorar o sinal ao ruído. Essa estratégia de medição de dois pontos reduz significativamente o tempo experimental necessário para medir PREs e permite tempo para mais médias de sinal, particularmente porque amostras relativamente diluídas são usadas para minimizar os efeitos de contatos não específicos entre moléculas. Uma sequência de pulso baseada em HSQC é usada para medir ¹H N-T₂ e foi descrita em detalhes em outra publicação³⁰. Para melhorar a sensibilidade, os pulsos duros das transferências INEPT para frente e para trás podem ser substituídos por pulsos moldados; alternativamente, a sequência é prontamente convertida para uma leitura baseada em TROSY³¹. Uma vez que os IDPs tipicamente têm taxas de relaxamento transversal muito mais longas, resultando em larguras de linha mais estreitas (devido à desordem inerente) do que proteínas globulares de tamanho semelhante, longos tempos de aquisição na dimensão indireta podem ser usados para melhorar a resolução espectral e aliviar a limitação de dispersão de deslocamento químico inerente aos IDPs.

PRE é uma ferramenta útil para estudar interações proteína-proteína e proteína-ácido nucleico, particularmente interações que são transitórias ou pouco povoadas. Um protocolo detalhado para a preparação de uma amostra de RMN adequada para medir PREs, incluindo etapas para purificação de proteínas, marcação de spin direcionada ao local, configuração e calibração do programa de pulso, processamento e interpretação dos dados de RMN, é fornecido. Considerações experimentais importantes são observadas ao longo do tempo que podem afetar a qualidade dos dados e os resultados experimentais, incluindo a concentração da amostra, a seleção do spin-label e a remoção de componentes paramagnéticos.

Protocolo

Requisitos gerais para o protocolo: instalações de purificação de proteínas, espectrômetro UV-Vis, espectrômetro de RMN de alto campo e software operacional, software de análise pós-processamento, incluindo; NMRPipe³², Sparky 33, (ou CCPN Analysis 34, ou NMRViewJ³⁵).

1. Expressão recombinante e purificação de uma proteína para medições de PRE

1. Projetar uma construção de expressão para a proteína de interesse para que haja um único resíduo de cisteína presente. Múltiplas mutações serão necessárias para introduzir uma cisteína livre em diferentes posições na proteína de interesse³⁶.
2. Expresse e purifice uma abundância natural (¹⁴N) ou ¹⁵amostras marcadas com N da proteína de interesse usando um protocolo estabelecido³⁷.
   NOTA: Sistemas de expressão de E. coli fornecem método econômico e robusto para a expressão de proteínas recombinantes, uma vez que o enriquecimento isotópico de ¹⁵N é um requisito mínimo para espectroscopia de RMN heteronuclear biomolecular. As etapas típicas são expressão em meios mínimos, purificação cromatográfica e remoção da etiqueta de purificação de afinidade. Este protocolo pressupõe um protocolo robusto de expressão e purificação foi estabelecido que pode produzir proteína suficiente de qualidade adequada para investigações de RMN.
   1. Manter o agente redutor de 1 mM (TDT ou TCEP) em tampões em todas as etapas de purificação para evitar a reação da cisteína livre e a formação de ligações dissulfeto intermoleculares para IDPs.
      NOTA: Alguns sistemas podem ser mais tolerantes e menos propensos a condições não redutoras, dependendo das características específicas da proteína, bem como da temperatura, pH e sistema tampão escolhidos para purificação³⁸.
   2. Remova as etiquetas de afinidade usadas para purificação antes de prosseguir, pois elas podem interagir inespecificamente com a proteína de maneiras imprevisíveis ou possivelmente conter resíduos reativos de cisteína que poderiam inadvertidamente servir como um local de fixação não intencional.
   3. Preparar uma amostra de referência marcada com ¹⁵N sem mutação(ões) de cisteína misturada com uma versão solúvel do spin-label para avaliar a contribuição dos PREs de solvente.

2. Conjugação do rótulo de spin do nitroóxido 3-Maleimido-PROXYL

1. Armazenar ou trocar a proteína purificada em um tampão desgaseificado contendo 50 mM Tris pH 7 e 1 mM TCEP; o tampão também pode conter até 8 M de ureia, se necessário para ajudar a solubilidade das proteínas.
   Alternativamente, diluir rapidamente uma solução de estoque de proteína em pelo menos 10 equivalentes de volume de tampão TCEP desgaseificado 50 mM Tris pH 7 e 1 mM. Certifique-se de que a concentração de proteína antes de adicionar spin-label é de pelo menos 100 μM.
2. Adicionar 3-Maleimido proxyl de uma solução-mãe ao excesso molar de 20x da proteína de interesse. Proteger a amostra da luz e do oxigénio e incubar durante a noite à temperatura ambiente ou a 4 °C; O balanço suave ou a nutação podem melhorar a eficiência da rotulagem.
3. Preparar soluções-mãe do spin-label dissolvendo o pó de 3-Maleimido em etanol a 95%. As alíquotas do estoque podem ser armazenadas a -80 °C por menos de 6 meses.
4. Etapa crítica: Remova o rótulo de spin livre não reagido para evitar PREs de solventes não específicos. Esta etapa também introduzirá a proteína em um tampão adequado para RMN.
   NOTA: Os agentes redutores devem ser preparados frescos e a compatibilidade entre os componentes do buffer deve ser considerada; por exemplo, o TCEP degrada-se rapidamente em tampões à base de fosfato, e essa combinação deve ser evitada³⁹.
5. Trate todos os tampões usados a partir deste passo em frente com uma resina quelante seletiva para metais divalentes e de transição para remover íons paramagnéticos ou têmperas spin-label. Se a proteína não puder ser armazenada em um tampão de RMN, concentre a proteína a ser rapidamente diluída em um tampão adequado para RMN.
6. Monitoramento da eficiência da incorporação de spin-label.
   1. Utilizar o reagente de Ellman (ácido 5,5-ditio-bis-(2-nitrobenzóico) para quantificar grupos sulfidrila livres em solução⁴⁰.
      NOTA: Protocolos detalhados estão disponíveis no fabricante. Para os propósitos aqui, é importante determinar a incorporação do spin-label, a concentração de grupos sulfidrila livre é comparada com a concentração de proteína total. A porcentagem de grupos sulfidrila livres é a porcentagem de moléculas que não têm um rótulo de spin de nitroóxido anexado.
   2. Monitorar a intensidade do pico correspondente ao resíduo de cisteína marcado para julgar a incorporação spin-label na proteína de interesse.
      NOTA: Esta é uma abordagem rápida e eficaz para determinar o grau de marcação spin da proteína. A incorporação completa do spin-label resultará no desaparecimento do pico do espectro. Com a fraca dispersão característica dos PDIs, o pico correspondente ao resíduo mutante de cisteína nem sempre pode ser prontamente identificado, recomendando-se o uso do reagente de Ellman (passo 2.6.1).

3. Preparar amostra de RMN para medição intra ou intermolecular de PRE

1. Preparar amostra para medição de PRE intramolecular
   1. Preparar ¹⁵N de proteína isotopicamente enriquecida, marcada com spin para uma concentração de pelo menos 100 μM, mas não superior a 300 μM, num tampão adequado para RMN. O volume total da amostra (incluindo D₂O) é de 500 - 550 μL.
      NOTA: Os tampões de RMN comuns incluem fosfato, acetato, (bi)carbonato e TRIS. Buffers do Good, como MES, HEPES também podem ser apropriados. Tenha cuidado ao selecionar buffers para garantir que não haja reatividade cruzada com outros componentes da solução.
   2. Certifique-se de que o pH é ~7,2 ou inferior para minimizar os efeitos da troca de prótons amida com água. Mantenha a concentração de sal o mais baixa possível (normalmente inferior a 150 mM), embora a principal consideração seja manter a estabilidade da proteína.
      NOTA: Abordagens para a realização de experimentos de RMN em condições de alto teor de sal foram descritas em outra publicação⁴¹.
2. Preparar amostra para medição de PRE intermolecular
   1. Siga este passo ou passo 3.1; eles não são realizados simultaneamente. Preparar ¹⁴N de abundância natural, proteína marcada com spin no tampão de RMN escolhido.
   2. Preparar a amostra de proteínas misturando ¹⁵N de proteína não marcada com spin enriquecida isotopicamente com 1%-50% de proteína marcada com spin em abundância natural de ¹⁴N, de modo a que a concentração final seja idêntica à da amostra preparada no ponto 3.1.1. O volume total da amostra (incluindo D₂O) é de 500 - 550 μL.
   3. Otimizar empiricamente a proporção das proteínas ¹⁵N e ¹⁴N para cada proteína estudada. As proporções de 1%, 5% e 20% de ¹⁴proteínas marcadas com N-spin são bons pontos de partida.
      NOTA: Um acúmulo do PRE em função da proteína ^{adicionada 14}N-spin-marcada indica um efeito específico; o PRE observado é amostra-específico, uma vez que depende da distância e da população (como discutido acima), e, portanto, razões mais altas de ¹⁴N-spin-marcadas com proteína serão necessárias se a interação for particularmente transitória¹⁷.
3. Transfira a amostra de RMN (intra ou intermolecular) para um tubo de RMN de 5 mm apropriado para uso em ímãs de alto campo usando uma pipeta de vidro de haste longa (9") ou micropipeta. Certifique-se de que todas as amostras de RMN incluam 5%-10% de D₂O para facilitar o bloqueio de campo.
   NOTA: Tubos de RMN que utilizam plugues de polímero para reduzir o volume de amostra necessário não são recomendados para medições de PRE devido a dificuldades relacionadas ao shimming efetivo da amostra.

4. Configurar o espectrômetro de RMN e experimentar parâmetros específicos

1. Tenha extrema cautela ao trabalhar com espectrômetros de RMN supercondutores de alto campo.
   NOTA: Os perigos incluem lesões devido à aceleração súbita de objetos metálicos em direção ao ímã, interferência com dispositivos médicos implantados e asfixia devido a uma liberação repentina de gás N 2 e He₂ no caso de uma extinção do ímã. As etapas a seguir pressupõem que o leitor passou pelo treinamento necessário, está ciente desses e de outros perigos locais e recebeu aprovação do gerente da instalação para operar o espectrômetro de RMN. Na dúvida de uma etapa ou instrução, consulte o gerente da instalação ou usuário experiente para evitar possíveis danos pessoais ou danos ao espectrômetro.
2. As etapas a seguir pressupõem um espectrômetro de RMN comercial executando uma versão moderna do software de controle de aquisição. Baixe o programa de pulso e os arquivos de parâmetros e coloque-os nos diretórios apropriados.
   NOTA: Um programa de pulso e um conjunto de parâmetros adequados para uso com um espectrômetro Bruker e TopSpin (3.2 ou posterior) estão disponíveis mediante solicitação dos autores.
   1. Etapa crítica: Presume-se a familiaridade com a instalação de programas de pulso de RMN não nativos; Consulte o gerente da instalação ou um usuário experiente, se necessário.
3. Coloque a amostra no ímã, bloqueie o sinal de 2 H usando o comando Lock, sintonize e combine o canal de ¹H de acordo com os protocolos da instalação (o procedimento exato dependerá se a sonda está equipada com um módulo ^desintonia e correspondência remotas).
4. Ajuste os calços usando a sub-rotina topshim para otimizar a supressão do sinal do solvente.
5. Calibrar os pulsos ^{de 1}H e ¹⁵N 90° usando métodos padrão.
   1. Calibrar o pulso ^{de 1}H usando o programa popt (use primeiro o pulso para estimar o comprimento do pulso).
   2. Calibrar o pulso de ¹⁵N contra uma amostra padrão; Certifique-se de que esse valor foi calibrado recentemente discutindo com um diretor técnico ou usuário experiente.
   3. Alternativamente, calibre o pulso de ¹⁵N na amostra variando um dos pulsos de 90° de um experimento HMQC até que um sinal nulo seja alcançado.
   4. Determine a atenuação correta para pulsos moldados usando a sub-rotina da ferramenta de forma (stdisp).
   5. Abra o arquivo de forma de pulso apropriado clicando no ícone da pasta. Os pulsos em forma são encontrados na seção de parâmetros de pulso de ACQUPARS.
   6. Carregue o arquivo de definição de pulso e clique em Analisar forma de onda > Integrar forma. Insira o pulso rígido calibrado de 1 H 90°, o comprimento ^depulso em forma desejada e a rotação (90° ou 180°).
   7. Calcule o nível de potência do pulso moldado adicionando a mudança do nível de potência à atenuação para o pulso calibrado de 90°.
6. Registre um HSQC padrão de 1 H, ¹⁵N (hsqcetfpf3gpsi) para otimizar a largura de varredura, a frequência portadora e verificar a supressão ^deágua²⁵.
7. Ajuste a largura da varredura e o número de incrementos de dimensão indireta usando os comandos sw e td ou diretamente nas caixas de diálogo apropriadas. Normalmente, para coletar PREs, larguras espectrais são escolhidas para que o espectro não seja dobrado.

5. Configurar o experimento ¹H_{N-T 2}

1. Calibrar os pulsos em forma conforme descrito acima (4.4.5-4.5.7). Os arquivos de parâmetros de pulso moldado para o experimento PRE são Eburp2.1000 (pulso de 90°), Reburp.1000 e Iburp2.1000. Insira os comprimentos de pulso calibrados na seção de parâmetros de pulso na guia ACQUPARS .
2. Este experimento mede o ¹H N-T₂ usando a abordagem de dois pontos de atraso de tempo³⁰.
   1. Defina os atrasos de tempo editando o arquivo vdlist, o primeiro atraso (T_a) é definido como 0,01 ms.
   2. Escolha o segundo atraso, (T b) usando a relação com o PRE máximo esperado (T _b ~ 1,15/(R 2,dia + Γ 2) onde R _2,dia representa o R ₂ da amostra diamagnética¹³. Sem conhecimento prévio da magnitude da contribuição do PRE para o relaxamento observado, um bom ponto de partida é definir T _b para ~1x ¹H T₂.
   3. Em seguida, determine um valor adequado comparando os primeiros incrementos (processados com o comando efp) dos espectros T _a e T b e ajustando T_b de tal forma que o sinal decaia para entre 40% e 50% de seu valor inicial.
      NOTA: Esta abordagem otimiza o sinal espectral para ruído, uma consideração necessária para amostras que não podem ser altamente concentradas (< 50 μM). Valores adequados de T_b são dependentes da amostra, mas normalmente variam de 8 - 40 ms para uma proteína de tamanho médio.
3. Determine o número de pontos complexos a serem registrados e o número de varreduras para obter uma média de sinal suficiente. Como os IDPs têm ¹⁵N T₂ mais longos do que proteínas dobradas de tamanho comparável, tempos de aquisição mais longos na dimensão indireta podem ser usados.
   NOTA: Este valor é dependente das características específicas da proteína, mas pode ser aproximadamente estimado a partir do ¹⁵ N T₂ e otimizado pelo monitoramento do decaimento do sinal no FID. Para a dimensão direta, 1024* pontos complexos (13 ppm de largura de varredura, 112,6 ms de tempo de aquisição) são suficientes para a maioria das amostras.
4. Use o comando expt para calcular o tempo do experimento e, em seguida, inicie o experimento com o comando zg.

6. Faça uma amostra diamagnética reduzindo spin-label com ácido ascórbico

1. Dissolva o ascorbato de sódio no tampão de RMN e ajuste o pH para corresponder ao tampão de RMN original.
2. Calcular a concentração de estoque de ascorbato de sódio de modo que um excesso molar de 10x de ascorbato sobre a concentração do spin-label possa ser adicionado com a menor alteração do volume da amostra. Por exemplo, para uma amostra de proteína de 100 μM, um estoque de 100 mM de ascorbato é apropriado. A redução do spin-label exigirá a adição de 5,5 μL de solução-mãe de ácido ascórbico, o que representa apenas 1 % do volume total da amostra.
3. Adicione a quantidade necessária de ácido ascórbico ao tubo de RMN colocando uma gotícula abaixo da borda do tubo, tampar o tubo, inverter cuidadosamente o tubo para misturar e, em seguida, girar a 200-400 x g por 10-20 s em uma centrífuga de manivela manual para assentar a amostra no fundo do tubo.
4. Embrulhe o tubo de RMN em papel alumínio para proteger da luz e permitir que a reação prossiga por pelo menos 3 h.
5. Registrar ¹H_{N-T 2} na amostra diamagnética usando os mesmos parâmetros usados para a amostra paramagnética.
6. Recalibre os pulsos. No entanto, eles não deveriam ter mudado das medidas paramagnéticas; Se forem significativamente diferentes (> diferença de 0,5 μs), considere a qualidade da amostra (por exemplo, degradação, precipitação).
7. Certifique-se de que todos os parâmetros de aquisição, incluindo os atrasos de relaxamento especificados (vdlist), número de varreduras fictícias, número de varreduras coletadas, número de pontos complexos coletados, tempo de aquisição, larguras de varredura e frequências portadoras permaneçam os mesmos para as amostras diamagnéticas e paramagnéticas.

7. Espectros paramagnéticos e diamagnéticos de processo

1. Copie os dados para o computador local ou estação de trabalho que tenha o NMRPipe e o Sparky instalados e configurados. Crie uma pasta chamada proc no diretório de dados do experimento que contém o arquivo ser.
2. Copie os scripts NMRPipe fid.com, p3d.com e nmrproc.com em proc (scripts de processamento estão disponíveis mediante solicitação dos autores).
   1. Use o script fid.com para converter o formato de dados Bruker (ser) em formato NMRPipe.
   2. Use o script p3D.com para dividir os planos pseudo3D em espectros individuais.
   3. Use o script nmrproc.com para ler a saída do script fid.com, aplicar supressão de solvente, uma função de janela, acrescentar zeros aos dados brutos (preenchimento zero), aplicar correção de fase, executar uma transformação de Fourier, cortar os dados para exibição e gravar os dados processados no disco. O script produzirá um arquivo para cada atraso de relaxamento gravado (T _a e T_b).
      Observação : cada um desses scripts é personalizável para otimizar o processamento para os detalhes específicos de cada experimento. Tutoriais e conjuntos de dados de exemplo estão incluídos na distribuição NMRPipe disponível no site NMRPipe³². O NMRDraw pode ser usado para visualização espectral durante o processamento (por exemplo, definindo ângulos de fase adequados, etc.). As opções disponíveis para comandos NMRPipe podem ser visualizadas usando o comando nmrPipe -help.

8. Transfira atribuições de ressonância e extraia alturas de pico

1. Altere as informações de cabeçalho do arquivo para cada arquivo de espectro (T _a, T_b para amostras paramagnéticas e diamagnéticas) usando o comando sethdr [filename] -ndim 2.
2. Use o Sparky para extrair alturas de pico³³ seguindo as etapas 8.3-8.5. Outros pacotes de software, incluindo NMRPipe (NMRDraw)³², CCPN Analysis³⁴ e NMRViewJ³⁵ também são apropriados.
3. Leia os arquivos espectrais no Sparky. Nesta etapa o conjunto de dados consistirá de um espectro para cada espectro de ponto de tempo (T _a, T_b), tanto para as amostras paramagnéticas quanto diamagnéticas, medidas para cada posição do spin-label na proteína.
4. Use o Sparky para selecionar picos (comando: F8, clique e arraste) e transfira atribuições usando a ferramenta de lista de picos de transferência de uma lista de picos de referência.
   NOTA: Atribuições de ressonância da proteína de interesse são necessárias para a interpretação seqüencial-específica dos PREs observados³⁶.
   1. Defina contornos nos espectros paramagnético e diamagnético para o mesmo nível. Certifique-se de definir os contornos para que os espectros coletados após o atraso de tempo não excluam propositalmente picos, mas sejam altos o suficiente para que os espectros T_a não sejam excessivamente barulhentos.
5. Salve as novas listas de picos para cada espectro e inclua a intensidade de pico medida e a relação sinal/ruído calculada pelo Sparky (comando: lt para abrir peaklist, clique em opções para incluir colunas de intensidade e SNR, comando: salvar).

9. Extrair ¹H_{N-T 2} doses para cada resíduo e calcular PRE

1. Importe as listas de pico para um software de planilha ou uma linguagem de programação preferida, como Python.
   NOTA: Para cada posição spin-label na proteína, o conjunto de dados consistirá de quatro listas de picos com intensidades de pico associadas, uma de cada de T_a e T_b para ambos os experimentos paramagnéticos e diamagnéticos.
2. Calcular ¹H_N R₂ para as amostras paramagnéticas e diamagnéticas utilizando a equação:
   
   
3. Use a equação acima para determinar a taxa de relaxação para cada resíduo para as amostras paramagnéticas e diamagnéticas.
4. Determinar a taxa ^{de 1}H N-Γ₂ para cada resíduo usando a equação:
   
5. Use a relação sinal/ruído (SNR) calculada pelo Sparky para calcular a incerteza da altura do pico para cada resíduo.
6. Propagar o erro usando a equação:
   
7. Gráfico ¹H_{N-Γ 2} em função do número de resíduos utilizando um gráfico de dispersão incluindo o erro calculado no ponto 9.6.

Resultados

PREs 1 H_{N-Γ 2} ^{intramoleculares}foram registrados em um fragmento auto-associado, intrinsecamente desordenado (resíduos 171-264) derivado do domínio de baixa complexidade da proteína ligadora de RNA EWSR1⁴² (Figura 3). Espera-se que os resíduos em estreita proximidade sequencial com o ponto de fixação do rótulo de spin (por exemplo, resíduos 178 ou 260 na Figura 3) sejam significativamente ampliados...

Discussão

Um método para caracterizar interações transitórias que existem em populações baixas entre proteínas intrinsecamente desordenadas e vários parceiros de ligação usando PRE foi apresentado. No exemplo mostrado, a proteína é auto-associativa e, portanto, a PRE pode surgir de uma combinação de interações inter e intramoleculares. Este método é prontamente estendido para amostras heterogêneas onde as interações entre duas proteínas diferentes podem ser caracterizadas. Informações complementares sobre como diferentes regiões d...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,45 µ m e 0,22 µ Filtros de seringa	Millipore Sigma	SLHVM33RS SLGVR33RS	Filtre o lisado antes da primeira etapa de purificação e antes da cromatografia de exclusão de tamanho.
Placa de Petri de 100 mm	Placas de ágar FB0875713 Fisher		para transformação bacteriana.
14N Cloreto de amônio	Sigma Aldrich	576794	O uso de 15N em meio M9 produzirá uma proteína visível de RMN, 14N produzirá uma proteína invisível de RMN
15N Cloreto de amônio	Sigma Aldrich	299251	O uso de 15N em meio M9 produzirá uma proteína visível de RMN, 14N produzirá uma proteína invisível de RMN
3 L de frasco defletor de Fernbach	Corning	431523	Cultura de expressão bacteriana
3-Maleimido-Proxyl	Sigma Aldrich	253375	Rótulo de rotação de nitróxido
50 mL tubos de centrífuga cônicos	Thermo Fisher	14-432-22	Solução/proteína armazenamento
Filtro centrífugo Amicon	Millipore Sigma	UFC900308	Concentração de proteínas
Ampicillan	Sigma Aldrich	A5354	Antibiótico para um marcador seletivo, a escolha exata depende da expressão plasmídeo de construção
Balança analítica	Oahus	30061978	Explorer Pro, para pesagem de reagentes
Ácido ascórbico	Sigma Aldrich	AX1775	Reduz o rótulo de rotação de nitróxido
Autoclave			Esterilizar vidraria e meios de cultura
Cloreto de cálcio	Sigma Aldrich	C4901	Componente de mídia M9
Frascos de centrífuga	Thermo Fisher	010-1459	Colher células de E. coli após expressão de proteína recombinante
Centrífuga, manivela	Thomas Scientific	0241C68	Centrífuga manual de baixa velocidade Boekel com baldes de 15 mL que podem acomodar tubos de RMN
Chelex 100	Sigma Aldrich	C7901	Remova compostos paramagnéticos contaminantes de soluções tampão
Estação de trabalho			Linux ou Mac OS compatível com pacotes de software de processamento e análise de dados de RMN, como NMRPipe e Sparky
Óxido de deutério	Sigma Aldrich	151882	Necessário para o sinal de bloqueio de NMR
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	M9 componente de mídia
Fosfato de sódio dibásico	Sigma Aldrich	S5136	M9 componente de mídia
Reagente de Ellman (5,5-ditio-bis- (ácido 2-nitrobenzóico)	Thermo Fisher	22582	Quantificação de resíduos de cistiene livre Tubos de
centrífuga de alta velocidade	Thermo Fisher	3114-0050	Usado para limpar lisado bacteriano.
Instrumento de RMN de alto campo (600 - 800 MHz)	Bruker		Equipado com uma sonda criogênica multicanal e coluna IMAC de controle de temperatura
, HisTrap FF	Cytvia	17528601	Fracionamento inicial do lisado bacteriano bruto
Isopropil B-D-tiogalactosídeo (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758	Induz a expressão de proteínas para genes sob controle do operador lac
Ágar LB	Thermo Fisher	22700025	Os itens são usados para transformar E. coli para expressar proteína de interesse, substições para qualquer um desses itens com produtos semelhantes são aceitáveis.
Caldo LB	Thermo Fisher	12780052
Sistema de cromatografia de baixa pressão	Bio-Rad	7318300	BioRad BioLogic é usado para chomatógrafo de baixa pressão, como colunas IMAC em execução
Sulfato de magnésio	Sigma Aldrich	M7506	M9 componente de mídia
Sistema de cromatografia de média pressão	Bio-Rad	7880007	BioRad NGC equipado com um detector de vários comprimentos de onda, monitores de pH e condutividade e coletor automático de frações
Solução de vitamina MEM	Sigma Aldrich	M6895	M9 componente de mídia
Microfluidizer	Avestin	EmulsiFlex-C3	Fornece lise celular bacteriana rápida e eficiente
Micropipetas	Thermo Fisher		Conjunto calibrado de micropipetas com pontas descartáveis devidamente ajustadas (disponíveis em vários fabricantes, por exemplo, Eppendorf)
Fosfato de potássio monobásico	Sigma Aldrich	1551139	M9 componente de mídia
Pipetas de RMN	Sigma Aldrich	255688	Para remover amostra do tubo de RMN Tubo de amostra de
RMN	NewEra	NE-SL5	Adequado para espectrômetros
de RMN de alto campoCentrífuga preparativa	Beckman Coulter	Avanti J-HC	Colheita de células de E. coli após expressão de proteína recombinante
Tubos de centrífuga de poliestireno de fundo redondo	Corning	352057	Lisado bacteriano transparente
Incubadora de agitação	Eppendorf	S44I200005	Crescimento controlado por temperatura de culturas iniciais e de expressão de E. coli
Cloreto de sódio	Sigma Aldrich	S5886	Componente de mídia M9
Sonicação banho-maria e fonte de vácuo	Thomas Scientific		Usado para desgaseificar soluções tampão
Sonicator	Thermo Fisher	FB505110	Usado para lise celular bacteriana ou cisalhamento de DNA bacteriano
Espectrofotômetro	Implen	OD600 Dilufotômetro	Monitore o crescimento de culturas de expressão de proteínas E.coli
Superdex 200 16/600 tamanho exculsão colum	Cytvia	28989333	Etapa final de purificação de proteínas
Software Topspin, versão 3.2 ou posterior	Bruker		Software operacional para o instrumento de RMN
Células de E. coli competentes para transformação	Thermo Fisher	C600003	One Shot BL21 Star (DE3) E. coli quimicamente competente, outras cepas podem ser compatíveis
Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP)	ThermoFisher	20490	Agente redutor compatível com algumas conjugações sulfidril-reativas
Espectrofotômetro UV-Vis	Implen	NP80	Medir a concentração de proteínas.
Banho-maria, temperatura controlada	ThermoFisher	FSGPD25	Para a etapa de choque térmico da transformação bacteriana
Extrato de levedura	Sigma Aldrich	Y1625	Para suplementar o meio M9, se necessário