Melhorando a reprodutibilidade para atender informações mínimas para estudos de diretrizes extracelulares de vesículas 2018 em análise de rastreamento de nanopartículas

Resumo

A análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) é um método amplamente utilizado para caracterizar vesículas extracelulares. Este artigo destaca parâmetros e controles experimentais da NTA, além de um método uniforme de análise e caracterização de amostras e diluentes necessários para complementar as diretrizes propostas pelo MISEV2018 e EV-TRACK para reprodutibilidade entre laboratórios.

Resumo

A análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) tem sido um dos vários métodos de caracterização utilizados para pesquisas de vesícula extracelular (EV) desde 2006. Muitos consideram que os instrumentos NTA e seus pacotes de software podem ser facilmente utilizados após o treinamento mínimo e que a calibração de tamanho é viável internamente. Como tanto a aquisição da NTA quanto a análise de software constituem caracterização de EV, elas são abordadas em Informações Mínimas para Estudos de Vesículas Extracelulares 2018 (MISEV2018). Além disso, eles têm sido monitorados por Relatórios Transparentes e Centralização do Conhecimento em Pesquisa De Vesícula Extracelular (EV-TRACK) para melhorar a robustez dos experimentos de EV (por exemplo, minimizar a variação experimental devido a fatores descontrolados).

Apesar dos esforços para incentivar a notificação de métodos e controles, muitos artigos de pesquisa publicados não relatam as configurações críticas necessárias para reproduzir as observações originais da NTA. Poucos artigos relatam a caracterização da NTA de controles negativos ou diluentes, evidentemente assumindo que produtos disponíveis comercialmente, como soro fisiológico tamponado com fosfato ou água destilada ultrapura, são livres de partículas. Da mesma forma, controles positivos ou padrões de tamanho raramente são relatados pelos pesquisadores para verificar o dimensionamento de partículas. A equação de Stokes-Einstein incorpora variáveis de viscosidade e temperatura para determinar o deslocamento de partículas. Relatar a temperatura estável da câmara de laser durante toda a coleção de vídeo da amostra é, portanto, uma medida de controle essencial para uma replicação precisa. A filtragem de amostras ou diluentes também não é relatada rotineiramente e, se for o caso, as especificidades do filtro (fabricante, material de membrana, tamanho dos poros) e condições de armazenamento raramente são incluídas. Os padrões mínimos de detalhes experimentais aceitáveis da Sociedade Internacional para Vesícula Extracelular (ISEV) devem incluir um protocolo NTA bem documentado para a caracterização de EVs. O experimento a seguir fornece evidências de que um protocolo de análise NTA precisa ser estabelecido pelo pesquisador individual e incluído nos métodos de publicações que utilizam a caracterização do NTA como uma das opções para cumprir os requisitos MISEV2018 para caracterização de vesícula única.

Introdução

A análise precisa e repetível de EVs e outras partículas em escala de nanômetros apresenta inúmeros desafios em toda a pesquisa e indústria. A replicação da pesquisa de EV tem sido difícil, em parte, devido à falta de uniformidade na comunicação dos parâmetros necessários associados à coleta de dados. Para suprir essas deficiências, o ISEV propôs diretrizes do setor como um conjunto mínimo de padrões bioquímicos, biofísicos e funcionais para pesquisadores de EV e publicou-as como uma declaração de posição, comumente referida como MISEV2014¹. O ritmo acelerado da pesquisa de EV exigiu uma diretriz atualizada, e o "MISEV2018: uma declaração de po....

Protocolo

1. Diretrizes gerais do protocolo

1. Mantenha o microscópio em uma mesa de ar ou no mínimo em uma mesa livre de vibrações. Certifique-se de que vibrações estranhas (por exemplo, batidas no chão, tocando na mesa, fechamentos de portas, tráfego de laboratório) sejam mantidas ao mínimo.
2. Defina e mantenha a temperatura do módulo laser a uma temperatura constante para todas as gravações de vídeo.
   NOTA: A temperatura escolhida foi de 25 °C porque o analisador de tamanho de nanopartículas foi calibrado a essa temperatura. Por isso, é importante que todos os usuários do instrumento conheçam e usem a temperatura calibrada. A temperatura amb....

Resultados

A Tabela 1 contém os resultados dos vídeos NTA para as amostras de lipossomo (18 filtrados e 18 não filtrados) e um representante do DPBS diluente. As comparações entre os dois grupos foram concluídas independentemente do nível da câmera ou do limiar de detecção neste artigo. As amostras filtradas apresentaram diâmetro médio de partículas de 108,5 nm, um modo de partícula de 86,2 nm e uma concentração de 7,4 × 10⁸ partículas/mL. Em contraste, as amostras não filtradas apresentaram diâmetro méd.......

Discussão

Existem vários métodos disponíveis para estimar o tamanho e concentração das nanopartículas¹¹. Estes incluem métodos de conjunto que geram uma estimativa de tamanho de uma população, incluindo dispersão dinâmica de luz (DLS), sedimentação centrífuga e microscopia de nível de partícula única, NTA, microscopia de força atômica e sensoriamento de pulso resistivo tíclico. Destes, DLS e NTA são amplamente utilizados, tamanho não destrutivo e métodos de medição de concentração, baseados no movimento bro.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pipetter
Automáticos, Cônicos, Nunc 15 mL	Thermo Sci.	339650
Kimwipes
Lens Cleaner
Lens Paper
NanoSight LM-10	Malvern Panalytical
NanoSight LM-14 Módulo de Laser	Malvern Panalytical
Nanosight NTA Software Ver. 3.2	Malvern Panalytical
Pontas de Pipeta para Toalhas
de Papel, 1-200 µ L, Filtrado, Estéril, Baixo Binding	BioExpress	P -3243-200X
Pontas de Pipeta, 50-1,000 µ L, Filtrado, Estéril	BioExpress	P-3243-1250
Salina, Tamponado com Fosfato de Dulbecco (Sem Ca ou Mg)	Padrões Gibco	14190-144
, Transferência de Látex- 100 nm (3 mL)	Padrões Malvern	NTA4088
, Transferência de Látex- 50 nm  (3 ml)	de		Malvern
, 33 mm, .22 µ m, MCE, Estéril	Marca Fisher	09-720-004
Seringa, TB, 1 mL, ponta deslizante	Becton Dickinson	309659
Recipiente

Tubos de Centrífuga Filtro Seringa NTA4087 para fluido residual