Aqui descrevemos e demonstramos um protocolo para o isolamento da célula endotelial do fígado do camundongo primário (LSEC). O protocolo é baseado na perfusão da colagem hepática, purificação celular não parenquimal por centrifugação de baixa velocidade e seleção de contas magnéticas CD146. Também fenótipo e caracterizamos esses LSECs isolados usando citometria de fluxo e microscopia eletrônica de varredura.
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Artigo de método
Isolamento e Caracterização de Células Endoteliais Hemorlicais do Fígado Primário do Rato
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células endoteliais sinusoidais hepáticas (LSECs) são células endoteliais especializadas localizadas na interface entre a circulação e o parênquim hepático. Os LSECs têm uma morfologia distinta caracterizada pela presença de fenestrae e pela ausência de membrana do porão. Os LSECs desempenham papéis essenciais em muitas doenças patológicas no fígado, incluindo desregulação metabólica, inflamação, fibrose, angiogênese e carcinogênese. No entanto, pouco foi publicado sobre o isolamento e caracterização dos LSECs. Aqui, este protocolo discute o isolamento do LSEC de camundongos saudáveis e não alcoólicos da doença hepática gordurosa (NAFLD). O protocolo é baseado na perfusão de colagenase do fígado do rato e contas magnéticas seleção positiva de células nãoparambiais para purificar LSECs. Este estudo caracteriza os LSECs usando marcadores específicos por citometria de fluxo e identifica as características fenotípicas características através da microscopia eletrônica de varredura. Os LSECs isolados seguindo este protocolo podem ser usados para estudos funcionais, incluindo ensaios de adesão e permeabilidade, bem como estudos a jusante para um determinado caminho de interesse. Além disso, esses LSECs podem ser agrupados ou usados individualmente, permitindo a geração de dados multi-omics, incluindo RNA-seq em massa ou célula única, proteômica ou fosfo-proteômica, e Ensaio para Chromatina Acessível transposase usando sequenciamento (ATAC-seq), entre outros. Este protocolo será útil para os pesquisadores que estudam a comunicação dos LSECs com outras células hepáticas em saúde e doenças e permitirá uma compreensão aprofundada do papel dos LSECs nos mecanismos patogênicos de lesões hepáticas agudas e crônicas.
Introdução
As células endoteliais sinusoidais hepáticos (LSECs) alinham as paredes sinusoides hepáticas e são as células não parambiais mais abundantes no fígado1. Os LSECs distinguem-se de outras células endoteliais capilares em outros lugares do corpo pela presença de fenestrae e pela falta de uma membrana clássica do porão ou um diafragma 2,3. Assim, os LSECs possuem características fenotípicas e estruturais distintas que aumentam sua permeabilidade e capacidade endócítica para eliminar uma variedade de macromoléculas circulantes, incluindo lipídios e lipoproteínas. Os LSECs desempenham um pape....
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Protocolo
Os protocolos animais foram conduzidos conforme aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Clínica Mayo. Camundongos machos C57BL/6J de oito semanas foram comprados do Laboratório Jackson. Os ratos estavam alojados em uma instalação de ciclo claro-escuro de 12:12 h controlada pela temperatura com livre acesso à dieta.
1. Preparação de prato ou prato de cultura revestido de colágeno
- Para fazer 50 mL de ácido acético mol/L de 0,02, adicione 0,6 mL de ácido acético glacial a 49,4 mL de H2O.
- Faça 50 μg/mL de colágeno tipo I em ácido acético mol/L de 0,02. A diluição....
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Resultados
Esquemas experimentais e equipamentos configurados:
Neste protocolo, o fígado de rato foi digerido usando um circuito de perfusão fechado, então células não parêquias e hepatócitos foram separados por centrifugação de baixa velocidade a 50 x g por 2 min. Os LSECs primários foram isolados usando a seleção de contas magnéticas CD146 da fração não equiquial. Os esquemas experimentais são mostrados na Figura 1A. A cânula foi colocada através do PV enquanto a veia cav.......
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Discussão
No manuscrito atual, descrevemos um protocolo para o isolamento do LSEC do fígado de rato consistindo de perfusão de colagem de duas etapas e posterior classificação celular ativada por magnético (MACS). Este protocolo consiste nas seguintes três etapas: (1) Perfusão através do PV com um buffer livre de cálcio seguido de um tampão contendo colagem para alcançar a dispersão das células hepáticas; (2) Exclusão de hepatócitos com centrifugação de baixa velocidade; e (3) seleção positiva baseada em MACS de LSECs de células n.......
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Divulgações
Todos os autores não têm conflitos para revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais do NIH (1RO1DK122948 a SHI) e pelo mecanismo de concessão do NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Core Centers P30 (DK084567). O apoio também foi prestado à KF pela Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Overseas Research Fellowships. Também gostaríamos de reconhecer o Dr. Gregory J. Gores e Steven Bronk por seu projeto original e otimização do aparelho de perfusão de colagenase.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cateter intravenoso (IV) de 2,0 polegadas 20 G | Terumo, SOmerset, NJ, EUA | SR-OX2051CA | |
| 2– Bandeja de 3 polegadas com um furo no centro | personalizado; feito em casa | ||
| 405/520 corante de viabilidade | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemanha | 130-110-205 | |
| Pinça de curativo curva regular de 4 polegadas | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
| 5-0 Perma-Hand sutura de seda | Ethicon, Raritan, NJ, EUA | A182H | |
| Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
| BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemanha | 130-091-376 | |
| Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-rato | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemanha | 130-118-407 | |
| CD146 (LSEC) MicroBeads, rato | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemanha | 130-092-007 | |
| Anti-CD45-Viogreen, anti-rato | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemanha | 130-110-803 | |
| Colágeno tipo I | Corning, Corning, NY, EUA | 354236 | |
| Colagenase II | Gibco, Waltham, MA, EUA | 17101-015 | |
| Meio de crescimento de células endoteliais | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, EUA | 211-500 | |
| Reagente bloqueador FcR, camundongo | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemanha | 130-092-575 | |
| Software FlowJo, versão 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
| Tesoura fina endurecida | F.S.T, Foster city, CA, EUA | 14091-11 | |
| Aquecida (37 ° C) e aparelho de perfusão de recirculação umidificado equipado com injeção de oxigênio a uma taxa de 10psi. | personalizado; feito em casa | ||
| Hitachi S 4700 microscópio eletrônico de varredura | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, EUA | SEM096 | |
| LS colunas | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemanha | 130-042-401 | |
| Filtros de pré-separação MACS (70 μ m) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemanha | 130-095-823 | |
| Tampão de enxágue MACS | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemanha | 130-091-222 | |
| Filtro Inteligente MACS (70 μ m) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemanha | 130-098-462 | |
| Citômetro de fluxo MACSQunt | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemanha | ||
| Inserção de cultura de células Millicell | Millipore Sigma, Burlington, MA, EUA | PITP01250 | |
| Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, EUA | Celômetro Auto T4 Plus | |
| Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
| Tesoura cirúrgica | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
| Pinça de curativo curva muito pequena | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |
Referências
- Morin, O., Goulet, F., Normand, C. Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes. Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).
- Ibrahim, S. H.
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Reimpressões e permissões
