Determinando o gasto energético basal e a capacidade de adipócitos termogênicos para gastar energia em camundongos obesos

Summary

Este manuscrito descreve um protocolo para medir a taxa metabólica basal e a capacidade oxidativa de adipócitos termogênicos em camundongos obesos.

Abstract

As medidas de gasto energético são necessárias para entender como as mudanças no metabolismo podem levar à obesidade. O gasto energético basal pode ser determinado em camundongos medindo o consumo de oxigênio do corpo inteiro, a produção de _CO2 e a atividade física usando gaiolas metabólicas. Os adipócitos castanhos/bege termogênicos (BA) contribuem significativamente para o gasto energético dos roedores, particularmente em baixas temperaturas ambientais. Aqui, as medidas do gasto de energia basal e da capacidade total da BA de gastar energia em camundongos obesos são descritas em dois protocolos detalhados: o primeiro explicando como configurar o ensaio para medir o gasto de energia basal utilizando a análise da covariância (ANCOVA), uma análise necessária dado que o gasto energético co-varia com a massa corporal. O segundo protocolo descreve como medir a capacidade de gasto energético da BA in vivo em camundongos. Este procedimento envolve anestesia, necessária para limitar os gastos causados pela atividade física, seguida da injeção de agonista beta3-adrenérgico, CL-316.243, que ativa o gasto energético na BA. Estes dois protocolos e suas limitações são descritos em detalhes suficientes para permitir um primeiro experimento bem sucedido.

Introduction

O metabolismo pode ser definido como a integração das reações bioquímicas responsáveis pela absorção de nutrientes, armazenamento, transformação e quebra que as células usam para crescer e desempenhar suas funções. Reações metabólicas transformam a energia contida em nutrientes em uma forma que pode ser usada pelas células para sintetizar novas moléculas e executar o trabalho. Essas reações bioquímicas são inerentemente ineficientes em transformar essa energia em uma forma utilizável para sustentar a ^vida1. Tal ineficiência resulta em dissipação de energia na forma de calor, com esta produção de calor sendo usada para quantificar a Taxa Metabólica Padrão (RMR) de um ^organismo1. A condição Padrão foi definida clássicamente como a produção de calor ocorrendo em um adulto acordado, mas descansando, não ingerindo ou digerindo alimentos, na termoneutralidade e sem ^estresse1. A Taxa Metabólica Basal (RMC) ou o gasto energético basal em camundongos é referido como A RMS, mas em indivíduos que ingerem e digerem alimentos sob leve estresse térmico (temperaturas ambientais 21-22 °C)¹. Os desafios e dificuldades de medir diretamente a produção de calor fizeram com que a calorimetria indireta, ou seja, calculando a produção de calor a partir de medições de consumo de oxigênio, se tornasse a abordagem mais popular para determinar a RMC. O cálculo da RMC a partir do consumo de oxigênio é possível porque a oxidação de nutrientes por mitocôndrias para sintetizar ATP é responsável por 72% do oxigênio total consumido em um organismo, com 8% do consumo total de oxigênio também ocorrendo em mitocôndrias, mas sem gerar ATP (respiração não alcoólica)¹. A maioria dos 20% restantes do oxigênio consumido pode ser atribuída à oxidação de nutrientes em outros locais subcelulares (oxidação de ácido graxo peroxisômico), processos anabólicos e formação de espécies reativas de ^oxigênio1. Assim, em 1907, a Lusk estabeleceu uma equação, baseada em medições empíricas, amplamente utilizada para transformar o consumo de oxigênio e a produção de _CO2 em dissipação de energia como calor. Em humanos, o cérebro é responsável por ~25% da RMC, o sistema musculoesquelético para ~18,4%, o fígado por ~20 %, o coração por ~10%, e o tecido adiposo para ~3-7%². Em camundongos, a contribuição tecidual para a RMC é ligeiramente diferente, com o cérebro representando ~6,5%, o músculo esquelético ~13%, o fígado ~52%, o coração ~3,7%, e tecido adiposo ~5%³.

Notavelmente, as reações bioquímicas que definem a RMC não são fixas e mudam em resposta a diferentes necessidades, como trabalho externo (atividade física), desenvolvimento (crescimento tecidual), estresses internos (contra-infecções, lesões, rotatividade de tecidos) e alterações na temperatura ambiente (defesa fria)¹. Alguns organismos recrutam ativamente processos para gerar calor na exposição ao frio, implicando que o calor produzido pelo metabolismo não é apenas um subproduto acidental. Em vez disso, a evolução selecionou mecanismos regulatórios que poderiam especificamente aumentar a produção de calor alterando a taxa de reações metabólicas1. Assim, essas mesmas medidas de consumo de oxigênio podem ser usadas para determinar a capacidade de um organismo de gerar calor em resposta ao frio.

Dois grandes processos contribuem para a geração de calor após a exposição ao frio. O primeiro é o tremor, que gera calor aumentando a fosforilação oxidativa mitocondrial e a glicólise no músculo para cobrir o trabalho físico feito por contração muscular involuntária. Portanto, a exposição ao frio aumentará o consumo de oxigênio nos ^músculos1. A segunda é a Termogênese Não-Trêmula, que ocorre através de um aumento no consumo de oxigênio em adipócitos marrons e bege (BA). A dissipação de energia em calor na BA é mediada pela proteína de desacoplamento mitocondrial 1 (UCP1), que permite a reentrada de prótons na matriz mitocondrial, diminuindo o gradiente de próton mitocondrial. A dissipação do gradiente de próton mitocondrial por UCP1 aumenta a produção de calor pela elevação na transferência de elétrons e consumo de oxigênio e pela energia liberada pela dissipação de prótons em si sem gerar ATP (desacoplamento). Além disso, a BA termogênica pode recrutar mecanismos adicionais que elevam o consumo de oxigênio sem causar uma grande dissipação no gradiente de prótons, ativando ciclos fúteis de síntese oxidativa de ATP e de consumo. As gaiolas metabólicas descritas aqui, ou seja, o sistema CLAMS-Oxymax da Columbus Instruments, oferecem a possibilidade de medir o gasto energético em diferentes temperaturas ambientes. No entanto, para determinar a capacidade termogênica da BA utilizando medidas de consumo de oxigênio do corpo inteiro, é preciso: (1) eliminar a contribuição de tremores, e outros processos metabólicos não-BA para o gasto energético, e (2) ativar especificamente a atividade termogênica ba in vivo. Assim, um segundo protocolo descreve como ativar seletivamente a BA in vivo utilizando farmacologia em camundongos anestesiados na termoneutralidade (30 °C), com anestesia e termoneutralidade limitando outros processos termogênicos não-BA (ou seja, atividade física). A estratégia farmacológica para ativar a BA é tratar camundongos com o receptor β3-adrenérgico agonista CL-316.246. A razão é que a exposição a frio promove uma resposta simpática liberando norepinefrina para ativar receptores β-adrenérgicos na BA, o que ativa UCP1 e oxidação de gordura. Além disso, a expressão do receptor β3-adrenérgico é altamente enriquecida em tecido adiposo em camundongos.

Protocol

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia, Los Angeles (UCLA). Os camundongos foram administrados sua dieta e ad libitum de água na gaiola metabólica, abrigada em um ambiente controlado pela temperatura (~21-22 ou 30 °C) com um ciclo claro/escuro de 12h. Camundongos fêmeas de 8 semanas alimentados com dieta rica em gordura ou dieta de comida por 8 semanas foram usados para este estudo.

1. Medição da Taxa Metabólica Basal (BMR)

1. Meça o peso corporal total do mouse usando uma escala de peso com precisão na faixa de 0,1 g.
   NOTA: Isso deve ser feito antes de abrigar os camundongos em gaiolas metabólicas e após os 2-3 dias de período de aclimatação para as gaiolas metabólicas.
2. Meça a composição corporal, incluindo gordura e massa magra em camundongos não anestesiados, utilizando um sistema de análise de composição corporal adequado (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Essas medidas são necessárias para determinar o gasto energético e são executadas em paralelo às medidas totais de peso corporal (etapa 1.1).
3. Configure as gaiolas metabólicas e inicie o período de aclimatação.
   NOTA: O sistema de gaiolas metabólicas inclui um gabinete que permite ao usuário controlar a temperatura da carcaça e a luz de 12 gaiolas (Figura 1A,B). Cada gaiola tem uma garrafa de água, um alimentador e uma grade (Figura 1C). A grade separa o mouse do fundo da gaiola, permitindo a coleta de fezes. Uma vez instalada a gaiola em cada espaço pré-determinado, uma tampa que sela a gaiola inclui o slot da garrafa de água, o ar amostrador de tubos, o sistema de fluxo de ar e o sensor de atividade física (Figura 1D).
   1. Ligue o compartimento de temperatura, o sistema de fluxo de ar e o computador 2h antes de iniciar o ensaio.
   2. Após 2h, abra o software que controla o gabinete (ver Tabela de Materiais) e o fluxo de ar e deixe que o software teste a comunicação do computador com o equipamento.
      NOTA: O software Oxymax foi utilizado para o presente trabalho.
   3. Uma vez estabelecida a comunicação, clique em Arquivo, em seguida, Abra a Configuração do Experimento (Figura 2A) e selecione a configuração do experimento pré-assinada pelo fornecedor (ou configurada a partir de um ensaio anterior).
   4. Clique em Experimentar e clique em Propriedades, que abrirá a janela Propriedades de Experimento (Figura 2B).
   5. Na janela Propriedades, configure os parâmetros do gabinete ambiental, incluindo a Temperatura Ambiente (21 °C) e os ciclos de luz de 12 horas.
      NOTA: Manter o software aberto e funcionando permite que o ar flua para as gaiolas e o gabinete para manter os ciclos de temperatura e luz selecionados. Assim, todo o sistema pode operar com ratos dentro das gaiolas por vários dias, mesmo sem medir oxigênio e _CO2.
   6. Clique em Experimentar e clique em Configuração e a janela Configuração do experimento será aberta, onde os parâmetros de cada gaiola metabólica são definidos.
   7. Atribua cada ID do mouse à gaiola individual onde o mouse está alojado (Figura 2C).
   8. Inclua a massa magra ou o peso corporal total para cada camundongo somente se não forem observadas diferenças no peso corporal entre os grupos.
      NOTA: A obtenção de valores brutos de consumo de oxigênio e gasto energético facilita as análises da ANCOVA.
   9. Defina a taxa de fluxo de ar para a gaiola metabólica em 0,5-0,6 L/min.
   10. Na janela Configuração de experimentos, selecione o caminho e o nome de salvar arquivos. Selecione o diretório de backup (Figura 2D).
   11. Adicione uma quantidade pré-ponderada de alimentos aos alimentadores que cobrem pelo menos a ingestão de alimentos por 1 dia.
       NOTA: Se as gaiolas tiverem escalas integradas, os alimentos podem ser adicionados diretamente, e o software irá gravá-lo.
   12. Adicione as garrafas de água. Verifique se a garrafa está selada corretamente e não vaze.
   13. 24 horas depois de adicionar o alimento, pese o alimento que é deixado na gaiola.
       NOTA: Os gramas de alimentos adicionados menos os gramas dos alimentos restantes medirão a ingestão alimentar.
   14. Inicie as medidas de oxigênio, _CO2 e atividade (etapa 1.4.10) uma vez que os valores de consumo alimentar são os mesmos dos camundongos alojados em gaiolas regulares.
       NOTA: Aqui, o período de aclimatação (geralmente de 2 a 3 dias) está concluído, e as medições de gastos energéticos podem começar.
4. Medições indiretas de calorimetria e atividade para avaliar o gasto energético
   1. Meça o peso corporal, a gordura e a massa magra de todos os camundongos antes de iniciar as medições.
      NOTA: Estes são os valores de peso corporal e massa magra utilizados para realizar análises ANCOVA.
   2. Calibrar o detector baseado em _O2 e _CO2 do sistema CLAMS (ver Tabela de Materiais) com a concentração de oxigênio recomendada; sempre recalibrar o detector antes de iniciar um novo experimento.
   3. Use um gás de calibração de composição conhecida (20,50% oxigênio e 0,50% _CO2).
      NOTA: Os fornecedores de gás muitas vezes se referem a este gás como "Grau Padrão Primário".
   4. Ligue e certifique-se de que a pressão de saída do tanque esteja em 5-10 psi.
   5. Abra o software calibration utility para calibrar e testar os sensores de gás (Figura 2E). Clique em Experimentar e, em seguida, calibrar.
   6. Pressione Start. Em seguida, espere os sensores serem testados e para que o software peça ao usuário para girar os botões do sensor de gás (Figura 2F) até que o valor da identidade _O2 seja 1 (Figura 2G-H). Clique em Seguir quando a etapa estiver completa.
      NOTA: Se o Utilitário de Calibração realizar todas as etapas atuais, a calibração prosseguirá automaticamente para o próximo passo quando a barra de progresso estiver preenchida.
   7. Verifique os resultados de calibração quando todas as etapas foram concluídas e os resultados são apresentados.
   8. Desligue o gás de calibração.
   9. Troque de alimento e adicione alimentos suficientes para um período de 48-72 h.
      NOTA: Embora as gaiolas possam ser abertas durante as medições de gastos energéticos para monitorar o peso corporal e alterar os alimentos diariamente, os camundongos podem ser estressados por essas manipulações, e as medidas são perdidas quando as gaiolas são abertas. Assim, recomenda-se evitar qualquer manipulação durante o período de medição.
   10. No software, clique em Experimentar e, em seguida, Execute para iniciar as medidas de oxigênio_{, CO2} e atividade (Figura 3A).
       NOTA: A execução das medidas pode ser rastreada em tempo real em uma caixa localizada na seção inferior esquerda do software (retângulo vermelho, Figura 3B). O retângulo vermelho na Figura 3B mostra que o sistema mede a gaiola nº 1 no intervalo #3, ou seja, a 3ª medição. Uma medição em uma gaiola pode levar cerca de 1 min. Assim, com 12 gaiolas conectadas, o consumo de oxigênio pode ser medido aproximadamente a cada 12 minutos. São recomendadas medidas contínuas de no mínimo 48 h.
   11. Pare o experimento clicando em Experimentar e, em seguida, Pare (Figura 3C).
   12. Abra as gaiolas, pese os ratos e a comida. Coletar as fezes para calcular o número de calorias e lipídios excretados durante o período de medições de 48-72 h.
       NOTA: As fezes podem ser armazenadas a -20 °C para análises posteriores. Estas gaiolas não podem ser efetivamente usadas para coletar urina.
   13. Clique em Experimentos e exporte e exporte todos os sujeitos como um arquivo CSV (Figura 3D).
       NOTA: Para facilitar as análises da ANCOVA, é essencial exportar valores de consumo bruto de oxigênio (_VO2) e _CO2 (VCO2) sem ser normalizado pelo peso corporal.
5. Análise de dados e controle de qualidade
   1. Na folha de CSV exportada (Figura 3D) (a partir da etapa 1.4.13), utilize os valores brutos do consumo de oxigênio (_VO2) e produção de _CO2 (VCO2) medidos a cada 12 minutos no período de 2-3 dias que são automaticamente listados pelo software e incluem um cronograma, ou seja, a hora e a data em que foram medidos.
      NOTA: Os valores _vo2 e _VCO2 serão automaticamente corrigidos se os valores de peso corporal ou massa magra forem adicionados.
   2. Na folha de CSV exportada, utilize os valores brutos da razão de troca respiratória (RER: _VCO2/_VO2) que são automaticamente calculados e listados pelo software de acordo com o seu cronograma.
      NOTA: Valores próximos a 1 mostram que o camundongo oxida principalmente carboidratos, enquanto valores mais próximos de 0,7 representam que o camundongo é principalmente gordura oxidante. O RER acima de 1 pode ocorrer durante o exercício anaeróbico, pois o corpo expulsa mais _CO2 para compensar a acidose causada pelo lactato. RER maior que 1 pode indicar estresse. O arquivo CSV exportado também contém os valores brutos do gasto energético (EE) ou da produção de calor em calorias por minuto por mouse, medidos a cada 12 minutos nos 2-3 dias. Aqui, todos os valores listados incluem um estamp de tempo.
   3. Como os valores de EE único por mouse são necessários para um ANCOVA, os valores médios do EE registrados entre 09:00-16:00 para a fase luz (dia) e 19:00-04:00 para a fase escura (noite) por mouse e dia.
      NOTA: Isso pode ser feito manualmente usando Excel ou Graph Pad. A seleção dessas janelas biditárias evita a média dos valores EE intermediários, graduais e instáveis associados à transição de fase clara-escura.
   4. Para um período de 48 horas, calcule a média dos dois valores da luz do dia e os dois valores de fase escura por mouse usando Excel ou Graph Pad.
   5. Para quantificar a atividade física total, use Excel ou Graph Pad para somar as contagens de quebra de feixe x, y e z medidas nas gaiolas metabólicas e listadas no arquivo CSV para cada mouse.
      NOTA: A atividade total x,y,z é calculada fazendo primeiro o valor médio de cada X, Y, Z por mouse e ciclo. Em seguida, a soma de cada valor médio de X, Y, Z por mouse e ciclo é determinada a traçar os dados como na Figura 5E (sendo a média de 2 dias).
   6. Alternativamente, representam os dados que mostram cada valor de medição ao longo do tempo, o que gera curvas que ilustram as mudanças no EE durante a transição dos ciclos claros para escuros.
      NOTA: Consulte a seção de discussão sobre como e quando realizar análises ANCOVA, e as diferentes fórmulas utilizadas para calcular _VO2, _VCO2 e EE são fornecidas no Arquivo Suplementar 1.

2. Medição da capacidade de adipócitos termogênicos para gastar energia

1. Configure as medidas e tratamentos do rato. Consulte o passo 1 para obter detalhes sobre as preparações experimentais para monitorar o consumo de oxigênio, uma vez que a capacidade termogênica em adipócitos é determinada indiretamente pelo consumo de oxigênio seguindo as etapas 2.1.1-2.2.2.
   NOTA: Este protocolo requer anestesia do rato e tratamento agudo com o agonista receptor beta-3 CL-316.243 (ver Tabela de Materiais), dando uma rápida avaliação da capacidade termogênica ba.
   1. Realize a análise da composição corporal e pese os camundongos. Ligue os CLAMS, configure a temperatura a 30 °C (termoneutralidade) e espere 2h para todo o sistema aquecer.
   2. Configure o resto das condições de ensaio, incluindo luz, atribua o ID do mouse a cada gaiola e adicione o valor do peso corporal de cada rato na gaiola correspondente se não for observada diferença no peso corporal entre os grupos.
   3. Calibrar o detector de oxigênio/_CO2 como nas etapas 1.4.2-1.4.7.
   4. Inicie o experimento no software.
   5. Injete cada rato com pentobarbital (60-120 mg/kg) e coloque cada rato em sua gaiola metabólica atribuída (passo 2.1.2).
      NOTA: A dose de pentobarbital necessária para manter os camundongos dormindo na termoneutralidade (30 °C) varia de acordo com a cepa do camundongo e o genótipo. Recomenda-se testar diferentes doses pentobarbitais de 50 a 120 mg/kg e escolheu aquela que mantém o camundongo anestesiado durante 2-3 h a 30 °C. A anestesia eficiente é essencial para eliminar a contribuição da atividade física para o gasto energético.
   6. Para garantir a anestesia, observe os camundongos após a injeção pentobarbital até que estejam completamente dormindo e suas taxas de consumo de oxigênio diminuídas se tornem estáveis.
   7. Aguarde para obter pelo menos 3 taxas de consumo de oxigênio consecutivos estáveis antes de injetar CL-316.243.
      NOTA: Enquanto aguarda a estabilização do consumo de oxigênio, prepare as seringas com CL-316.243 para cada rato (1 mg/kg).
   8. Abra a gaiola nº 1 e injete CL-316.243 subcutânea imediatamente após uma medição _vo2 e _VCO2 ocorrer na gaiola #1. Retorne o mouse para a gaiola #1 imediatamente após a injeção.
      NOTA: As medidas estão sendo indicadas em tempo real na seção inferior esquerda do software (Figura 3B, retângulo vermelho).
   9. Aguarde que a gaiola #2 seja medida (Figura 3B, retângulo vermelho) e, em seguida, proceda como na etapa 2.1.8 para a gaiola #2.
      NOTA: Injetar CL-316.243 imediatamente após uma medição permite manter o tempo constante entre as injeções. Por exemplo, se houver 12 ratos/gaiolas funcionando, com medidas coletadas em gaiolas individuais sequencialmente e a coleção durando 55 s por gaiola, então você deve injetar um rato a cada minuto. Com essas taxas de injeção, a primeira medição ocorrerá após 12 minutos após a injeção em todas as 12 gaiolas.
   10. Continue as medições de gastos energéticos até que o gasto energético valorize o patamar para 5-6 medições consecutivas, geralmente 90-180 min após a injeção.
       NOTA: Os ratos podem acordar da anestesia durante os experimentos. Esses camundongos precisam ser removidos da análise. Portanto, testar as doses pentobarbitais de antemão aumentará a eficiência dos estudos.
   11. Pare as medidas de gasto energético, mas mantenha os ratos em suas gaiolas a 30 °C, até que acordem.
   12. Depois que os ratos estiverem totalmente acordados, inspecione a saúde dos ratos e devolva-os às suas gaiolas iniciais.
   13. Exporte os dados de cada mouse como um arquivo CSV usando o software do equipamento, conforme descrito na seção 1.4.13.
2. Análise de dados
   NOTA: A análise dos dados foi realizada pelo Excel ou Graphpad
   1. Plote os 3-5 valores consecutivos de _VO2, _VCO2 e EE que são estáveis e constantes ao longo do tempo, pois estes são os valores que representam a taxa metabólica quando os camundongos são totalmente anestesiados.
   2. Em seguida, plote as primeiras e seguintes medições consecutivas de _VO2, _VCO2 e EE obtidas após a injeção.
      NOTA: Os valores absolutos do EE e o aumento da dobra no EE induzido pela injeção indicam a função termogênica ^BA7.

Results

A Figura 4 mostra valores de atividade física _VO2, VCO2, Produção de Calor/Energia (EE), Relação de Troca Respiratória (RER) e X, Y, Z valores de atividade física obtidos utilizando as gaiolas metabólicas do sistema CLAMS. O _VO2 e _VCO2 fornecidos pelo sistema CLAMS é o volume de gás (mL) por minuto e já pode ser dividido pelo peso corporal ou pelos valores de massa magra inserindo esses valores de peso no software CLAMS antes de iniciar as medições...

Discussion

A calimemetria indireta é usada há anos para avaliar os gastos energéticos do corpo ^inteiro4. Este protocolo descrito aqui fornece um método simples de medir a taxa metabólica basal e determinar a capacidade termogênica ba in vivo usando gaiolas metabólicas.

O método de calimemetria indireta descrito aqui confirma que dividir os valores do gasto energético por valores de peso corporal pode ser enganoso. Por exemplo, pode concluir que o gasto energético é sistem...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema CLAMS-Oxymax	Columbus Instruments	CLAMS-alimentador central-ENC	Incluindo invólucro ambiental e sensor de oxigênio de zircônia
PC de mesa com software Oxymax	HP/Columbus	N/A	PC necessário para ser adquirido separadamente
Jarro de Drierite (sulfato de cálcio com indicador de cloreto de cobalto)	Fisher Scientific	23-116681	Necessária para secar o gás que entra no sensor de oxigênio, a umidade pode danificar o sensor
RMN para composição corporal	Eco-MRI	Eco-MRI 100	Mede a massa magra e gorda em camundongos vivos. É necessário para análises ANCOVA.
CL-316-243	Sigma	C5976	Injetado nos camundongos por via subcutânea para ativar a termogênese
Dieta rica em gordura	Dietas de pesquisa	D12266B	Fornecido aos camundongos antes e durante as medições
Pentobarbital / Nembutal	Farmácia no DLAM	N / A	Anestesia para os camundongos
Gás primário de grau padrão (tanque e regulador)	Praxair	NI CD5000O6P-K / PRS 2012-2331-590	20,50% de oxigênio, 0,50% de CO2 balanceado com nitrogênio usado para calibração