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Artigo de método

Um modelo de xenoenxerto sem rótulo para investigar o comportamento de esferoides de células-tronco humanas em embriões de galinhas

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DOI:

10.3791/63067

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15 de outubro de 2021

 , 
1Morphological Sciences Program, Biomedical Sciences Institute, Federal University of Rio de Janeiro, 2Department of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos um método para transplantar e identificar esferóides de células humanas em embriões de galinha. Este modelo de xenoenxerto usa o microambiente embrionário como fonte de sinais instrutivos para testar a migração, diferenciação e tropismo celular e é especialmente adequado para o estudo de populações de células primárias e/ou heterogêneas.

Resumo

Os xenoenxertos são métodos valiosos para investigar o comportamento de células humanas in vivo. Em particular, o ambiente embrionário fornece pistas para migração, diferenciação e morfogênese celular, com sinais instrutivos únicos e identidade da camada germinativa que muitas vezes estão ausentes dos modelos de xenoenxerto adulto. Além disso, os modelos embrionários não podem discriminar tecidos próprios versus não próprios, eliminando o risco de rejeição do enxerto e a necessidade de imunossupressão do hospedeiro. Este trabalho apresenta uma metodologia para transplante de esferoides de células humanas em embriões de galinha, que são acessíveis, passíveis de manipulação e se desenvolvem a 37 °C.

Os esferoides permitem a seleção de uma região específica do embrião para transplante. Depois de enxertadas, as células se integram ao tecido hospedeiro, permitindo o acompanhamento de sua migração, crescimento e diferenciação. Este modelo é flexível o suficiente para permitir a utilização de diferentes populações aderentes, incluindo populações heterogêneas de células primárias e células cancerígenas. Para contornar a necessidade de marcação celular prévia, também é descrito um protocolo para a identificação de células doadoras por meio de hibridização de sondas Alu específicas para humanos, o que é particularmente importante na investigação de populações de células heterogêneas. Além disso, as sondas de DNA podem ser facilmente adaptadas para identificar outras espécies de doadores. Este protocolo descreverá os métodos gerais para preparar esferoides, enxertia em embriões de galinha, fixação e processamento de tecido para seccionamento de parafina e, finalmente, identificar as células humanas usando hibridização in situ de DNA. Controles sugeridos, exemplos de interpretação de resultados e vários comportamentos celulares que podem ser testados serão discutidos, além das limitações deste método.

Introdução

Os xenoenxertos são ferramentas úteis para investigar o comportamento de células humanas in vivo. Esses modelos forneceram informações valiosas para uma ampla gama de tópicos científicos, como a biologia das células-tronco humanas1, a observação de eventos celulares em tempo real2 e a investigação da angiogênese tumoral e metástase3. Além disso, vários aspectos da biologia do câncer, incluindo a tumorigênese de xenoenxertos específicos do paciente, foram estudados 4,5. Cada um desses modelos de xenoenxerto tem suas vantagens e desvantagens e, portanto, cada um é mais adequado para questões científicas específicas. Os embriões de pintinhos são um modelo popular de biologia do desenvolvimento, pois são um modelo amniota acessível que é passível de manipulação cirúrgica. Enxertos heterólogos permitiram aos pesquisadores criar mapas de destino precisos6 ou explorar se uma característica é autônoma da célula ou instruída pelo ambiente 7,8. Um raciocínio semelhante permite que o embrião de galinha seja usado como um modelo de xenoenxerto para estudar o comportamento das células humanas.

O ambiente embrionário orquestra ativamente a morfogênese do tecido com sinais de migração e diferenciação, bem como interações célula-célula. Assim, em comparação com os modelos de xenoenxerto adulto, o embrião fornece um ambiente mais instrutivo para testar o comportamento das células enxertadas, por exemplo, imitando sinais presentes em nichos de células-tronco adultas (por exemplo, BMPs, WNTs, NOTCH e SHH9). Além disso, a ausência de um sistema imune adaptativo durante o desenvolvimento inicial permite que os xenoenxertos sejam realizados sem o risco de resposta imune ou rejeição do tecido doador10. Estudos anteriores investigaram xenoenxertos de células humanas em embriões de galinha para esse fim. O potencial neurogênico das células-tronco humanas foi testado após a injeção no tubo neural ou vasos sanguíneos11 , além da integração de células-tronco embrionárias12 e células-tronco pluripotentes induzidas13 no embrião. As células do melanoma humano também foram estudadas usando o ambiente embrionário do pintinho, que revelou ligações entre sua tumorigênese e o comportamento das células da crista neural14, bem como a reprogramação das células tumorais com as informações do embrião15. Este artigo descreve um protocolo especialmente adequado para estudar o comportamento de populações de células primárias e heterogêneas humanas.

Nas últimas décadas, o componente estromal de diversos tecidos tem sido estudado como fonte autóloga de células-tronco progenitoras/e por suas propriedades pró-angiogênicas e imunorreguladoras, anteriormente conhecidas como "células-tronco mesenquimais"16,17,18. A primeira dessas populações celulares a ser caracterizada foi a população de células-tronco estromais/células-tronco da medula óssea (BMSCs), que apresentam potencial osteo, adiposo e, em menor grau, condrogênico in vivo19,20. As células estromais derivadas do tecido adiposo (ADSCs) são uma população heterogênea obtida por digestão enzimática das amostras de lipoaspirado ou dermolipectomia, seguida de isolamento da fração estromal-vascular (SVF) e, finalmente, expansão em cultura21. Em cultura, essas células são fenotipicamente caracterizadas por marcadores compartilhados com outras populações mesenquimais, como CD90, CD73, CD105 e CD44, marcadores únicos como CD36 e ausência de marcadores hematopoiéticos (CD45) ou endoteliais (CD31)22. Além disso, as ADSCs têm potencial osteo, adipo e condrogênico in vitro, e o número de células-tronco/progenitoras nessa população pode ser definido pelo ensaio da unidade formadora de colônias fibroblastóides (UFC-F)22. In vivo, foi relatada a existência de células com o fenótipo ADSC nos compartimentos estromal23 e/ou perivascular24. Está ficando cada vez mais claro que, apesar de compartilhar marcadores após o cultivo in vitro, o compartimento estromal de diferentes tecidos reflete características intrínsecas de um determinado órgão, e essas populações de células têm propriedades distintas dependendo de sua fonte 17,25,26,27. Além disso, como essas células são isoladas com base em sua adesão a uma placa de cultura de células, elas podem ser compostas por células de diversas camadas germinativas28. Assim, empregar um método de xenoenxerto para estudar o potencial de diferenciação e o tropismo das células estromais de forma imparcial pode fornecer informações valiosas sobre essas populações de células para orientar o desenvolvimento de futuras terapias celulares.

O protocolo aqui descrito (Figura 1) é um método de xenoenxerto que aproveita o baixo custo e a facilidade de manipulação de embriões de pintinhos. Foi usado anteriormente para estudar o comportamento de ADSC29 humano, fibroblastos da pele29, células estromais derivadas do sangue menstrual30 e células de glioblastoma31. Este método incluirá o transplante de células como esferóides32, que podem ser preparadas a partir de qualquer população de células aderentes (Figura 2). Procedimentos cirúrgicos e a preparação de materiais cirúrgicos personalizados - os microbisturis e capilares de vidro - também serão descritos (Figura 3). As células humanas são detectadas em cortes histológicos por hibridização de sondas Alu específicas para humanos (Figura 4), eliminando assim a necessidade de marcação prévia das células enxertadas. Os resultados representativos descrevem o comportamento das ADSC humanas enxertadas tanto na região somítica ao nível do broto da asa (Figura 5, Figura 6 e Figura 7) quanto no primeiro arco faríngeo (Figura 8), bem como dos esferoides de glioblastoma primário humano enxertados no prosencéfalo (Figura 8). A migração, diferenciação e interação celular com tecidos embrionários de pintinhos serão descritas, bem como ensaios sugeridos para investigar melhor o comportamento celular usando co-coloração ou coloração de seções adjacentes.

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Protocolo

Todos os procedimentos in vivo utilizados neste estudo cumpriram todas as diretrizes experimentais relevantes para testes e pesquisas em animais, de acordo com as diretrizes brasileiras de uso de animais experimentais (L11794). Os protocolos utilizados para o manuseio de embriões de galinha foram todos aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais em Experimentação Científica (Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio de Janeiro). O uso de células humanas foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho (números 043/09 e 088/04). Foram utilizados ovos específicos livres de patógenos (FPS) de galinha White Leghorn (Gallus gallus).

1. Preparação de esferóides celulares

NOTA: Os esferóides celulares podem ser preparados com uma ampla gama de tipos de células, desde que sejam aderentes. Para este protocolo, células estromais derivadas do tecido adiposo humano (ADSCs) foram isoladas conforme descrito anteriormente21,27 serão utilizadas (Figura 2A). As células foram obtidas pela digestão de fragmentos de tecido adiposo ou lipoaspirados com colagenase IA por 1 h a 37 °C sob agitação, seguida de plaqueamento a 1−2 × 104 células/cm2 e incubação noturna. As células não aderentes foram descartadas e as células aderentes foram expandidas por 3-6 passagens. As ADSCs foram homogêneas para a expressão dos antígenos de superfície CD105, CD90, CD13 e CD44 e negativas para os antígenos hematopoiéticos CD45, CD14, CD34, CD3 e CD1927. Embora o método descrito aqui possa ser realizado facilmente com materiais mínimos além do que é rotineiramente usado para cultura de células, o tempo ideal de agregação e a necessidade de dissociação parcial devem ser determinados empiricamente. Métodos alternativos para a preparação de esferóides celulares podem ser empregados, como o método de gota suspensa33 ou poços revestidos de agarose34; Veja a discussão para mais detalhes. Todos os procedimentos devem ser realizados em bancada limpa e com técnicas assépticas.

  1. Aqueça PBS estéril (solução salina tamponada com fosfato), meio de cultura e solução de tripsina a 37 °C antes da manipulação celular.
  2. Cultura de ADSCs em DMEM de baixa glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina. Use um frasco confluente de 25 cm2 de ADSCs para a preparação de duas placas de esferóides. Rejeitar o meio de cultura e lavar a cápsula de cultura três vezes com uma quantidade adequada de PBS estéril (5 ml de PBS por cada lavagem se for utilizado um balão de cultura de2 células de 25 cm).
  3. Adicione uma solução de tripsina suficiente (contendo 0,78 mM de EDTA) para cobrir as células (1 ml de solução de tripsina se for utilizado um balão de cultura de2 células de 25 cm) e deixe o balão de cultura repousar durante 5 min à temperatura ambiente.
  4. Pipete suavemente as células para cima e para baixo para dissociá-las. Adicione a mesma quantidade de meio de cultura contendo FBS para inativar a tripsina e transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL.
  5. Centrifugue por 10 min a 180 × g. Descarte o sobrenadante e bata no tubo para soltar o pellet.
  6. Ressuspenda as células em 500 μL-2 ml de meio de cultura adequado ao tipo de célula (ver passo 1.2).
    NOTA: A concentração mínima é de 5 × 105 células/mL para células aderentes, como ADSCs e fibroblastos. Um frasco confluente de 25 cm2 de ADSCs deve ser ressuspenso em 2 mL de meio e semeado em 2 placas de Petri, usando 1 mL cada. Células menos aderentes, como a glia, podem se beneficiar do plaqueamento em ~ 2 × 106 células / mL em um volume menor.
  7. Transferir cuidadosamente a suspensão celular para um lado de uma placa de Petri estéril de 60 mm (não revestida e não tratada, como as utilizadas para a preparação de placas de ágar). Tente restringir o meio de cultura à menor área possível (Figura 1B) apoiando o prato sobre um pedaço de gaze limpa e dobrada para mantê-lo inclinado na incubadora.
  8. Incubar a suspensão celular a 37 °C, 5% de CO2, até que os agregados celulares estejam formados (6-8 h após o plaqueamento dos ADSCs).
    NOTA: O tempo de agregação do esferóide pode variar de acordo com o tipo de célula.
  9. Se necessário (ver discussão), dissocie parcialmente os agregados de células grandes pipetando suavemente para cima e para baixo usando pontas de 1000 μL. Dissocie os esferóides ADSC 6-8 h após o revestimento.
  10. Coloque a placa na incubadora até que os esferoides estejam prontos para serem transplantados: redondos com bordas definidas e não facilmente dispersos (Figura 1C,D).
    NOTA: Os esferoides ADSC estão prontos 2 dias após a dissociação parcial.

2. Transplante de esferóides em embriões de galinha

  1. Preparação
    1. Prepare ovos de galinha incubando 15-30 ovos em uma incubadora úmida a 37,5 ° C até que o estágio desejado de Hamburger-Hamilton (HH) seja atingido35: 40-45 h para enxertos em somitos no nível do botão do membro (HH11-12 ou 13-19 somitos) ou 29-33 h para enxertos na região cefálica (HH8-9 ou 5-8 somitos). Posicione os ovos horizontalmente e desenhe uma linha com um lápis na parte superior dos ovos antes da incubação (Figura 3D).
      NOTA: Os tempos de incubação podem variar ligeiramente de acordo com as incubadoras individuais. Desenhar uma linha garantirá que a parte superior do ovo, onde o embrião é encontrado, possa ser facilmente identificada se o ovo for girado antes do experimento.
    2. Prepare agulhas afiadas ("microbisturis") prendendo uma agulha de costura a um porta-agulha de metal (Figura 3B). Usando uma pedra de amolar untada com óleo, afie a agulha até que se assemelhe a um pequeno bisturi com uma borda fina (Figura 3C). Alternativamente, prepare uma agulha afiada de tungstênio por eletrólise36.
    3. Prepare capilares de vidro usando a chama de um bico de Bunsen para derreter brevemente a parte fina de uma pipeta de vidro Pasteur. Remova a parte derretida das chamas e estique-a para formar um capilar fino. Divida cuidadosamente o capilar em duas partes, quebrando-o com micropinças. Prepare um capilar fino para injeção de tinta nanquim e um capilar espesso para transferência de esferóides (Figura 3B).
      NOTA: Ao variar a força de tração, é possível criar diferentes medidores capilares. Os capilares devem ser preparados imediatamente antes da cirurgia.
    4. Prepare a superfície de trabalho e outros materiais para manipulação de ovos (Figura 3A). Esterilize todos os materiais cirúrgicos em um forno a 100 ° C durante a noite ou com etanol a 70% imediatamente antes do uso. Aqueça o PBS estéril a 37 °C. Conecte uma ponta de 200 μL (com barreira) ao conjunto do tubo aspirador para injeção de tinta nanquim e transferência de esferóides.
      NOTA: Use pontas com barreiras ao transferir esferoides de células humanas.
    5. Imediatamente antes do experimento, adicione 2 gotas de solução estoque de tinta nanquim à placa de Petri de 30 mm e misture com 1 mL de PBS estéril. Remova a placa esferóide da incubadora e coloque-a sobre uma geladeira pelo resto do experimento.
  2. Preparação de cada ovo
    1. Remova um ovo da incubadora e coloque-o sobre um porta-ovos. Faça um pequeno orifício na ponta afiada do ovo (Figura 2D) e aspire 1,5 mL de albúmen usando uma seringa e uma agulha. Insira a agulha perpendicularmente ao ovo para evitar danificar a gema. Sele o orifício com fita adesiva. Opcionalmente, repita esta etapa para todos os ovos antes do experimento e reincube o restante dos ovos.
    2. Corte cuidadosamente uma janela na parte superior do ovo usando uma tesoura (Figura 3D). Usando a pipeta, adicione 1-2 gotas de PBS sobre a gema. Se necessário, remova grandes bolhas de albumina (como as vistas na Figura 3F) usando a pipeta.
    3. Conecte o capilar fino ao conjunto do tubo do aspirador. Encha parcialmente o capilar de vidro com a solução de tinta nanquim por aspiração. Injete tinta nanquim suficiente na gema sob o embrião até que as estruturas embrionárias sejam vistas ( Figura 3E , F ).
    4. Usando o estereomicroscópio, conte o número de somitos (Figura 4A). Numere individualmente os ovos usando um lápis (Figura 4B).
  3. Transplante de esferoides
    1. Identifique a região do enxerto: mesoderma paraxial ao nível do botão da asa (mesoderma pré-somítico dos15º a20º somitos presuntivos37) (Figura 3G e Figura 5A) ou primeira região presuntiva do arco faríngeo (entre o ectoderma e o endoderma lateral ao mesencéfalo posterior/primeiro rombómero38) (Figura 8A).
    2. Corte a membrana vitelina sobre a região alvo usando um microbisturi.
    3. Usando um par de microbisturis, faça um corte raso na região onde o esferóide será implantado (Figura 3H).
      NOTA: Evite danificar o endoderma subjacente; caso contrário, a gema vazará (se isso acontecer, descarte o ovo).
    4. Remova o capilar fino do aspirador e substitua-o pelo capilar grosso. Observe os esferóides sob o estereomicroscópio e escolha um esferóide aproximadamente do mesmo tamanho que o somito (Figura 2D). Aspire este esferóide para o capilar.
    5. Deposite suavemente o esferóide próximo à região cortada (Figura 3H). Usando as agulhas afiadas, empurre o esferóide para a região de corte (Figura 3I, J).
    6. Adicione 1-2 gotas de PBS sobre o embrião usando a pipeta para garantir que o esferóide esteja firmemente inserido.
      NOTA: Se o enxerto for desalojado, um novo esferóide deve ser transplantado (etapas 2.3.4 e 2.3.5).
    7. Limpe qualquer vazamento de albumina da casca do ovo usando papel de seda para garantir que o ovo possa ser completamente selado, evitando contaminação. Sele a janela no ovo usando fita adesiva.
    8. Anote a região enxertada (Figura 4A). Retorne cuidadosamente o ovo à incubadora úmida a 37.5 ° C para evitar o deslocamento do esferóide inserido.
    9. Incube o ovo até o estágio desejado.
      NOTA: Quando o xenoenxerto é realizado em somitos no nível do botão do membro, a migração e a morte celular foram testadas com sucesso em embriões de 3,5 dias de idade (HH21), e a diferenciação celular e o tropismo foram observados em embriões de 6 dias (HH29) (Figura 5A). A integração nos tecidos do hospedeiro também foi realizada em embriões de 8 dias de idade (HH33). Células doadoras enxertadas no território do arco faríngeo foram estudadas em embriões de 4,5 dias de idade (HH25) (Figura 8A).

3. Dissecção de tecido, fixação, processamento e preparação de cortes histológicos

  1. Dissecção e fixação
    1. Prepare o fixador (pelo menos 1 mL / embrião): etanol 100% - formaldeído 37% - ácido acético glacial na proporção de 6: 3: 1. Limpe a superfície de trabalho, um par de micropinças, tesoura cirúrgica ou tesoura de íris e uma escumadeira. Encha uma placa de Petri de vidro de 60 mm com PBS frio e coloque-a sob um estereomicroscópio.
    2. Abra o ovo cortando a fita adesiva.
    3. Corte as membranas ao redor do embrião e remova-o com a escumadeira.
    4. Transfira o embrião para a placa de Petri. Se o embrião tiver 5 dias de idade (HH26) ou mais, decapite-o imediatamente antes de qualquer manipulação ex ovo.
    5. Remova todas as membranas restantes usando micropinças e tesouras. Agite suavemente a amostra em PBS para lavar quaisquer gotículas de gema restantes.
    6. Se o xenoenxerto foi realizado no nível da asa, descarte a cabeça. Se as células foram enxertadas na região cefálica, corte e descarte a metade inferior do corpo, garantindo que a região cardíaca seja mantida intacta.
    7. Transfira cada amostra para um tubo separado de 2,0 mL contendo 1 mL do fixador. Identifique os tubos individualmente como antes (Figura 4B). Incube-os durante a noite a 4 °C com agitação.
    8. Utilizar um sedimento de células ou esferóides (figura 4F) como controlo positivo. Para isso, centrifugue uma suspensão celular (etapa 1.5) ou esferóides celulares (etapa 1.10) a 180 × g por 10 min em um tubo de 1,5 mL, descarte o meio de cultura e adicione 1 mL do fixador sem perturbar o pellet. Incubar o tubo durante a noite a 4 °C sem agitação e proceder da mesma forma que para as amostras de pintinhos.
  2. Desidratação e incorporação
    1. Desidrate os embriões por lavagens sucessivas de 1 mL de etanol 70%, 80%, 90% e 100% em 1x PBS por pelo menos 1 h cada com agitação.
    2. Incubar as amostras durante a noite em 1 mL de etanol 100% à temperatura ambiente com agitação.
    3. Incubar as amostras em 1 mL de xileno 100% por 1 h em uma capela de exaustão. Repita mais duas vezes.
    4. Transfira o conteúdo do tubo para o bloco de coloração e descarte o xileno. Adicione parafina derretida suficiente para cobrir o embrião e cubra o bloco de coloração com sua tampa de vidro. Incubar durante a noite em estufa a 65 °C.
    5. Prepare um prato quente e um molde para blocos de parafina para incorporação.
      NOTA: Um par de clipes de papel esticados é útil para posicionar o embrião.
    6. Encha o molde com parafina derretida e transfira o embrião para ele. Posicione o embrião para obter uma seção transversal do tronco (Figura 5A) ou uma seção coronal da cabeça (Figura 8A).
    7. Insira uma etiqueta de nome de papel na parafina, oposta à superfície a ser seccionada, para ajudar a cortar o embrião na orientação correta (Figura 4C).
    8. Se estiver sendo usado, coloque o de incorporação sobre a amostra. Deixe o bloco esfriar completamente antes de removê-lo do molde. Como alternativa, prenda o bloco de parafina endurecido ao ou outro suporte de bloco usando parafina derretida e deixe esfriar novamente.
  3. Corte
    1. Prepare os materiais para seccionamento. Aqueça uma placa quente a 42 °C e cubra uma placa de papelão ou isopor com papel alumínio limpo de aproximadamente 30 cm x 20 cm. Limpe todas as superfícies antes de usar.
      NOTA: Use luvas para evitar a contaminação com nucleases, especialmente se algumas seções forem usadas para hibridização in situ de RNA. Evite usar um banho de histologia para esticar as seções de parafina pelo mesmo motivo, a menos que a água e as superfícies possam ser completamente limpas com antecedência.
    2. Apare o excesso de parafina com uma lâmina de micrótomo. Crie um chanfro em ambos os lados, em forma trapezoidal, para facilitar a separação de cada seção usando uma lâmina de bisturi em uma etapa posterior (Figura 3A).
    3. Prenda o bloco ao micrótomo. Posicione o bloco com cuidado para garantir que os lados esquerdo e direito estejam paralelos um ao outro. Faça um ajuste mais fino depois de cortar algumas seções da amostra e observá-las ao microscópio.
    4. Quando a região alvo for alcançada (o botão do membro ou o primeiro arco faríngeo), corte seções de 7 μm e coloque as fitas de parafina sobre a placa coberta com papel alumínio. Corte toda a região alvo (Figura 4C).
    5. Para preparar seções seriadas, cubra o número adequado de vidros de lâminas com gotas de água deionizada estéril. Transfira seções individuais para as lâminas sequencialmente, usando pincéis e bisturi. Transfira seções adjacentes para diferentes slides para criar seções seriais (Figura 4D). Prepare uma série de 3 lâminas para embriões de 3,5 dias, 4 lâminas para 4,5 dias e 5 lâminas para embriões de 6 dias. Core os cortes adjacentes com diferentes sondas, anticorpos ou colorações histológicas clássicas.
      NOTA: A mesma série pode conter várias lâminas adjacentes se uma grande parte do embrião for seccionada. Várias seções podem ser transferidas para cada slide, mantendo algum espaço entre as seções para permitir que elas se estiquem. Não coloque a corrediça na placa quente ainda.
    6. Depois que todas as seções forem transferidas para os slides, adicione mais água até que todas as seções estejam flutuando sobre uma única gota de água. Coloque a lâmina em um prato quente e deixe as seções esticarem. Remova a lâmina da placa quente e remova a água inclinando o vidro deslizante cuidadosamente contra o papel de seda.
      NOTA: Não deixe as seções tocarem diretamente a lâmina de vidro antes de esticarem.
    7. Deixe as lâminas secarem durante a noite em uma incubadora a 37 °C.

4. Síntese de sondas Alu marcadas com digoxigenina por reação em cadeia da polimerase (PCR)

  1. Preparar uma solução-mãe dos seguintes primários específicos para o ser humano39: AluFw: 5'-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3' e AluRev: 5'-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3'.
  2. Prepare 50 μL da seguinte reação de PCR40: 1x tampão de PCR, 2.0 mM MgCl2, 0.1 mM dCTP, 0.1 mM dGTP, 0.1 mM dATP, 0.065 mM dTTP, 0.035 mM dig-11-dUTP, 0.4 μM AluFw primers, 0.4 μM AluRev primers, 0.05 U/μL Taq polimerase e 1 ng/μL DNA genômico humano.
  3. Execute a PCR usando as seguintes configurações: desnaturação inicial a 94 °C por 4 min, seguida por 40 ciclos de 94 °C por 20 s, 60 °C por 20 s e 72 °C por 20 s, seguida por uma desnaturação final de 72 °C por 5 min.
  4. Meça a concentração da sonda usando um espectrofotômetro. Armazene as sondas a -20 °C.
    NOTA: O produto de PCR deve ser de 200-300 pb após a eletroforese em um gel de agarose a 2%29.

5. Hibridização in situ de seção com sondas Alu

  1. Dia 1: Permeabilização e hibridização
    NOTA: Um frasco de vidro de lâmina esterilizado deve ser usado para todas as etapas realizadas no dia 1.
    1. Pré-aqueça uma lavagem de PBT (0,1% Tween 20 em PBS) em banho-maria a 37 ° C e prepare uma câmara úmida com 50% de formamida / 50% de água deionizada.
      NOTA: Calcule o volume de todas as lavagens com base no tamanho do frasco de vidro. A menos que especificado, todas as lavagens são realizadas por imersão das lâminas na solução.
    2. Remover a parafina por três lavagens sucessivas em xileno, 5 min cada, numa hotte.
    3. Reidrate a série por duas lavagens em etanol 100% por 5 min cada, seguidas por lavagens com etanol 90/70/30% em PBS por 2 min cada.
    4. Lave em PBT (0,1% Tween 20 em PBS) três vezes por 5 min cada.
    5. Para permeabilização, adicione 2 μg / mL de proteinase K ao PBT pré-aquecido, mergulhe as lâminas na solução e incube-as por 14 min em banho-maria a 37 ° C.
    6. Fixe as seções por imersão em paraformaldeído / PBS a 4% por 20 min em temperatura ambiente.
    7. Lave com PBS por 5 min.
    8. Depois de limpar o excesso de PBS de cada lâmina, cubra as seções com 300 μL de tampão de hibridização (50% de formamida deionizada, 4x SSC pH 5,0, 1x solução de Denhardt, 5% de sulfato de dextrano, 100 μg / mL de DNA de esperma de salmão) (Tabela 1). Incubar durante 1 h a 42 °C na câmara de formamida.
    9. Prepare uma solução de sonda de Alu 0,2 ng/mL em tampão de hibridização. Incline a lâmina para remover o tampão de hibridização e adicione 120 μL da solução de sonda Alu sobre as seções. Cubra com uma lamínula de vidro, tomando cuidado para evitar bolhas.
      NOTA: O parafilme não deve ser usado para cobrir as lâminas nesta etapa, pois derreterá em temperaturas acima de 70 °C.
    10. Aquecer as lâminas numa placa de aquecimento a 95 °C durante 5 min.
      NOTA: Não respire os vapores de formamida.
    11. Incubar as lâminas a 42 °C na câmara de formamida durante a noite.
  2. Dia 2: Lavagens rigorosas e imuno-histoquímica
    1. Prepare 20x tampão SSC (NaCl 3 M, citrato de sódio 0,3 M, pH 7,5) (Tabela 1). Pré-aqueça duas lavagens de tampão citrato de sódio sadio (SSC) 0,1x salino, pH 7,5, a 42 °C.
    2. Encha uma jarra de vidro deslizante com 2x tampão SSC, pH 7,5. Coloque delicadamente as lâminas na solução e espere que as lamínulas se soltem. Remova as lamínulas usando pinças e incube as lâminas em 2x SSC buffer por 5 min em temperatura ambiente.
    3. Lave novamente as lâminas com 2x tampão SSC, pH 7,5, por 5 min em temperatura ambiente.
    4. Lave as lâminas duas vezes com tampão SSC 0,1x, pH 7,5, a 42 °C por 5 min cada.
    5. Lave as lâminas duas vezes com MABT (tampão de ácido maleico com Tween; ácido maleico 0,1 M, cloreto de sódio 0,15 M, Tween 20 0,1%, pH 7,5) (Tabela 1) por 30 min cada em temperatura ambiente.
    6. Limpe o excesso de tampão de cada lâmina e cubra as seções com 400 μL de solução de bloqueio (10% de soro de cabra normal inativado, 2% de reagente de bloqueio em MABT). Incubar durante 2 h numa câmara húmida (preparada com água deionizada) à temperatura ambiente.
    7. Incline as lâminas para remover o líquido e adicione 150 μL de fragmentos anti-DIG Fab conjugados à fosfatase alcalina em uma diluição de 1:2.000 em solução de bloqueio. Cobrir com uma lamínula de vidro ou parapelícula e incubar na câmara húmida a 4 °C durante 16 h.
  3. Dia 3: Desenvolvimento da cor
    1. Remova cuidadosamente as lamínulas ou parafilme dentro de um frasco com MABT (como na etapa 5.2.2) e incube as lâminas em MABT por 30 min em temperatura ambiente.
    2. Lave com MABT mais três vezes por 30 min cada.
    3. Lavar com MAB (tampão ácido maleico; ácido maleico 0,1 M, cloreto de sódio 0,15 M, pH 7,5) (Tabela 1) durante 30 min.
    4. Lave duas vezes com NTM (tampão NaCl-Tris-MgCl2 ; 100 mM Tris-HCl pH 9,5, 100 mM de cloreto de sódio, 50 mM de cloreto de magnésio) (Tabela 1) por 10 min cada.
    5. Adicione a solução de coloração (0,45 μL / mL de cloreto de tetrazólio azul de 4-nitro, 3,5 μL / mL de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolil p-toluidina em NTM) (Tabela 1) ao frasco de coloração e mergulhe as lâminas na solução. Cubra o frasco com papel alumínio e deixe a cor evoluir durante a noite a 37 °C.
  4. Dia 4: Contracoloração e montagem
    1. Lave as lâminas três vezes com PBS em temperatura ambiente por 10 min cada.
      NOTA: Certifique-se de que a solução de coloração seja descartada adequadamente como resíduo halógeno.
    2. Monte as lâminas como estão, adicionando gotas de um meio de montagem aquoso e cobrindo as seções com uma lamínula de vidro. Alternativamente, prossiga para a contracoloração nuclear vermelha rápida ou azul Alcian.
    3. Limpe o excesso de PBS e adicione 500 μL de uma solução de contracoloração nuclear de vermelho rápido nucleara 0,1% 41 (Tabela 1) sobre as seções e incube as lâminas em uma câmara úmida por 10 min. Dica para remover o excesso de vermelho rápido nuclear e proceder à desidratação (passo 5.4.5).
    4. Mergulhe as seções em solução de azul de Alcian a 0,5% (contracoloração de cartilagem)42 por 10 min; Enxágüe em água destilada e incube em ácido fosfomolíbdico a 1% por 10 min. Enxágüe com água novamente e prossiga para a desidratação.
      NOTA: Se a lavagem com ácido fosfomolíbdico for omitida, o azul de Alcian torna-se uma contracoloração nuclear.
    5. Desidratar em etanol 70/95/100/100% por 5 min cada.
    6. Lavar com xileno três vezes durante 5 minutos de cada vez num exaustor.
    7. Monte com um meio de montagem à base de xileno e lamínulas de vidro.
    8. Deixe as lâminas secarem por pelo menos 16 h em uma capela de exaustão.

6. Aquisição de imagem

  1. Depois que as lâminas montadas estiverem completamente secas, examine todas as seções quanto à presença de células humanas enxertadas usando um microscópio de campo claro vertical (Figura 4E). Procure por células Alu-positivas azul-púrpura (Figura 4F, G) e marque as seções contendo células Alu-positivas usando uma caneta marcadora (Figura 4E).
    NOTA: Marcar as seções com células Alu-positivas tornará mais fácil encontrá-las ao fotografá-las e comparar lâminas adjacentes coradas com outros marcadores.
  2. Tome cuidado para fotografar cortes contendo o xenoenxerto na mesma ordem em que sua colocação na lâmina (direção ântero-posterior). Nomeie cada foto com todas as informações relevantes, como [data do xenoenxerto]_[tipo de célula]_[idade embrionária]_[tipo de sonda]_[número da seção]_001. Inclua arquivos de metadados para adicionar a barra de escala posteriormente.
  3. Se outras lâminas da mesma série forem coradas com outro marcador, por exemplo, hibridização in situ de RNA ou imuno-histoquímica, fotografe e nomeie as seções adjacentes (Figura 6) da mesma maneira.

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Resultados

Identificação de ADSCs Alu-positivas em cortes histológicos
As sequências de Alu são elementos repetitivos que compreendem ~ 10% do genoma humano e, portanto, são excelentes alvos para identificar células humanas de maneira específica da espécie43. A hibridização in situ com sondas de DNA pode ser usada para identificar elementos genômicos em cortes histológicos, incluindo células humanas primárias 29,30,40,44,45,46....

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Discussão

O protocolo aqui descrito (Figura 1) apresenta uma opção viável para a triagem do comportamento de populações primárias de células humanas in vivo, utilizando embriões de galinha como modelo. Este artigo descreve a formação de esferoides celulares (Figura 2), transplante do esferóide para o embrião de pintinho (Figura 3), processamento de espécimes e hibridização in situ (

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ para J.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq para J.B.) e Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ para J.B.). Agradecemos a T. Jaffredo (CNRS, Paris, França) pela sonda Runx2 (Cbfa1). O anticorpo HNK1 foi obtido do Banco de Hibridoma de Estudos de Desenvolvimento desenvolvido sob os auspícios do NICHD e mantido pela Universidade de Iowa, Departamento de Ciências Biológicas, Iowa City, IA 52242 EUA. Agradecemos a V. Moura-Neto por conceder acesso ao micrótomo e a R. Lent por conceder acesso ao microscópio. Agradecemos a E. Steck pela ajuda na síntese das sondas Alu .

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Animais
Gallus gallus ovosGranja TolomeiSPF-freeWhite leghorn chicken
Reagents
Alcian Blue 8GXSigma-aldrichA5268
AluFw primersSigma-aldrichOLIGO5'-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3'
Primers AluRevSigma-aldrich OLIGO5'-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3'
Sulfato de alumínioSigma-aldrich368458para preparação de solução vermelha rápida nuclear
Anti-Digoxigenina-AP, fragmentos de FabRoche11093274910Identificação do registro de anticorpos: AB_514497
Anticorpo anti-humano Natural Killer 1 (HNK1, CD57)Estudos de desenvolvimento Banco de hibridoma3H5ID de registro de anticorpos:
AB_2314644 Anti-camundongo, cabra IgM-HRPSanta Cruz Biotecnologiasc-2973ID do registro de anticorpos: AB_650513
Anti-mouse, cabra IgG (H + L) -HRPNovexG-21040do registro do anticorpo: AB_2536527
anticorpo anti-músculo liso Actin/ACTA2DakoM085129ID do registro do anticorpo: AB_2811108
AquatexMerck 1085620050Agente de montagem aquosa
5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato sal de p-toluidina (BCIP)Sigma-aldrichB8503-100MG
reagente de bloqueioRoche11096176001
ácido cítricoVETEC238Para preparação de tampão SSC
colagenase tipo IASigma-aldrichSCR103
dCTP, dGTP, dATP, dTTP conjuntoRoche11969064001
Denhardt solução 50XInvitrogen750018Para preparação de tampão de hibridização
Sal de sódio de sulfato de dextranoThermo Scientific15885118Para preparação de tampão de hibridização
Mistura de rotulagem de RNA DIG Roche11277073910Contém Dig-11-dUTP
DMEM de baixa glicoseSigma-aldrichD5523
3,3′-Diaminobenzidina tetracloridrato (DAB)Sigma-aldrichD5905-50TAB
N,N-Dimetilformamida (DMF)Sigma-aldrich227056Para preparação de solução NBT e BCIP
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Sigma-aldrichE6758Para preparação de solução de tripsina
Entellan novoMerck107961Meio de montagem não aquoso
Etanol Proquí miosN/A
Soro bovino fetalThermoFisher12657029Inativar a 56 ° C antes de usar
solução de formaldeído a 37%Proquí miosN/A
FormamidaVetecV900064
Ácido acético glacialProquí miosN/A
Tinta da ÍndiaPelikan221143
solução de L-glutamina (200 mM)Gibco25030-149
Cloreto de magnésioMerck8147330100Para preparação de tampão NTM
Ácido maleicoSigma-aldrichM0375-500GPara preparação de tampão MAB
MetanolProquí mios
Soro de Cabra NormalSigma-aldrichNS02LInativar a 56 ° C antes do uso
4-Nitro cloreto de tetrazólio azul (NBT)Roche11585029001
Nuclear vermelho rápidoSigma-aldrich60700
Paraplast PlusSigma-aldrichP3558
Penicilina G sal de sódioSigma-aldrichP3032
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Sigma-aldrichP3813
Ácido fosfomolíbdicoMerck100532
Proteinase KGibco BRL25530-015
DNA de esperma de salmãoInvitrogen15632011Para preparação de tampão de hibridização
Cloreto de sódioSigma-aldrichS9888Para preparação de tampão SSC, MAB e NTM
Sulfato de estreptomicinaSigma-aldrichS6501
Kit Taq PolimeraseCenbiot EnzimasN/A
Tris-HClSigma-aldrichT5941
TripsinaSigma-aldrichT4799
Tween 20Sigma-aldrichP1379
XilenoProquí miosN/A
Microscópio e equipamentos
Axioplan microscópio verticalCarl Zeiss MicroscopyN/A
Software AxiovisionCarl Zeiss MicroscopyN/A
Incubadora de célulasThermoForma3110
Incubadora de ovos - 50 ovosGP
Lâmpada pescoço de gansoBiocamN/APara manipulação de ovos
Fiji software; Cell Counter pluginImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Capa de fluxo laminarTROX1385
Nanodrop LiteThermo ScientificND-LITE-PR
Micrótomo rotativoLeica BiosystemsRM2125 RTSPara seccionamento
EstereomicroscópioLabomedLuxeo 4DPara manipulação
de ovosForno de esterilizaçãoREALIS7261690Para esterilização de materiais
cirúrgicosConsumíveis
0,2 mL (PCR) tubos de centrífuga de polipropilenoEppendorf30124707
tubos de centrífuga cônicos de polipropileno de 15 mL CorningCLS430791
tubos de centrífuga de polipropileno de 1,5 mLAxygenMCT-150-C
Tubos de centrífuga de polipropileno de 2 mLAxygenMCT-200-C
Tubos de centrífuga cônicos de polipropileno de 50 mL Pontasde CLS430829Corning
, 200 μ Tamanho LInvitrogenAM12655Para manipulação de ovos
Bloco de vidro escavado (Bloco de coloração) com vidro de coberturaHecht Karl42020010
de incorporaçãoSimportM480Usado como suporte de bloco de parafina
Lâminas de cobertura de vidro, 24 x 40 mmKasviK5-2440
Pipetas de vidro Pasteur 230 mmNORMAX5426023Para a preparação de capilares de vidro
Lâminas de micrótomoLeica BiosystemsHIGH-PROFILE-DISPOSABLE-BLADES-818Para seccionamento
Parafilm MParafilmP7793
Placa de Petri de plástico, 30 mmKasviK13-0035Para manipulação de ovos
Placa de Petri de plástico, 60 mmProlab0303-8Para preparação de esferóides celulares. Não deve ser tratado para adesão celular. 
Lâminas de vidro silanizadas (Starfrost)Knittel Glass198Para seccionamento
Seringa 1 mL , Agulhas 26 G (0,45 x 13 mm)Descarpack32972Para manipulação de ovos (aspiração de albumina)
Ferramentas cirúrgicas
Tubo de aspiraçãoDrummond2-000-000Para manipulação de ovos
Tesoura dedissecçãoFerramentas de Ciência Fina14061-11Para manipulação de ovos
Microfórceps (pinças)Ferramentas de Ciência Fina00108-11Para manipulação de ovos e preparação de capilares de vidro
Suporte de agulha (mandril de agulha de dissecção ajustável)Fisherbrand8955Para manipulação de ovos
Pedra de amolar de óleo, grão 10.000N/AN/APara afiar agulhas
Par de pequenas pincéisN/AN/APara manusear seções de parafina. Qualquer marca pode ser usada.
Agulhas de costuraN/AN/APara afiar em microbisturis. Qualquer marca pode ser usada.
Bisturi descartável estéril nº 23Swann-Norton110Para seccionamento
Cabo de bisturi cirúrgicoSwann-Norton914Para seccionamento
Tesoura de íris Wecker, afiada/afiadaSurtexSS-641-11Para manipulação de ovos
ID de barreira (filtro)

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