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Artigo de método

Injeção de células osteossarcoma intratibiais para gerar modelos de osteossarcoma ortotópico e metástase pulmonar

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DOI:

10.3791/63072

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28 de outubro de 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of theory and therapy of muscles and bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O presente protocolo descreve a injeção de célula de osteossarcoma intratibia para gerar modelos de camundongos com osteossarcoma ortotópico e lesões de metástase pulmonar.

Resumo

O osteossarcoma é o câncer ósseo primário mais comum em crianças e adolescentes, sendo os pulmões o local metastático mais comum. A taxa de sobrevivência de cinco anos de pacientes com osteossarcoma com metástase pulmonar é inferior a 30%. Portanto, a utilização de modelos de camundongos imitando o desenvolvimento do osteossarcoma em humanos é de grande importância para a compreensão do mecanismo fundamental da osteossarcoma carcinogênese e metástase pulmonar para desenvolver novas terapêuticas. Aqui, procedimentos detalhados são relatados para gerar os modelos primários de osteossarcoma e metástase pulmonar através da injeção de intratibia de células osteossarcoma. Combinados com o sistema de bioluminescência ou imagem viva de raios-X, esses modelos de camundongos vivos são utilizados para monitorar e quantificar o crescimento e a metástase do osteossarcoma. Para estabelecer esse modelo, uma matriz de membrana de porão contendo células osteossarcoma foi carregada em uma seringa de micro volume e injetada em uma tíbia de cada rato atímico após ser anestesiada. Os camundongos foram sacrificados quando o osteossarcoma primário atingiu a limitação de tamanho no protocolo aprovado pela IACUC. As pernas com osteossarcoma e os pulmões com lesões de metástase foram separados. Esses modelos são caracterizados por um curto período de incubação, crescimento rápido, lesões graves e sensibilidade no monitoramento do desenvolvimento de lesões metastáticas primárias e pulmonares. Portanto, estes são modelos ideais para explorar as funções e mecanismos de fatores específicos na carcinogênese osteossarcoma e metástase pulmonar, o microambiente tumoral e avaliar a eficácia terapêutica in vivo.

Introdução

O osteossarcoma é o câncer ósseo primário mais comum em crianças e adolescentes 1,2, que se infiltra principalmente no tecido circundante, e até mesmo metástase nos pulmões quando os pacientes são diagnosticados. A metástase pulmonar é o principal desafio para a terapia osteossarcoma, e a taxa de sobrevivência de cinco anos de pacientes com osteossarcoma com metástase pulmonar permanece tão baixa quanto 20%-30%3,4,5. No entanto, a taxa de sobrevivência de cinco anos de osteossarcoma primário foi aumentada para cerca de 70% desde a década de 1970 devido à introdução da quimioterapia6. Portanto, é urgentemente necessário entender o mecanismo fundamental da osteossarcoma carcinogênese e metástase pulmonar para desenvolver novas terapias. A aplicação de modelos de camundongos que melhor imitam a progressão do osteossarcoma em humanos é de grande significado7.

Os modelos animais osteossarcoma são gerados por engenharia genética espontânea e induzida, transplante e outras técnicas. O modelo de osteossarcoma espontâneo raramente é utilizado devido ao longo tempo de formação do tumor, taxa de ocorrência de tumor inconsistente, baixa morbidade e baixa estabilidade 8,9. Embora o modelo de osteossarcoma induzido seja mais acessível para obter do que o osteossarcoma espontâneo, a aplicação do modelo osteossarcoma induzido é limitada porque o fator indutor afetará o microambiente, a patogênese e características patológicas da osteossarcoma10. Modelos transgênicos estão ajudando a entender a patogênese dos cânceres, pois podem simular melhor os ambientes fisiológicos e patológicos humanos; no entanto, os modelos animais transgênicos também têm suas limitações devido à dificuldade, a longo prazo e alto custo de modificação transgênica. Além disso, mesmo nos modelos de animais transgênicos mais amplamente aceitos gerados pela modificação genética p53 e rb, apenas 13,6% do sarcoma ocorreu nos ossos de quatro membros11,12.

O transplante é um dos métodos de produção de câncer metastáticos primários e distantes mais utilizados nos últimos anos devido à sua manobra simples, taxa de formação de tumores estáveis e melhor homogeneidade13. O transplante inclui transplante heterotópico e transplante ortotópico de acordo com os locais de transplante. No transplante heterotópico osteossarcoma, as células osteossarcoma são injetadas fora dos sítios osteossarcoma primários (osso) dos animais, comumente sob a pele, subcutâneamente14. Embora o transplante heterotópico seja simples sem a necessidade de realizar cirurgia em animais, os locais onde as células osteossarcoma são injetadas não representam o microambiente osteossarcoma humano real. Transplante ortotópico osteossarcoma é quando as células osteossarcoma são injetadas nos ossos dos animais, como a tíbia15,16. Em comparação com os enxertos heterotópicos, os enxertos de osteossarcoma ortotópicos são caracterizados por um curto período de incubação, crescimento rápido e forte natureza erosiva; portanto, são modelos animais ideais para estudos relacionados ao osteossarcoma17.

Os animais mais usados são camundongos, cães e zebrafish18,19. O modelo espontâneo de osteossarcoma é geralmente usado em caninos porque o osteossarcoma é um dos tumores mais comuns em caninos. No entanto, a aplicação desse modelo é limitada devido ao longo tempo de formação do tumor, à baixa taxa de tumorigênese, à má homogeneidade e à estabilidade. Zebrafishes são frequentemente usados para construir modelos de tumor transgênicos ou nocaute por causa de sua reprodução rápida20. Mas os genes dos zebrafish são diferentes dos genes humanos, então suas aplicações são limitadas.

Este trabalho descreve os procedimentos detalhados, precauções e imagens representativas para a produção do osteossarcoma primário na tíbia com metástase pulmonar por injeção intratibia de células osteossarcoma em camundongos atrímicos. Este método foi aplicado para criar o osteossarcoma primário na tíbia do camundongo para avaliação da eficácia terapêutica, que apresentou alta reprodutibilidade21,22.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo comitê de bem-estar animal da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai. Camundongos atrímicos balb/c machos de quatro semanas de idade foram aclimatados por uma semana antes da cirurgia para injeção ortotópica de células osteossarcoma. Os camundongos foram alojados em gaiolas de camundongos ventiladas individualmente com cinco ratos por gaiola em um ciclo claro/escuro de 12 horas com acesso ad libitum à alimentação spf e água estéril.

1. Preparação de células

  1. No dia da injeção de célula osteossarcoma (143B-Luciferase), lave 80%-90% de células confluentes cultivadas em um prato de cultura celular de 10 cm duas vezes com PBS (pH 7.4) e trypsinize com 1,5 mL de trippsina de 0,25% para 3 min. Em seguida, adicione 6 mL de mídia mem contendo soro de 10% para saciar a trippsina e colete as células em um tubo de centrífuga de 15 mL.
    NOTA: A linha celular 143B-Luciferase é obtida a partir de transfeto de linha celular 143B com vetor pLV-luciferase23.
  2. Aspire 20 μL de suspensão celular na câmara da placa de contagem celular e calcule a concentração celular usando um contador automático de células (ver Tabela de Materiais).
  3. Centrifugar as células a 800 x g por 5 min a temperatura ambiente.
  4. Aspire o supernaente com uma pipeta e resuspenme a pelota celular em uma matriz de membrana de porão de 8,5 mg/mL (ver Tabela de Materiais) a uma concentração final de 2 x 107 células/mL.
  5. Mantendo as células no gelo, leve-as para a sala de cirurgia. As células devem ser usadas dentro de 2 h.
    NOTA: Para evitar doses imprecisas de injeção (por exemplo, devido ao espaço morto nas seringas), uma suspensão celular extra é preparada (geralmente duas vezes o volume necessário de suspensão celular). A matriz de membrana do porão é mantida no gelo o tempo todo, uma vez que tem propriedade de coagulação acima da temperaturaambiente 24.

2. Cirurgia para injeção ortotópica das células osteossarcoma

NOTA: As ferramentas de cirurgia são mostradas na Figura 1.

  1. Os camundongos foram criados em condições específicas sem patógenos. Todos os procedimentos foram feitos em um armário asséptico com ferramentas estéreis.
  2. Anestesiar os camundongos expondo-os a 2% de isoflurane e 98% de oxigênio (taxa de fluxo de oxigênio, 2 L/min).
  3. Aplique uma pequena quantidade de pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento enquanto estiver sob anestesia.
    NOTA: Realize todo o procedimento em uma área bem ventilada. Antes da injeção de células osteossarcoma, certifique-se de que cada rato esteja sob anestesia profunda por uma pitada de dedo do dedo do dedo; se o mouse ainda tiver respostas, como contração ou empurrão, espere por um longo tempo até que as respostas acima desapareçam.
  4. Mantenha cada rato em uma posição supina. Segure o tornozelo do rato usando o polegar e o dedo indicador e desinfete o local de injeção da tíbia com um cotonete de 70% de etanol.
    NOTA: Para segurar firmemente o tornozelo do rato, tanto as pontas do polegar quanto do dedo indicador são de grande importância para os procedimentos subsequentes.
  5. Gire a articulação do tornozelo de cada rato para fora para mover a tíbia e a fíbula, e dobre a articulação do joelho para uma posição adequada até que o planalto da tíbia proximal (a parte superior da tíbia) seja claramente visível através da pele (Figura 2A).
  6. Coloque a agulha em uma seringa de 1 mL e aponte a ponta da agulha para o local da injeção. Certifique-se de que a agulha da seringa é paralela ao longo eixo da tíbia.
    1. Insira percutâneamente a agulha através ou adjacente ao ligamento patelar à medida que passa pela cápsula da pele/articulação; th0en, gire a seringa (1/2 a 3/4-círculo) para perfurar um orifício através da plataforma tíbia em direção à extremidade distal da tíbia (cavidade medular) para injeção de célula osteossarcoma com uma seringa de micro volume (Figura 2B,C).
      NOTA: A rotação simultânea da tíbia pode ser sentida durante a perfuração se a ponta da agulha estiver precisa. Certifique-se de que a necessidade se move para a frente com a rotação da seringa em vez de ser diretamente empurrada para a frente até que cerca de metade da agulha esteja na tíbia.
  7. Verifique se a agulha da seringa fez um movimento proeminente no canal medular para garantir a perfuração bem sucedida.
    NOTA: Realize um exame de raio-X (ver Tabela de Materiais) para confirmar a posição adequada da agulha e coletar as imagens.
  8. Carregue a suspensão celular osteossarcoma 143B (a partir da etapa 1.5) em uma seringa de micro volume e substitua a seringa de 1 mL na tíbia com a seringa de micro volume carregada por células 143B (Figura 2D). Injete lentamente ~10 μL (ignore a solução pré-existente na agulha) de suspensão celular de 143B na tíbia de cada rato atrímico (cerca de 2 x 105 células) sem aplicar alta pressão.
  9. Pressione o local da injeção com um cotonete para 20-30 s quando a seringa de micro volume for removida.
  10. Coloque cada rato de volta em uma gaiola limpa e monitore de perto até que o rato esteja completamente recuperado da anestesia (cerca de 10 min).
  11. Monitore o crescimento do tumor in vivo usando um sistema de imagem de raios-X. Meça o diâmetro mais longo (a) e o diâmetro curto (b) da massa cancerígeno toda semana com uma pinça para cálculo de volume de tumor (V): V = 1/2 x a x b2.
    NOTA: Anestesiar os camundongos expondo-os a 2% de isoflurano e 98% de oxigênio. Os camundongos foram anestesiados para imagens de raio-x. A injeção intratibia de células osteossarcoma rotuladas por proteínas intratibia ou fluorescentes permite o rastreamento de lesões osteossarcoma primárias e metastáticas.
    NOTA: Os pontos finais humanos dos camundongos com osteossarcoma devido ao crescimento tumoral do joelho e da metástase pulmonar basearam-se nos seguintes critérios: (1) Escore da Condição Corporal, (2) limiar de perda de peso de 20%, (3) diâmetro máximo médio dos tumores de 2 cm, ou (4) comportamento animal severamente limitado.

3. Exame patológico (coleta de amostras de osteossarcoma metastático primário e pulmonar para análise)

  1. Seis semanas após a injeção de células de osteossarcoma, sacrifique os camundongos por luxação cervical depois de expô-los por inalação de CO2 .
  2. Mantenha o mouse em uma posição supina e estique os dois membros traseiros.
  3. Separe as pernas inteiras com osteossarcoma da área inguinal.
    NOTA: Certifique-se de que todas as pernas estão separadas do mesmo local anatômico.
  4. Prepare o espécime histológico das pernas com osteossarcoma removendo a pele, músculos e pés, e, em seguida, fixe o espécime de cada rato em um tubo de 50 mL com solução de formalina de 20 mL (10%) por 24 h, seguido de decalcificação em solução 10% EDTA por 14 dias com troca de tampão ocasional.
  5. Incorpore o espécime em parafina e prepare seções para exame histológico após o trabalho publicado anteriormente25.
  6. Separe suavemente os pulmões e coloque-os em um tubo de 50 mL cheio de solução de formalina de 20 mL (10%). Após 24 horas, transfira os pulmões de cada rato para um tubo de 15 mL com 70% de etanol. Incorpore os pulmões em parafina para hematoxylin e eosin (H&E) de coloração e ensaio imunohistoquímico25.

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Resultados

Modelos pulmonares ortotópicos (primários) bem sucedidos (primários) e metastáticos dependem da injeção ortotópica precisa das células osteossarcoma. Aqui, um modelo ortotópico (primário) de osteossarcoma através da injeção de célula osteossarcoma intratibial foi desenvolvido com sucesso. A Figura 3A mostra um rolamento ortotópico representativo (primário) osteossarcoma, e a Figura 3B mostra um representante isolado ortotópico (primário) osteossarcoma. ...

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Discussão

A injeção ortotópica de células osteossarcoma é um modelo ideal para estudar a função e o mecanismo de fatores específicos na carcinogênese e desenvolvimento da osteossarcoma para avaliar a eficácia terapêutica. Para evitar diferenças no crescimento do tumor, a maioria das células de osteossarcoma ativas a 80%-90% confluentes com o mesmo número são cuidadosamente injetadas na tíbia de cada rato, e o tempo de experimentação celular é estritamente controlado sem afetar a viabilidade celular. Como as aglomerações celulares ...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado por bolsas do (1) Programa Nacional de P&D da China (2018YFC1704300 e 2020YFE0201600), (2) National Nature Science Foundation (81973877 e 82174408).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Contador automático de célulasShanghai Simo Biological Technology Co., LtdIC1000Contando células
Máquina de anestesiaShenzhen RWD Life Technology Co., LtdR500IPO equipamento de camundongos
de anestesia BALB/c camundongos atímicosShanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd./animal
Matriz de membrana basalShanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd356234, BD, Matrigelressuspende células
Sistema de imagem de bioluminescênciaShanghai Baitai Technology Co., LtdVieworksrastreando o crescimento do tumor e metástase pulmonar, se a célula de injeção for marcada por luciferase
Tubo de centrífuga (15 mL)Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd  430790, CorningCentrifuge as células
isofluranoShenzhen RWD Life Technology Co., LtdVETEASYAnesthesia mice
MEM mediaShanghai YueNian Biotechnology Co., LtdLM-E1141Meio de cultura de células
Seringa de microvolumeShanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd0-50 μ LInjete células precisas na tíbia
Solução salina tamponada com fosfatoBeyotime BiotechnologyST447lave as células do osteossarcoma humano
Seringas de 1 mlShandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd20200411perfuração
da linha celular 143BATCCCRL-8303linha celular de osteossarcoma
Tripsina (0,25%)Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd25200056, tratamentode tripsina Gibco de células
Trypan blueBeyotime BiotechnologyST798Células de coloração para avaliar o
vetor de atividade (pLV-luciferase)Shanghai YueNian Biotechnology Co., LtdVL3613
Plasmid Lipofectamine 2000Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd11668027, Thermofisher Plasmid transfecção reagente
de raios-X sistemaBrook (Beijing) Technology Co., LtdImagensde raios-X FX PRO foram obtidas para detectar o crescimento do tumor

Referências

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