Imagem ao vivo do Estado De Glutathione Mitocondrial Redox em Neurônios Primários usando um Indicador Ratiométrico

Várias enzimas mitocondriais importantes e moléculas de sinalização estão sujeitas à regulação de thiol ^redox1. Além disso, as mitocôndrias são uma grande fonte celular de espécies reativas de oxigênio e são seletivamente vulneráveis a danos ^oxidativos2. Assim, o potencial mitocondrial redox afeta diretamente bioenergésicos, sinalização celular, função mitocondrial e, finalmente, viabilidade ^celular3,4. A matriz mitocondrial contém altas quantidades (1-15 mM) da glutationa tampão de tampo de tiol-dissulfeto (GSH) para manter a homeostase redox e montar defesas ^{antioxidantes5,6}. O GSH pode ser covalentemente ligado a proteínas-alvo (S-glutathionylation) para controlar seu status e atividade redox e é usado por uma gama de enzimas desintoxificantes que reduzem proteínas oxidadas. Portanto, o potencial mitocondrial glutathione redox é um parâmetro altamente informativo ao estudar a função mitocondrial e a fisiopatologia.

roGFP2 é uma variante de GFP que foi tornada sensível ao redox pela adição de dois cisteínas expostas à superfície que formam um par de dithiol-dissulfeto ^{artificial7,8}. Tem um único pico de emissão em ~510 nm e dois picos de excitação em ~400 nm e 490 nm. É importante ressaltar que as amplitudes relativas dos dois picos de excitação dependem do estado redox do roGFP2 (Figura 1), tornando esta proteína um sensor ratiométrico. No sensor Grx1-roGFP2, a glutaredoxina humana-1 (Grx1) foi fundida ao N-terminus de roGFP29,10. O acessório covalent da enzima Grx1 ao roGFP2 proporciona duas grandes melhorias do sensor: torna a resposta do sensor específica para o par de glutationa redox GSH/GSSG (Figura 1), e acelera o equilíbrio entre GSSG e roGFP2 por um fator de pelo menos 100.0009. Portanto, o Grx1-roGFP2 permite imagens específicas e dinâmicas do potencial de glutationa celular redox.

As imagens grx1-roGFP2 podem ser realizadas em uma ampla gama de microscópios, incluindo microscópios de fluorescência de campo largo, microscópios confocal de disco giratório e microscópios confocal de varredura a laser. A expressão do sensor nos neurônios primários pode ser alcançada por vários métodos que incluem lipofecção11, coprecipitação de DNA/cálcio-fosfato12, transferência genética mediada por vírus ou uso de animais transgênicos como fonte celular (Figura 2). Vírus adeno associados a adeninantes pseudotipados (rAAV) contendo uma razão de 1:1 de proteínas capsidas AAV1 e AAV2 ^13,14 foram utilizados para os experimentos neste artigo. Com este vetor, a expressão do sensor máximo é tipicamente atingida de 4 a 5 dias após a infecção e permanece estável por pelo menos duas semanas. Usamos com sucesso Grx1-roGFP2 em neurônios hipocampais e corticais primários de ratos e ratos.

Neste artigo, a expressão mediada por rAAV de Grx1-roGFP2 com metas de mitocôndrias em neurônios hipocampais e corticais de ratos primários é usada para avaliar o estado de glutationa mitocondrial basal e sua perturbação aguda. Um protocolo é fornecido para imagens ao vivo confocal com instruções detalhadas sobre como (i) otimizar as configurações do microscópio confocal de varredura a laser, (ii) executar um experimento de imagem ao vivo e (iii) analisar dados com FIJI.

Todos os experimentos em animais se conformaram com as diretrizes nacionais e institucionais, incluindo a Diretiva do Conselho 2010/63/UE do Parlamento Europeu, e tiveram aprovação ética plena do Home Office (Escritório de Bem-Estar Animal da Universidade de Heidelberg e Regierungspraesidium Karlsruhe, licenças T14/21 e T13/21). Os neurônios hipocampais primários e corticais foram preparados a partir de filhotes de camundongos recém-nascidos ou ratos de acordo com os procedimentos padrão e foram mantidos por 12-14 dias como descrito ^{anteriormente13}.

1. Preparação de soluções

1. Soluções de estoque para buffer de imagem
   1. Prepare cada solução de estoque de acordo com a Tabela 1 e mantenha-as a 4 °C. Para armazenamento a longo prazo (>3 meses), mantenha as alíquotas a -20 °C.

Tabela 1: Soluções de estoque para tampão de imagem.

2. Soluções de estoque de drogas e corantes
   1. Dissolver diamide (DA; utilizado para calibração da proporção máxima de 405:488) na água para obter uma solução de estoque de 0,5 M (por exemplo, 1 g em 11.615 mL de água). Aliquot e armazenar a -20 °C.
   2. Dissolver dithiothreitol (DTT; usado para calibração de proporção mínima de 405:488) na água para obter uma solução de estoque de 1 M (por exemplo, 5 g em 32.425 mL de água). Aliquot e armazenar a -20 °C por uma máxima de 3 meses.
   3. Dissolver n-metil-d-aspartato (NMDA; usado para induzir excitotoxicidade e oxidação mitocondrial) na água para obter uma solução de estoque de 10 mM (por exemplo, 25 mgs em 16.991 mL de água). Armazene as alíquotas a -20 °C. Para armazenamento a longo prazo (>6 meses), mantenha as alíquotas em -80 °C.
   4. Tetrametilrhodamina e ester ester (TMRE; um indicador de pequena molécula do potencial da membrana mitocondrial)
      1. Dissolver o pó TMRE em metanol para obter um estoque de 20 mM (por exemplo, 25 mgs em 2,427 mL de metanol).
      2. Diluir as ações de 20 mM 1:1.000 em metanol para obter um estoque de 20 μM.
      3. Aliquot as soluções de estoque de 20 mM e 20 μM, vedação com parafilm e armazene protegido contra luz a -20 °C.
         NOTA: Ambas as soluções de estoque estão estáveis por vários anos. Use a solução de estoque de 1.000x (20 μM) para experimentos.
3. Tampão de imagem
   1. Prepare 100 mL de tampão de imagem adicionando todos os componentes da Tabela 2 a 80 mL de água estéril em um cilindro de medição. Leve o volume até 100 mL com água estéril. Misture sacudindo cuidadosamente o cilindro de medição até que a solução pareça homogênea.
      NOTA: Recomenda-se usar um osmômetro para verificar a osmolaridade do buffer. Deve ser o mais próximo possível do meio de crescimento das células. Aqui, este é 315 mOsmol/L. Aumente ou diminua a concentração de sacarose conforme necessário para corresponder à osmolaridade do tampão de imagem e meio de crescimento.
   2. Ajuste o pH para 7,4. Faça alíquotas e mantenha-as a 4 °C por até duas semanas. Para armazenamento a longo prazo, mantenha as alíquotas a -20 °C. Deixe o tampão de imagem atingir a temperatura ambiente antes de usar.

Tabela 2: Composição do tampão de imagem. Os volumes indicados são utilizados para a preparação de 100 mL de tampão de imagem.

4. Soluções para estimulação e calibração
   NOTA: Prepare sempre soluções de estimulação frescas adicionando soluções de estoque de medicamentos indicados ao buffer de imagem pouco antes do experimento. As soluções para estimulação e calibração serão adicionadas à câmara de imagem sequencialmente durante um experimento (ver seções 3-5). Dependendo do tipo de experimento, diferentes soluções são necessárias para atingir a mesma concentração final no respectivo volume final na câmara de imagem.
   1. Prepare a solução 3x NMDA (90 μM; concentração final na câmara: 30 μM) adicionando 63 μL de um estoque NMDA de 10 mM a 6.937 mL de tampão de imagem. Adicione 500 μL da solução resultante à câmara (volume final: 1,5 mL).
   2. Prepare a solução 2x DA para as etapas 3 e 4 (1 mM; concentração final na câmara: 0,5 mM) adicionando 14 μL de um estoque de 0,5 M DA a 6,986 mL de tampão de imagem. Adicione 1 mL à câmara (volume final: 2 mL).
   3. Prepare a solução 4x DA para a etapa 5 (2 mM; concentração final na câmara: 0,5 mM) adicionando 28 μL de um estoque da DA de 0,5 M a 6,972 mL de tampão de imagem. Adicione 500 μL à câmara (volume final: 2 mL).
   4. Prepare a solução 1x DTT (5 mM; concentração final na câmara: 5 mM) adicionando 45 μL de 1 M DTT de estoque a 8955 μL de tampão de imagem. Adicione 1 mL desta solução à câmara após aspirar o tampão de imagem (volume final: 1 mL).

2. Carregamento de células com TMRE

NOTA: Neste protocolo, o TMRE é usado no modo não-saciar15 a uma concentração final de 20 nM. Em geral, deve ser utilizada a menor concentração possível de TMRE que ainda forneça intensidade de sinal suficiente no microscópio de escolha. Devido à evaporação desigual, o volume de médios em diferentes poços pode diferir em culturas primárias de longo prazo. Para garantir uma concentração de TMRE consistente em todos os poços, não adicione TMRE diretamente aos poços. Em vez disso, substitua o meio em cada poço com a mesma quantidade de meio contendo TMRE. O protocolo abaixo é projetado para neurônios primários em placas de 24 poços contendo ~1 mL de médio por poço.

1. Trabalhando em uma cultura de tecido laminar flow hood, coletar 500 μL de meio de cada poço em um único tubo cônico.
2. Por bem, adicione 0,5 μL de 20 μM de estoque de TMRE no tubo cônico (por exemplo, 12 μL para 24 poços).
3. Aspire cuidadosamente o meio restante do primeiro poço e substitua-o por 500 μL de meio contendo TMRE. Continue, bem por bem, com os poços restantes.
   NOTA: Tome cuidado para não deixar as células secarem e não perturbar as células.
4. Devolva as células à incubadora e espere pelo menos 60 min para o equilíbrio do corante.
   NOTA: O tempo de carregamento pode ser estendido para várias horas sem efeitos adversos.
5. Para garantir concentrações e equilíbrio consistentes de TMRE durante todo o experimento de imagem, certifique-se de incluir uma concentração final de 20 nM TMRE no buffer de imagem e todas as soluções de estimulação.

3. Otimização das configurações do microscópio confocal de digitalização

NOTA: Esta etapa visa encontrar o melhor compromisso entre a qualidade da imagem e a viabilidade celular durante a imagem ao vivo. Esta seção descreve a otimização das configurações para imagens roGFP. Se for realizada uma imagem multiparamétrica, uma otimização semelhante, incluindo a verificação de uma linha de base estável sem sinais de branqueamento ou fototoxicidade, precisa ser realizada para os indicadores adicionais.

1. Inicie o microscópio confocal e as configurações padrão de carga para imagens GFP (excitação de 488 nm, emissão de 505 - 550 nm).
2. Coloque o detector em 12 bits ou 16 bits.
   NOTA: Normalmente, 8 bits não são suficientes para imagens quantitativas.
3. Ative o modo de varredura sequencial e adicione segunda sequência/faixa (excitação de 405 nm, emissão de 505 a 550 nm).
4. Para ambos os canais, selecione uma tabela de pesquisa pseudocolorida que indique pixels sobre e abaixo expostos (por exemplo, GLOW OU).
5. Selecione um objetivo adequado para o objeto de interesse.
   NOTA: 10x-40x são adequados para análise unicelular, 63x-100x são adequados para análise de mitocôndria única.
6. Monte uma mancha de cobertura com células na câmara de imagem, adicione 1 mL de tampão de imagem e coloque a câmara no microscópio.
7. Use a ocular e a luz transmitida para concentrar as células.
   NOTA: Não use luz de epifluorescência para localizar e concentrar células. Mesmo com baixa potência, isso afetará negativamente as células.
8. Grave imagens com diferentes formatos de pixels. Com base nessas imagens, selecione o menor número de pixels que dá uma resolução aceitável da estrutura de interesse.
   NOTA: Normalmente, 512 x 512 pixels funcionam bem para imagens unicelulares com objetivos de 20x e 40x, e 1024 x 1024 ou 2048 x2048 pixels normalmente funcionam bem para imagens de mitoconddrion único com um objetivo de 63x.
9. Grave imagens com diferentes tamanhos de pinhole. Com base nessas imagens, selecione o maior tamanho do pinhole que dá uma resolução aceitável da estrutura de interesse.
   NOTA: Normalmente, 3-7 unidades arejadas funcionam bem.
10. Grave imagens com diferentes intensidades de laser.
    1. Ajuste o ganho do detector e o limiar em conformidade. Com base nessas imagens, selecione a menor intensidade de laser que dá intensidade de sinal aceitável e relação sinal-fundo.
       1. Para determinar a relação sinal-fundo, meça a intensidade do sinal em uma região de interesse (ROI) que contenha células ou mitocôndrias (ROI1) e em um ROI sem células ou mitocôndrias (ROI2). Em seguida, divida a intensidade do ROI1 pela intensidade do ROI2.
          NOTA: Aponte para uma relação sinal-fundo de >3 e intensidades de sinal de ROIs individuais de 200-1.000 para excitação de 405 nm com 1-3% de potência laser e intensidades de ROIs individuais de 300-1.500 para excitação de 488 nm com 1% de potência laser.
11. Registo imagens com diferentes velocidades de varredura e número de médias de quadros. Grave 4-5 imagens para cada combinação de configurações. Com base nessas séries de imagens, selecione as configurações médias mais altas e mais baixas que dão ruído de imagem aceitável e variabilidade imagem-a-imagem.
    NOTA: Uma velocidade de varredura de 600 Hz e 1-2 quadros para o trabalho médio na maioria dos casos.
12. Usando um novo coverlip, registo de tempo com as configurações otimizadas.
    NOTA: O intervalo de duração e imagem da série deve se assemelhar aos dos experimentos planejados.
13. No final da série time-lapse, adicione 1 mL de solução 2x DA à câmara de gravação. Imagem para mais 2 min.
14. Aspire o tampão de imagem usando uma bomba peristáltica ou pipeta portátil. Adicione 1 mL de solução DTT 1x. Imagem para adicional de 5 min.
15. Analise o experimento time-lapse (ver seção 5).
    1. Verifique se nenhum dos dois canais fica exposto demais ou sub-exposto durante o tratamento de DA e DTT com as configurações otimizadas.
    2. Certifique-se de que nenhum dos dois canais mostra branqueamento considerável durante a gravação de lapso de tempo; visam <2% de perda de intensidade entre a primeira e a última imagem.
    3. Verifique se a razão 405:488 não muda consideravelmente durante a imagem.
16. Repita todo o procedimento de forma iterativa, utilizando várias tampas, até que sejam definidas configurações que forneçam resultados aceitáveis consistentemente.

4. Avaliação do estado basal do redox

1. Inicie o microscópio e carregue as configurações otimizadas da seção 3.
2. Definir a média do quadro para 3-5.
3. Monte uma mancha de cobertura com células na câmara de imagem, adicione 1 mL de tampão de imagem e coloque a câmara no microscópio.
4. Use a ocular e a luz transmitida para concentrar as células.
   NOTA: Não use luz de epifluorescência para localizar e concentrar células. Mesmo com baixa potência, isso afetará negativamente as células.
5. Mude para o modo de digitalização e use o canal de 488 nm em exibição ao vivo para focar e localizar células para imagens.
6. Use a função de vários pontos para selecionar 3-5 campos de exibição no deslizamento de cobertura.
7. Grave uma imagem de linha de base.
8. Adicione 1 mL de solução 2x DA à câmara.
9. Depois de 1, 2 e 3 min, use a visualização ao vivo para confirmar/ajustar o foco e, em seguida, gravar uma imagem.
   NOTA: As células são tipicamente totalmente oxidadas após 2 minutos.
10. Substitua o tampão na câmara de imagem por 1 mL de solução DTT 1x.
11. Depois de 3 e 5 minutos, use a visualização ao vivo para confirmar/ajustar o foco e, em seguida, gravar uma imagem.
    NOTA: As células são tipicamente totalmente reduzidas após 4-5 min.

5. Imagem ao vivo de tratamentos agudos

NOTA: O protocolo abaixo descreve a imagem da resposta mitocondrial redox ao tratamento NMDA. Os intervalos de imagem e a duração do experimento podem precisar ser ajustados para outros tratamentos.

1. Inicie o microscópio e carregue as configurações otimizadas da seção 3.
2. Defina o intervalo de lapso de tempo para 30 s e a duração para 25 min.
3. Monte uma mancha de cobertura com células na câmara de imagem, adicione 1 mL de tampão de imagem e coloque a câmara no microscópio.
   NOTA: Para evitar a deriva do foco térmico, deixe as células no estágio do microscópio por 10-15 minutos antes de iniciar a imagem de lapso de tempo.
4. Use a ocular e a luz transmitida para concentrar as células.
   NOTA: Não use luz de epifluorescência para localizar e concentrar células. Mesmo com baixa potência, isso afetará negativamente as células.
5. Mude para o modo de digitalização e use o canal de 488 nm em exibição ao vivo para focar e localizar células para imagens.
6. Opcional: Para aumentar o número de células gravadas por execução, use a função de vários pontos para exibir 2-3 campos de visualização por deslizamento de cobertura.
7. Inicie a aquisição do lapso de tempo e grave 5 imagens como gravação de 2 min da linha de base.
8. Adicione 500 μL de solução NMDA 3x à câmara (concentração final de 30 μM) e grave 20 imagens adicionais como uma resposta NMDA de 10 minutos.
   NOTA: Os neurônios são muito sensíveis a alterações na osmolaridade. Portanto, certifique-se de minimizar a evaporação do tampão de imagem. Para tratamentos mais longos, a câmara de imagem deve ser coberta com uma tampa.
9. Adicione 500 μL de solução 4x DA à câmara e grave mais 6 imagens (calibração máxima de 3 min).
10. Aspire o buffer da câmara de imagem e substitua-o por 1 mL de solução DTT 1x. Registo mais 10 imagens (calibração mínima de 5 min).
11. Termine a gravação e salve a série de imagens.

6. Análise de dados

1. Importação de dados e pré-processamento de imagens em FIJI
   1. Use o Bio-Formats Importer para abrir um grupo de imagens da etapa 4 ou um arquivo de imagem a partir da etapa 5. Clique em Plugins | Bioformiagens | Importador de Bioformiagens. Na caixa de diálogo, use a pilha de exibição com: Hyperstack, defina o modo de cor: padrão, selecione Autoescala e não se divida em janelas separadas.
      NOTA: A escala automática otimiza a exibição dos dados na tela do computador. Não muda a intensidade dos pixels.
   2. Se as imagens individuais do passo 4 forem abertas, clique em Imagem | Pilhas | Ferramentas | Concatenar para mesclá-los em uma pilha de imagem única.
   3. Se houver xy-drift durante a série de imagens, clique em Plugins | StackReg para registrar as imagens. Na caixa de diálogo, selecione Corpo Rígido ou Tradução.
   4. Altere o formato da imagem para 32 bits clicando em Imagem | Tipo | 32 bits.
   5. Divida os canais de cores em janelas separadas clicando em Imagem | | de cor Canais divididos.
   6. Selecione o canal 1 (405 nm) e ajuste o limiar para selecionar as mitocôndrias para análise clicando em Imagem | Ajuste | O limiar. Na caixa de diálogo, selecione Padrão, Fundo Vermelho, Escuro e Empilhar histograma e aguarde que os pixels selecionados apareçam vermelhos. Clique em Aplicar. Selecione Definir Pixels de fundo para NaN e Processar todas as imagens.
      NOTA: Para evitar viés potencial de observador, deve-se usar a determinação automatizada do limiar. O FIJI oferece vários métodos automatizados (como Default, Huang, Intermodes, Otsu) que podem ser selecionados a partir de um menu suspenso na caixa de diálogo limiar. Normalmente, o método Padrão dá um bom resultado. Recomenda-se comparar vários métodos durante a primeira análise para encontrar o melhor método de limiar para o determinado conjunto de imagens. Uma vez que um método tenha sido escolhido, ele precisa ser aplicado a todas as imagens.
   7. Repita a etapa 6.1.6 para o canal 2 (488 nm).
   8. Crie uma imagem de proporção para visualizar a proporção de 405.488 nm clicando em Process | Calculadora de imagens. Na caixa de diálogo, selecione Imagem 1: canal 1, Operação: Dividir, Imagem 2: canal 2, Criar nova janela, Processar todas as imagens.
   9. Altere a tabela de procuração da imagem de proporção para pseudocolorida. Por exemplo, para alterar para Fogo, clique em Imagem | Tabelas de procura | Fogo, fogo.
2. Análise de imagem
   1. Na imagem de proporção, desenhe ROIs em torno de células individuais ou mitocôndrias. Depois de desenhar cada ROI, adicione-o ao GERENCIADOr de ROI. Analise | Ferramentas | Gerente de ROI | Adicione. (atalho do teclado: 'T') Selecione Mostrar tudo.
      NOTA: Como os pixels de fundo foram definidos como 'não um número' (NaN) nas etapas 6.1.6 e 6.1.7, eles não afetarão o resultado da medição. Portanto, é aceitável incluir alguns pixels de fundo no ROI.
   2. Meça as proporções de 405:488 de células individuais clicando no GERENCIADOr de ROI | ctrl+A para selecionar todos os ROIs | Mais | Multi Medida. Na caixa de diálogo, selecione Medir todas as fatias e uma linha por fatia.
   3. Exporte as medidas para o software de planilha.
   4. Selecione a imagem de 405 nm. Meça a intensidade de todos os ROIs como na etapa 6.2.2. usando os ROIs que são armazenados no gerenciador de ROI.
   5. Exporte as medidas para o software de planilha.
   6. Selecione a imagem de 488 nm. Medir intensidades de todos os ROIs como na etapa 6.2.2. usando os ROIs que são armazenados no gerenciador de ROI.
   7. Exporte as medidas para o software de planilha.
   8. Salve ROIs para referência futura clicando no GERENCIADOr de ROI | ctrl+A para selecionar todos os ROIs | Mais | Salve.
   9. Recomendado: Gerar intensidade versus tempo de parcelas dos traços de 405 e 488 nm. Verifique se não há branqueamento marcado em nenhum dos canais (a intensidade do sinal no final da série de imagens deve ser ≥98% da primeira imagem) e que os dois traços se movem em direções opostas durante as respostas dos sensores (por exemplo, o traço de 405 nm deve aumentar durante a oxidação enquanto o traço de 488 nm deve diminuir).
3. Normalização de dados
   1. Para cada ROI da imagem da razão, determine o valor máximo durante o tratamento da DA (_Rmax) e o valor mínimo durante o tratamento DTT (_Rmin).
   2. Calcule a razão normalizada da seguinte forma:
      
      NOTA: Isso definirá a razão máxima para 1,0 e a razão mínima para 0.
4. Análise da morfologia mitocondrial
   1. Para obter medidas de morfologia mitocondrial em paralelo às intensidades roGFP na etapa 6.2.6, vá para Analisar | Defina medidas e verifique descritores de forma e elipse de ajuste.
      NOTA: Além da intensidade média, as medidas na janela de resultados incluirão o comprimento do eixo principal (Major), o comprimento do eixo menor (Menor), a proporção (AR; eixo principal dividido por eixo menor; mitocôndrias redondas têm um AR ~1, mitocôndrias alongadas têm ar maior), bem como medidas de circularidade (Circ.) e arredondamento (Round).

Quantificação das diferenças no estado vermelho mitocondrial de estado estável após a retirada do fator de crescimento
Para demonstrar a quantificação das diferenças de estado estável no estado redox mitocondrial, os neurônios primários cultivados no meio padrão foram comparados aos neurônios cultivados sem fatores de crescimento por 48 horas antes da imagem. A retirada do fator de crescimento resulta em morte celular neuronal apoptóltica após 72 h16. As células foram imagens após 48 h para testar se isso é precedido por alterações no estado de redox mitocondrial. Os neurônios cortical primários cultivados em tampas revestidas de poli-L-ornithine foram infectados com rAAV-mito-Grx1-roGFP2 em dias in vitro 6 (DIV6) e foram retratados em DIV12. A imagem ao vivo foi realizada à temperatura ambiente de acordo com a seção 4 deste protocolo em um microscópio confocal de varredura a laser invertido equipado com um objetivo de imersão de água 40x/1.10. As configurações confocal foram pinhole 7 unidades arejadas, tamanho de pixel 568,7 nm (512 x 512 pixels), velocidade de varredura 600 Hz, potência laser 405 nm 3%, potência laser 488 nm 1%, largura de banda de emissão 505-550 nm e moldura média 4. Não houve grande diferença entre as relações brutas de 405:488 nm das duas condições (Figura 3B). Após a normalização dos dados, detectou-se um subconjunto de células com proporção aumentada de 405.488 nm no grupo de retirada do fator de crescimento (Figura 3C). Isso indica que as alterações mitocondriais de redox podem preceder a morte celular neuronal, e ressalta a relevância da normalização dos dados max/min para a comparação dos estados basais redox entre os grupos.

Mudanças dinâmicas no estado de redox mitocondrial após o tratamento de neurônios com NMDA
O receptor de glutamato do tipo NMDA (NMDAR) desempenha um papel central na plasticidade neuronal, mas também pode mediar danos neuronais e morte celular. A ativação patológica do NMDAR leva a vários efeitos adversos nas mitocôndrias que incluem sobrecarga de cálcio matricial, oxidação e fragmentação mitocondrial, e transição de permeabilidade mitocondrial. Em um estudo anterior, o protocolo acima descrito foi usado para investigar uma relação causal entre a sobrecarga de cálcio mitocondrial induzida pelo NMDA e a oxidação mitocondrial13. Os neurônios hipocampais primários cultivados em tampas revestidas de poli-D-lysina/laminina foram infectados com rAAV-mito-Grx1-roGFP2 em DIV4 e retratados em DIV12. A imagem ao vivo foi realizada a 37 °C em um microscópio confocal de disco giratório invertido equipado com um objetivo de imersão multi de 20x/0,75 (imersão na água foi usada) e um sistema de incubação no palco. Mito-Grx1-roGFP2 foi sequencialmente animado a cada 20 s usando as linhas laser de 405 nm e 488 nm, e a emissão foi coletada com um filtro de emissão de 527/55 nm para ambos os comprimentos de onda de excitação. O tratamento de neurônios com 30 μM NMDA causou oxidação de mitocôndrias em poucos minutos (Figura 4A,B). Notavelmente, a acidose mitocondrial induzida pelo NMDA causou uma saciação significativa da fluorescência roGFP2, em consonância com sua conhecida sensibilidade pH8. Para confirmar que essa saciedade dependente de pH não afetou a razão 405:4889, as mitocôndrias foram totalmente oxidadas pela PROMOTORIA antes da adição de NMDA em um experimento de controle. O tratamento com DA impede qualquer oxidação adicional de mitocôndrias pelo NMDA e, consequentemente, a razão 405:488 não mudou neste experimento, apesar de uma considerável extinção da intensidade de fluorescência roGFP2 (Figura 4C).

Análise multiparamétrica de alterações induzidas pelo NMDA de mitocôndrias dendríticas
Para avaliar a sequência temporal de alterações induzidas pelo NMDA na morfologia mitocondrial, potencial de membrana e estado de redox, foram realizadas imagens paralelas da fluorescência TMRE e mito-Grx1-roGFP2 em alta resolução espacial e temporal. Os neurônios cortical primários de ratos cultivados em tampas revestidas de poli-L-ornithine foram infectados com rAAV-mito-Grx1-roGFP2 em DIV6 e imagens em DIV12. A imagem ao vivo foi realizada à temperatura ambiente em um microscópio de varredura a laser confocal invertido usando um objetivo de imersão de óleo 63x/1,40, uma velocidade de varredura de 600 Hz, um tamanho de pixel de 90,2 nm (1024 x 1024 pixels em zoom de varredura 2x), um tamanho de pinhole de 3 unidades arejadas e uma média de quadro de 2. A cada 30 s, três imagens foram registradas no modo sequencial: 405 nm excitação/505-550 nm de emissão; 488 nm excitação/505-550 nm emissão; 552 nm excitação/560-600 nm emissão. O tratamento de neurônios com NMDA de 60 μM resultou em perda de sinal TMRE e aumento na relação roGFP de 405:488 nm, seguido por algum arredondamento atrasado das mitocôndrias (Figura 5).

Figura 1: Representação esquemática da função Grx1-roGFP2 e espectro de excitação roGFP2. (A) Estresse oxidativo e a ação de sistemas antioxidantes de defesa oxidam a piscina de glutationa celular. Grx1 na proteína de fusão Grx1-roGPF2 promove o rápido equilíbrio do estado de redox roGFP2 com o estado de redox da piscina de glutationa. O estado redox da piscina roGFP2 pode ser avaliado monitorando a razão de emissão de gfp-fluorescência em 510 nm após excitação em 405 nm e 488 nm. As espécies reduzidas são mostradas em azul; espécies oxidadas são mostradas em vermelho. (B) Espectros de excitação de roGFP2 totalmente reduzido (azul) e oxidado (vermelho). Após a oxidação do roGFP2, a emissão de fluorescência a 400 nm de excitação aumenta, enquanto a emissão a 490 nm de excitação diminui. Este valor foi modificado de uma publicação anterior13. Os espectros de excitação em B foram desenhados com base na Figura 1B a partir de 8. Linhas pontilhadas em B indicam os comprimentos de onda de linhas laser de 405 nm e 488 nm comumente utilizadas. Abreviaturas: GSH = glutationa; GSSG = glutationa oxidada; Grx = glutaredoxina; roGFP = variante de proteína fluorescente verde sensível ao redox. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Fluxo de trabalho do método. A expressão da proteína fluorescente flutivatométrica da proporção de excitação roGFP2 nos neurônios pode ser alcançada através de vários métodos que incluem transfecção, lipofecção, transferência de genes virais e animais transgênicos. O sensor pode ser usado para estudar o estado de redox neuronal em neurônios primários cultivados, explantas de tecido ex vivo e animais intactos. A imagem roGFP2 pode ser realizada em uma variedade de microscópios que incluem microscópios fluorescentes widefield, microscópios confocal e microscópios de 2 fótons. A análise dos dados de imagem roGFP2 pode ser realizada com o software livremente disponível ImageJ/FIJI. Abreviação: roGFP = variante de proteína fluorescente verde sensível ao redox. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: A retirada do fator de crescimento causa oxidação de mitocôndrias neuronais. (A) Representativo 405:488 nm proporção de neurônios cultivados na presença (+ GF) ou ausência (- GF) de fatores de crescimento por 48 horas antes da imagem. As escalas codificadas por cores representam proporções não normalizadas de 405.488 nm (as razões mais baixas correspondem a um estado reduzido; maiores proporções correspondem a um estado oxidado). Barras de escala = 50 μm. (B) Quantificação da razão de 405:488 nm em neurônios individuais. (C) Max/min calibrado proporção de 405.488 nm de neurônios individuais. Símbolos redondos representam células únicas; bar representa média. N = 40-44 células de 3 tampas de uma preparação. Abreviação: GF = fator de crescimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Oxidação induzida pelo NMDA de mitocôndrias neuronais. (A) Representante 405:488 nm imagens de razão antes e depois do tratamento com 30 μM NMDA e após calibração max/min com DA e DTT. Nesta ampliação, o sinal roGFP é detectado principalmente nos dendritos soma e proximal. A escala codificada por cores representa proporções não normalizadas de 405.488 nm (as razões mais baixas correspondem a um estado reduzido; maiores proporções correspondem a um estado oxidado). Barras de escala = 50 μm. (B) Quantificação da execução de imagem mostrada em A. O NMDA induz uma oxidação mitocondrial rápida e sustentada que pode ser calibrada usando DA e DTT. (C) A acidose mitocondrial induzida pelo NMDA causa uma queda da fluorescência GFP tanto na excitação de 405 nm quanto em 488 nm (painel superior). Para isolar o efeito orientado ao pH e confirmar que a razão de 405.488 nm é insensível ao pH, os neurônios foram primeiro maximamente oxidados usando DA e posteriormente desafiados com NMDA na presença de DA (painel inferior). Nessas condições, o NMDA ainda causa acidose mitocondrial, mas não há mais oxidação mitocondrial. Assim, embora tanto o traço de 405 nm quanto 488 nm mostrem uma queda impulsionada por pH na intensidade da fluorescência, a razão de 405.488 nm permanece estável. Este número é modificado a partir de 13. Abreviaturas: GFP = proteína fluorescente verde; roGFP = variante de proteína fluorescente verde sensível ao redox; NMDA = N-metil-D-aspartato; DA = diamida; DTT = dithiothreitol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Alterações induzidas pelo NMDA no potencial da membrana, estado de redox e morfologia das mitocôndrias dendríticas. (A) Três imagens de alta ampliação de um experimento de lapso de tempo, adquiridas em t = 1, 4 e 9 min, mostrando mitocôndrias dendríticas e axoriais. A colorização representa a intensidade do TMRE (ver barra de calibração). (B) 405:488 nm roGFP ratio imagens do mesmo experimento de lapso de tempo que em (A) em t = 1, 4 e 9 min. Observe que, devido à eficiência limitada da infecção por AAV, apenas um subconjunto de neurônios expressa mito-Grx1-roGFP2 e, portanto, nem todas as mitocôndrias TMRE positivas são roGFP-positive. A barra de calibração codificada por cores representa proporções não normalizadas de 405.488 nm (as razões mais baixas correspondem a um estado reduzido; maiores proporções correspondem a um estado oxidado). (C) Quantificação da intensidade TMRE, proporção roGFP 405:488 nm e arredondamento de uma única mitocôndria (indicada por setas em A, B). Após 1 min de gravação da linha de base, 60 μM NMDA foi adicionado à solução de banho. Barras de escala = 5 μm. O eixo y em C retrata a razão de 405:488 nm roGFP relativa à linha de base T0 (linha tracejada verde), a intensidade de fluorescência TMRE em relação à linha de base T0 (linha pontilhada vermelha) e o descritor de forma FIJI/ImageJ "roundness" (linha sólida preta). Abreviaturas: GFP = roGFP = variante de proteína fluorescente verde sensível ao redox; mito-Grx1-roGFP2 = Glutaredoxin-1 fundido ao N-terminus de roGFP; AAV = vírus associado ao adeno; TMRE = tetrametilrhodamina, éster etílico; NMDA = N-metil-D-aspartato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram que não têm conflito de interesses.