Artigo de método

Ex Vivo Interrogação Optogenética da Transmissão Sináptica de Longo Alcance e Plasticidade do Córtex Pré-frontal Medial para o Córtex Entorrinal Lateral

DOI:

10.3791/63077

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25 de fevereiro de 2022

 , 
1School of Physiology, Pharmacology and Neuroscience, University of Bristol

Neste artigo

Resumo

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Aqui apresentamos um protocolo descrevendo a transdução viral de regiões cerebrais discretas com construtos optogenéticos para permitir a caracterização eletrofisiológica específica da sinapse em cortes cerebrais agudos de roedores.

Resumo

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Estudar as propriedades fisiológicas de sinapses específicas no cérebro, e como elas sofrem mudanças plásticas, é um desafio fundamental na neurociência moderna. As técnicas eletrofisiológicas tradicionais in vitro usam estimulação elétrica para evocar a transmissão sináptica. Uma grande desvantagem deste método é a sua natureza inespecífica; todos os axônios na região do eletrodo estimulante serão ativados, dificultando a atribuição de um efeito a uma conexão aferente particular. Este problema pode ser superado substituindo a estimulação elétrica pela estimulação baseada em optogenética. Descrevemos um método para combinar optogenética com registros in vitro patch-praçad. Esta é uma ferramenta poderosa para o estudo da transmissão sináptica basal e da plasticidade sináptica de conexões sinápticas anatomicamente definidas precisas e é aplicável a quase qualquer via no cérebro. Aqui, descrevemos a preparação e o manuseio de um vetor viral que codifica a proteína da canalrodopsina para injeção cirúrgica em uma região pré-sináptica de interesse (córtex pré-frontal medial) no cérebro do roedor e na confecção de fatias agudas de regiões-alvo a jusante (córtex entorrinal lateral). Um procedimento detalhado para combinar registros patch-clamp com ativação sináptica por estimulação luminosa para estudar a plasticidade sináptica de curto e longo prazo também é apresentado. Discutimos exemplos de experimentos que alcançam a especificidade da via e da célula combinando optogenética e marcação celular dependente de Cre. Finalmente, a confirmação histológica da região pré-sináptica de interesse é descrita juntamente com a marcação de biocitina da célula pós-sináptica, para permitir uma identificação mais aprofundada da localização precisa e do tipo de célula.

Introdução

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Entender a fisiologia das sinapses e como elas sofrem alterações plásticas é fundamental para entender como as redes cerebrais funcionam no cérebro saudável1 e como elas funcionam mal em distúrbios cerebrais. O uso de fatias cerebrais ex vivo agudas permite o registro da atividade elétrica das sinapses de neurônios individuais com uma alta relação sinal-ruído usando gravações de patch clamp de células inteiras. O controle do potencial de membrana e a manipulação farmacológica direta permitem o isolamento dos subtipos de receptores. Esses registros podem ser feitos com requintada especificidade para identificar o neurônio pós-sináptico,....

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Protocolo

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Todos os procedimentos em animais foram conduzidos de acordo com a Lei de Procedimentos Científicos de Animais do Reino Unido (1986) e diretrizes associadas, bem como diretrizes institucionais locais.

1. Injeção viral estereotáxica

NOTA: O protocolo atual requer especificidade anatômica, mas não do tipo de célula pós-sináptica.

  1. Escolha o animal apropriado. Ratos machos do tipo selvagem Lister com capuz foram utilizados neste protocolo (300-350 g, aproximadamente 3 meses de idade).
  2. Escolha a construção viral apropriada. Há vários fatores a serem considerados (consulte D....

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Resultados

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Neste protocolo, descrevemos como estudar a fisiologia sináptica de longo alcance e a plasticidade usando a entrega viral de construtos optogenéticos. O protocolo pode ser muito facilmente adaptado para estudar quase qualquer conexão de longo alcance no cérebro. Como exemplo, descrevemos a injeção de AAVs codificando uma opsina em mPFC de ratos, a preparação de fatias agudas de LEC, registros de patch-clamp de neurônios piramidais LEC de camada 5 e ativação evocada por luz de terminais mPFC em LEC (F.......

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Discussão

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O protocolo aqui apresentado descreve um método para explorar projeções sinápticas de longo alcance altamente específicas usando uma combinação de cirurgia estereotáxica para fornecer AAVs codificando construções optogenéticas e eletrofisiologia em cortes cerebrais agudos (Figura 1). Juntas, essas técnicas oferecem ferramentas para caracterizar a fisiologia e a plasticidade dos circuitos cerebrais com alta precisão em vias de longo alcance e anatomicamente difusas que antes eram inacessíveis.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Este trabalho é apoiado pela Wellcome grant 206401/Z/17/Z. Gostaríamos de agradecer a Zafar Bashir por sua orientação especializada e ao Dr. Clair Booth pela assistência técnica e comentários sobre o manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de 0,2 mLFisher Scientific Ltd12134102
10 µ Pipeta LGilsonFD10001
placa de 24 poçosSARSTEDT83.3922
Válvula luer de 3 viasCole-ParmerWZ-30600-02
substrato de 3,3′-Diaminobenzidina (DAB)Vector LaboratoriesSK-4105
40x objetivaOlympusLUMPLFLN40XW
4-aminopiridinaHello BioHB1073
4x objetivaOlympusPLN4X/0.1
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherryAddgene35512Título viral: 3.3x1013
Lente acromáticaEdmund Optics49363Focaliza o espectro visual e o infravermelho próximo
Microcentrífuga de bancadaBenchmark ScientificC1005*
BiocytinSigma-AldrichB4261
Capilar de vidro borosillicadoWarner InstrumentsG150F-6
BurrFerramentas de ciência fina19008-07
CaCl2Sigma-AldrichC5670
Câmera - Qimaging Retiga ElectroPhotometrics01-ELECTRO-M-14-C
CarbacholTocris2810
Esfoliante cirúrgico de clorexidinaVetaseptXHG008
ClippersAndis22445AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper
Lente condensadora de colimaçãoThorLabsACL2520-A
CoverslipsFisher Scientific Ltd10011913
CryostatLeicaCM3050 S
CsMeSO4Sigma-AldrichC1426
Cola de cianoacrilatoRapid Electronics Ltd84-4557
Dispositivo de aquisição de dadosNational InstrumentsUSB-6341 BNC
D-glicoseSigma-AldrichG8270
Espelho dicróico 500 nm long-passEdmund Optics69899
Espelho dicróico 600 nm passa-longoEdmund Optics69901
Cubo de espelho dicróicoThorLabsCM1-DCH/M
EGTAMillpore324626
Suporte de eletrodo com porta lateralHEKA895150
Filtro de emissãoChroma59022m
Filtro de excitaçãoChromaET570/20x
Gel para os olhosDechraLubrithal
Pincel finoSuprimentos de laboratório científicoBRU2052
guilhotinaWorld Precision InstrumentsDCAP
HEPESSigma-AldrichH3375
Solução de peróxido de hidrogênioSigma-AldrichH100930% (p / p)
IsofluranoHenry Schein988-3245
IsopentaneSigma-AldrichM32631
KClSigma-AldrichP3911
k-gluconatoSigma-AldrichG4500
Cubo de filtro de fluorescência cinemáticaThorLabsDFM1T1
driver de LEDThorLabsLEDD1B
Pomada de lidocaínaTeva80007150
MgATPSigma-AldrichA9187
MgClSigma-AldrichM2670
MgSO4Sigma-AldrichM7506
Micro brocaHarvard Apparatus75-1887
Instrumentos Sutterextrator de microeletrodosP-87
Seringa de microinjeçãoHamilton7634-01/00
Seringa de microinjeção agulhaHamilton7803-05Especificação personalizada: calibre 33, comprimento 15mm, estilo de ponta 4 - 12°
Bomba de seringa de microinjeçãoWorld Precision InstrumentsUMP3T-1
LED azul montadoThorLabsM470L5
LED verde montadoThorLabsM565L3
Na2HPO4.7H2OSigma-AldrichS9390
NaClSigma-AldrichS9888
NaGTPSigma-AldrichG8877
NaH2PO4Sigma-AldrichS0751
NaH2PO4.H2OSigma-AldrichS9638
NaHCO3Sigma-AldrichS5761
NIR LEDOSRAMSFH4550Usado para imagens IR refratadas de fatias, a óptica de contraste de interferência diferencial (DIC) é outro método comumente usado
OCT meioVWR InternationalRAYLLAMB/OCTMeio de temperatura de corte ideal
ParaformaldeídoSigma-Aldrich158127
ParaformaldeídoSigma-AldrichP6148
Amplificador de grampo de patchMolecular Devices700A
de microscópio revestidas com poli-L-lisina23-769-310
Câmara de gravaçãoWarner InstrumentsRC-26G
Lâmina de bisturiSwann Morton#24
Quadro estereotáxicoKopfModelo 902
Suporte estereotáxico para micro brocaHarvard Apparatus75-1874
SucroseSigma-AldrichS0389
Microscópio CirúrgicoCarl ZeissOPMI 1 FR pro
SuturaEthiconW577H
Filtro de seringa para gravação intracelular soluçãoThermo Scientific Nalgene171-0020
Citrato de tetrodotoxinaOlá BioHB1035
Pipetas de transferênciaFisher Scientific Ltd10458842
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Microscópio de fluorescência verticalLeicaDM6 B
VECTASHIELD Meio de montagem antidesvanecimento com DAPIVector LaboratoriesH-1200-10
Kit VECTASTAIN ABC-HRP VectorLaboratoriesPK-4000
VibratomeCampden Instruments7000smz-2
WinLTPhttps://www.winltp.com/Versão 2.32Software de aquisição de dados
Solution
aCSF
de corte de sacarose
PFA
Intracelular?
Lâminas Ministar da World Precision Instruments Fisher Scientific Ltd Âncora de fatia Warner Instruments SHD-26-GH/15 solução

Referências

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  1. Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
  2. Poorthuis, R. B., et al. Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nico....

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